專利名稱：尿中ii型膠原降解產物檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于醫療器械領域，具體地是涉及一種尿中Ii型膠原降解產物檢測試齊U盒。
背景技術：
軟骨結構完整性的損傷是骨關節炎和類風濕關節炎的主要組織學表現。II型膠原蛋白是軟骨的主要有機成分。軟骨降解后，II型膠原蛋白的片段(CTX-II)釋放進入循環系統，隨后排入尿中。尿中的CTX-II片段可由尿中II型膠原降解產物檢測試劑盒定量檢測。據報道，尿中II型膠原降解產物檢測有助于預測骨關節炎的發展及其它臨床和臨床前研究。目前，還沒有特異性和靈敏度較高的酶聯免疫法檢測試劑盒。
實用新型內容本實用新型的目的之一是提供一種尿中II型膠原降解產物檢測試劑盒。實現上述目的的技術方案如下一種尿中II型膠原降解產物檢測試劑盒，包括盒體，盒體內主要有具有放置試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶、以及包被有鏈菌抗生物素蛋白層的微孔板； 所述試劑瓶包括裝有濃度為4. 5-5. 5 μ g/ml的生物素標記的CTX-II抗原溶液試劑瓶，和 CTX-II單克隆抗體滴度為1 950-1 1050的CTX-II單克隆抗體溶液試劑瓶。所述檢測試劑盒還包括有1瓶裝有TRIS緩沖溶液標準品的試劑瓶，5瓶分別具有 CTX-II合成肽的試劑瓶，2瓶分別具有尿CTX-II質控品的試劑瓶，1瓶具有過氧化物酶偶聯的兔抗鼠免疫球蛋白的試劑瓶，1瓶具有底物溶液的試劑瓶，1瓶具有終止液的試劑瓶和 1瓶具有沖洗液的試劑瓶。進一步地，還包括有用于檢測時密封微孔板的封口膜。本實用新型所述試劑盒采用酶聯免疫法，基于一種單克隆抗體對尿II型膠原片段，或對結合于鏈霉抗生物素蛋白包被的微孔內表面的生物素標記合成肽的競爭性結合。首先，生物素標記的合成肽結合于包被有鏈霉抗生物素蛋白的微孔板內表面。清洗之后，加入標準品、質控品和尿樣，然后加入單克隆抗體溶液。再次清洗，并加入過氧化物酶偶聯的兔抗鼠免疫球蛋白。再次清洗后，加入生色底物，用硫酸終止顯色反應并測定吸光度。本實用新型所述的尿II型膠原降解產物檢測試劑盒具有特異性、靈敏度和精密度都非常好的優點。
圖1是本實用新型實施例1所述盒體與下凹瓶位的的結構示意圖；圖2是本實用新型實施例1所述微孔板的結構示意圖；圖3是本實用新型實施例1所述微孔板的結構示意圖。
具體實施方式
實施例1(一)、本實施例所述的尿中II型膠原降解產物檢測試劑盒的主要組成成份如下參見圖1-圖3，所述尿膠原降解產物檢測試劑盒的盒體1內具有固定泡沫模具形成的下凹瓶位2 (共有14個下凹瓶位)，下凹瓶位2用于放置裝有溶液的試劑瓶；位于塑料框架3中的微孔板4，微孔板4中的微孔5內包被有鏈霉抗生物素蛋白層。具體組成如下1.鏈霉抗生物素蛋白包被的微孔板具有鏈霉抗生物素蛋白包被層的條形微孔板(12條Χ8孔)，置于框架中。2.尿 CTX-II 標準品 0具有可直接使用的含有蛋白質穩定劑、去污劑和防腐劑的TRIS緩沖溶液，1瓶(至少 3. OmL)。3.尿 CTX-II 標準品 1-5具有可直接使用的合成肽(溶于含蛋白質穩定劑、去污劑和防腐劑的TRIS緩沖溶液中)，合成肽的準確濃度標在各瓶上。5瓶(至少0. 4mL/瓶)。4.尿 CTX-II 質控品具有可直接使用的合成肽(溶于含有蛋白質穩定劑、去污劑和防腐劑的TRIS緩沖溶液中)，2瓶(至少0. 4mL)。5.生物素標記的尿CTX-II抗原可直接使用的生物素標記合成肽1瓶(至少12. OmL)。6. 一抗體溶液可直接使用的單克隆抗體(溶于含蛋防腐劑和紅色染料的TRIS緩沖溶液中)1瓶 (至少 12. OmL)。7.過氧化物酶偶聯抗體可直接使用的過氧化物酶偶聯的兔抗鼠免疫球蛋白(溶于含防腐劑和藍色染料的TRIS緩沖溶液中)1瓶(至少12. OmL)。8.底物溶液可直接使用的四甲基聯苯胺(TMB)底物(溶于酸性溶液中)。1瓶(至少12. OmL)。9.終止液可直接使用的0. 18M硫酸溶液。1瓶(至少12. OmL)。10.清洗溶液(50 X)含有去污劑和防腐劑的濃縮清洗緩沖液。1瓶(至少20. OmL)。11.封口膜孵育時密封微孔板的粘性薄膜。所述試劑盒的制備如下一)標準品與質控品1)來源[0042]CTX-II 合成肽凍干粉購自 Nordic Bioscience Diagnostic A/S 公司。2)質控品制備將CTX-II合成肽凍干粉與lOmmol/L的TRIS緩沖液混合，質控品1中CTX-II濃度約為1. 50 μ g/L，質控品2中CTX-II濃度約為4. 50 μ g/L，并加入10A的BSA和0. 018 % 的Bronidox 5L做為防腐劑和穩定劑，各取0. 4mL分裝，4°C密封保存。3)標準品制備標準品0取3mL濃度l(toimol/L的TRIS緩沖液，加入1 %的BSA和0. 018 %的 Bronidox 5L做為防腐劑和穩定劑，4°C密封保存。標準品1-5取CTX-II合成肽凍干粉，分別用lOmmol/L的TRIS緩沖液稀釋至 CTX-II 濃度為 0. 75μ g/L、l. 25 μ g/L,2. 50 μ g/L,5. 00 μ g/L 和 10. 00 μ g/L。各取 0. 4mL 分裝，4°C密封保存。二)生物素標記的CTX-II抗原取CTX-II合成肽25mg，與IOmL濃度為lOmmol/L的TRIS緩沖液混合，得抗原稀釋液；取濃度為1. 25mg/mL的生物素，抗原稀釋液生物素=1 4體積比混合，采用簡易過碘酸鈉法將生物素與CTX-II合成肽交聯；取制備后的生物素標記的CTX-II抗原，加入
的BSA和0. 018%的Bronidox 5L做為防腐劑和穩定劑，4°C密封保存，所述CTX-II抗原濃度為 5μ g/ml。三)一抗溶液1)抗體制備取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，對家兔5-8處部位進行免疫接種，初次免疫注射lmg/mL濃度的CTX-II抗原0. 2mL，第3周、第4周及第5周注射lmg/mL濃度的CTX-II 抗原與不完全弗氏佐劑等體積混合溶液0. 4mL。拉頸處死家兔，收集血液，3000r/min離心30min后取上清，加入含有1 %的BSA、 0.1% Tween 20和0. 0075%的Bronidox的溶液5L做為防腐劑和穩定劑，4°C密封保存。2) 一抗溶液制備取制備后的CTX-II單克隆抗體，用10mmol/L的TRIS緩沖液和25mol/L的EDTA混合，加入紅色素做為顯色劑，其濃度為0. 03mg/ml，取12mL分裝，4°C密封保存，所述CTX-II 單克隆抗體滴度為1 1000。一抗濃度的選擇稀釋度測定先將0. Iml的生物素標記抗原加入預包被鏈酶抗生物素蛋白的微孔板，洗滌后加一系列不同稀釋度(1 1000,1 2000,1 3000， 1 4000,1 5000,1 6000)的一抗進行孵育，洗滌后加入0. Iml的過氧化物酶偶聯抗體孵育，洗滌后加底物顯色，加終止液終止反應。在酶標比色計中測定不同稀釋度的一抗OD 值，選擇OD值> 1.0的那個一抗稀釋度即為一抗的使用濃度。最終確定一抗的最佳工作濃度為 1 1000。四)過氧化物酶偶聯抗體通用鼠抗兔IgG凍干粉購自英國Abcam公司。取鼠抗兔IgG凍干粉0. Ig,與IOmL 濃度為lOmmol/L的TRIS緩沖液混合。取HRP固體用去離子水稀釋為5mg/mL，采用簡易過碘酸鈉法將HRP與鼠抗兔IgG交聯。取制備后的鼠抗兔IgG，用lOmmol/L的TRIS緩沖液和25mol/L的EDTA混合，加入藍色素做為顯色劑，藍色素的濃度為0. 08mg/ml，再加入1 %的BSA,0. 的Tween20和0. 0075%的Bronidox 5L做為防腐劑和穩定劑，取12mL分裝， 4°C密封保存。所述酶偶聯抗體的工作滴度為1 5000。五)其他預包被鏈菌抗生物素蛋白的微孔板、底物液、終止液和沖洗液均由其他商業公司提供。實施例2 運用實施例1所述的試劑盒對尿中II型膠原降解產物檢測使用前，將所有溶液平衡至室溫(1822°C )。確定實驗所需微孔板數量。每一樣本設兩個平行孔。另外，每輪實驗共需要14孔用于標準品和質控。將適當數量的微孔板置于塑料框架上。將未使用的微孔板與干燥劑一起密封于錫箔袋中。具體包括以下步驟1)預孵育向各孔加入100 μ L生物素標記的尿CTX-II抗原，用封口膜密封，室溫(18_22°C ) 下孵育30士5分鐘，不要震蕩。2)清洗清洗緩沖溶液(50X)以1體積濃縮緩沖溶液+50體積蒸餾水的比例稀釋。手工清洗微孔板5次。使用自動洗板機，通常清洗5次。確保每次手工或自動清洗后將微孔中的溶液倒干凈。3) 一次孵育向適當的孔中加入40yL尿CTX-II標準品(0_5)，質控品或待測尿樣，再加入 IOOyL—抗體溶液。用封口膜密封微孔板，在冰箱中孵育21 士 3小時，不要震蕩。4)清洗見第2步。5) 二次孵育向各孔加入IOOyL過氧化物酶偶聯抗體溶液。用封口膜密封微孔板，室溫 (18-22°C )下孵育60士5分鐘，不要震蕩。6)清洗見第2步。7)與生色底物溶液孵育向各孔加入100 μ L底物溶液，用封口膜密封，室溫(18-22°C )下避光孵育15 士 2 分鐘，不要震蕩。8)終止顯色反應向各孔加入100 μ L終止溶液。9)測定吸光度在2小時內以650nm為參照測定450nm下的吸光度。檢測范圍如果待測樣本的吸光度低于標準5，建議用標準品0稀釋樣本并重新分析。質量控制參考值(參考范圍)各類人群的平均值和標準偏差舉例如下。
權利要求1.一種尿中II型膠原降解產物檢測試劑盒，其特征是，包括盒體，盒體內主要有具有放置試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶、以及包被有鏈菌抗生物素蛋白層的微孔板；所述試劑瓶包括裝有濃度為4. 5-5. 5μ g/ml的生物素標記的CTX-II抗原溶液試劑瓶，和CTX-II單克隆抗體滴度為1 950-1 1050的CTX-II單克隆抗體溶液試劑瓶。
2.根據權利要求1所述的尿中II型膠原降解產物檢測試劑盒，其特征是，所述檢測試劑盒還包括有1瓶裝有TRIS緩沖溶液標準品的試劑瓶，5瓶分別具有CTX-II合成肽的試劑瓶，2瓶分別具有尿CTX-II質控品的試劑瓶，1瓶具有過氧化物酶偶聯的兔抗鼠免疫球蛋白的試劑瓶，1瓶具有底物溶液的試劑瓶，1瓶具有終止液的試劑瓶和1瓶具有沖洗液的試劑瓶。
3.根據權利要求1或2所述的尿中II型膠原降解產物檢測試劑盒，其特征是，還包括有用于檢測時密封微孔板的封口膜。
專利摘要本實用新型公開了一種尿中II型膠原降解產物檢測試劑盒，包括盒體，盒體內主要有具有放置試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶、以及包被有鏈菌抗生物素蛋白層微孔板；所述試劑瓶包括裝有濃度為4.5-5.5μg/ml的生物素標記的CTX-II抗原溶液試劑瓶，和CTX-II單克隆抗體滴度為1∶950-1∶1050的CTX-II單克隆抗體溶液試劑瓶。所述尿中II型膠原降解產物檢測試劑盒具有特異性、靈敏度和精密度都非常好的優點。
文檔編號G01N33/543GK201945595SQ20112004794
公開日2011年8月24日 申請日期2011年2月25日 優先權日2011年2月25日
發明者郭志程 申請人:廣州固康生物科技有限公司