專利名稱：一次性電化學芯片的制作方法
技術領域：
本實用新型一次性電化學芯片，屬于第二代生物芯片，可以用新型納米材料及生物學分子進行修飾，并可與多通道恒電位儀相連接和測試。在每張電化學芯片上都含有16 個獨立分析微孔，電化學芯片集成度高，易于批量生產，性質穩定，非常適合在醫院檢驗科應用。利用此芯片可以直接對臨床尿路常見感染病原菌進行鑒定及藥敏分析，而不用對病原菌進行培養或基因擴增，臨床標本檢測量小(3-50 μ L)，準確度高，特異性強，診斷時間短。
背景技術：
尿路感染病原菌檢測金標準通過常規細菌培養及藥敏實驗進行檢測，其不足之處是至少需要2-3天的時間才能從臨床標本中分離培養出致病菌株以及完成相關藥敏測試，而且一些生長緩慢和不易培養的尿路病原菌是無法通過常規藥敏試驗方法進行檢測， 在缺乏快速微生物診斷的情況下，臨床醫生很可能就會憑經驗主義來進行抗生素用藥，延誤了對病人治療的最佳時機。以聚合酶鏈式反應(PCR)為基礎的實時熒光定量PCR技術可以從分子生物學水平檢測細菌[1_2]。該方法可以直接從臨床標本入手，而無須菌株的培養，整個實驗過程需要4-6 小時。但是，常規分子生物學方法對每一個測試的抗菌藥物，均需要設計相應的分子檢測方法，一次只能分析一種細菌ω。基因芯片技術自問世以來[4]，以其基于核酸雜交的檢測高度特異性，檢測時的高通量以及平行分析的特點[5_8]，1998年被美國科學促進會評為當年十大科技進展之一 [9]，并為臨床細菌檢測提供了高效、高度特異的診斷技術，也為醫學診斷及治療技術進步做出杰出的貢獻，解決傳統基因診斷技術所不能解決的系列難題[1°_11]。但是傳統的基因芯片技術，無論是微陣列，還是原位合成的寡核苷酸基因芯片，均使用熒光標記探針技術[12_13]，應用時需要昂貴的激光掃描設備[14]，此外，傳統技術不能完全消除細菌檢測時的陰性信號，陰陽性信噪比對比低，存在人為判斷其陰陽性結果.這些因素嚴重制約了基因芯片技術在臨床細菌檢測及藥敏分析中的廣泛應用。參考文獻l.ffolff BJ, Thacker WL, Schwartz SB, Winchell JM. Detection of macroIide resistance in Mycoplasma pneumoniae by real-time PCR and high-resolution melt analysis. Antimicrob Agents Ch,2008,52(10) :3542-3549.2. Monleau M, Montavon C, Laurent C, Segondy M, Montes B, Delaporte E, Boilloit F, Peeters M. Evalua-tion of different RNA extraction methods and storage conditions of dried plasma or blood spots for human immunodeficiency virus type 1 RNA quantification and PCR amplification for drug resistance testing. J Clin Microbiol,2009,47(4) :1107-1118.3. Hindiyeh M, Ram D, Mandelboim M, TMeningher T, Hirsh S, Robinov J, LevyV, Orzitzer S, Azar R, Grossman Ζ, Mendelson Ε. Rapid detection ofinfluenza A pandemic (HlNl)2009virus neuraminidase resistance mutation H275Y by real-time RT-PCR. JClin Microbiol,2010,48(5) :1884-1887.4.Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT, Solas D.Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 1991,251:767-7735.Pellois JP, Zhou X, Srivannavit 0, Zhou T, Gulari E, Gao X.Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotechnol 2002,20: 922-92266. Schena M, Shalon D, Heller R, Chai A, Brown PO, Davis Rff. Parallelhuman genome analysis :microarray-based expression monitoring of 1000 genes. Proc Natl Acad Sci USA 1996,93 :10614-106197. Lockhar t DJ, Winzeler EA.Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature, 2000,405 :827-8368. Xiao Y, Segal MR, Yang YH, Yeh RF. A multi-array multi-SNP genotyping algorithm for Affymetrix SNP microarrays. Bioinformatics, 2007, 23 :1459-14679.Breakthrough of the year. The runners-up. Science, 1998, 282 :2157-216110. Gerhold DL, Jensen RV, Gul Ians SR. Bet ter therapeutics through microarrays. Nat Genet,2002, 32 :547-55111.Ragoussis J, Elvidge G.Affymetrix GeneChip system:moving from research to the clinic.Expert Rev Mol Diagn, 2006,6 :145-15212. Shomaker TS, Ward K. Microarray technology inbiomedical research. Hawaii Med，2006，65 :253-25613. Duyk GM. Sharper tools and simpler methods. Nat Genet,2002,32 Suppl 465-46814. Schena M, Shalon D, Davis Rff, Brown P0. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science,1995,270 467-470
發明內容為了克服目前臨床尿路病原菌檢測及藥敏分析耗時長，操作繁瑣，檢測量低及檢測成本高的問題，本實用新型提供了一種一次性電化學芯片。本實用新型解決以上問題所采用的技術方案是(1)在玻璃板上一次性加工上16個微反應孔，每個微孔包括由金納米導電材料構成的三個微電極工作電極，輔助電極，參比電極。(2)在每個工作電極表面構建烷化巰基自組裝分子層，然后再用NHS和EDC對自組裝層功能化，并將生物素和親和素修飾到工作電極上。注工作電極上還可以修飾NH2、C00H、生物素、親和素、辣根過氧化物酶、抗體。(3)利用生物信息學技術，制作和尿路病原菌16SrRNA特異性保守序列相互補的一抗標記的檢測探針與親和素化的捕獲探針，并將親和化的捕獲探針修飾到工作電極表
4面。注16S rRNA為所有細菌所共有，其編碼基因兼保守性和變異性于一身，素有細菌的“分子化石”之稱。16SrRNA基因的保守性又是相對的，在保守區之間存在著9個或10個變異區(VI V10)，不同科、屬、種間都有不同程度的差異，利用Vl-VlO間的變異進行種屬特異性探針設計。探針為寡核苷酸探針或肽核酸(PNA)探針。(4)臨床標本處理將尿液離心五分鐘，然后再加入NaOH、TritonX-100、EDTA、溶解酵素、TRIS-HCL，在室溫下孵育5分鐘，將檢測探針混合液加入到細菌裂解液中孵育和細菌靶16SrRNA特異性保守序列充分雜交，將4 μ L混合液加入到芯片微孔中，等充分孵育，再加入 HRP 和 TMB-H2O2。(5)芯片檢測利用特制的電化學芯片讀數器和多通道恒電位儀相連接，將芯片上的反應信號，以可讀的電信號輸出，從而確定細菌種類及進一步藥敏分析。該一次性電化學芯片不僅能對臨床尿路常見病原菌進行快速檢測(45分鐘)和快速藥敏分析(3. 5小時)，而且和目前常用多通道恒電位儀可以相結合，大大降低了檢測成本。
圖1是本新型電化學芯片立體圖。圖2是本電化學芯片的相應讀數器立體簡圖。圖3是讀數器對電化學芯片進行讀數簡圖。在圖中⑴電化學芯片玻璃底板，(2)輔助電極，(3)工作電極，⑷參比電極，(5) 反應微孔，(6)讀數器芯片槽，(7)反應信號輸出導線，⑶讀數器平面圖，(9)電化學芯片平面圖.
具體實施方案由圖1可見，本電化學芯片是以75士 1_Χ25士 1_Χ1士0. 5mm的玻片(1)為固相底板，在上面一次成型構造16個金納米反應微孔(5)，每個反應微孔都包含有三個電極工作電極(3)，輔助電極O)，參比電極⑷；每個工作電極(3)上都修飾有功能化的納米材料和生物分子復合層，再在復合層修飾核苷酸或肽核酸捕獲探針鏈，從而建立16SrRNA特異性序列識別層。由圖2可見，一個寬80mmX40mmX4mm的電化學芯片讀數器，有一個電化學芯片讀數槽(6)和兩排反應信號輸出導線(7)。由圖3可見，將電化學芯片(9)放入到讀數器(8)芯片槽里面進行讀數，并通過輸出導線(7)將反應信號輸出。
權利要求1.一次性電化學芯片，有一個玻璃底板，其特征在于在玻璃底板上有16個反應微孔和電化學芯片讀數器連接。
2.根據權利要求1所述的電化學芯片，其特征在于每個反應微孔都含有三電極體系 輔助電極、參比電極、工作電極；輔助電極和參比電極分別環繞在工作電極周圍。
3.根據權利要求2所述的三電極體系，其特征在于輔助電極、參比電極、工作電極均由金納米導電材料構成。
4.根據權利要求1所述的電化學芯片，其特征是還包括檢測探針，性質是DNA或PNA探針。
專利摘要新型第二代生物芯片一次性電化學芯片，可以用新型納米材料及生物學分子進行修飾，并與多通道恒電位儀相結合。在每張電化學芯片上都含有16個獨立分析微孔，電化學芯片集成度高，易于批量生產，性質穩定，非常適合在醫院檢驗科應用。利用此芯片可以直接對臨床尿路常見病原菌進行鑒定及藥敏分析，而不用對病原菌進行培養或基因擴增，臨床標本檢測量小(3-50μL)，準確度高，特異性強，診斷時間短，檢測成本低。
文檔編號G01N27/27GK202220175SQ20112017543
公開日2012年5月16日 申請日期2011年5月27日 優先權日2011年5月27日
發明者甘先云, 謝國明, 趙朝輝 申請人:甘先云, 謝國明, 趙朝輝