專利名稱：利用igy型鐵蛋白抗體、通過膠乳增強免疫比濁法測定血清中鐵蛋白的液體雙試劑試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫學免疫體外診斷領域，涉及ー種免疫檢測試劑，進一歩地，本發明涉及ー種利用IGY型鐵蛋白抗體、通過膠乳增強免疫比濁法測定血清中鐵蛋白的液體雙試劑試劑盒。
背景技術：
動植物體內廣泛存在ー類貯存鐵的蛋白，在哺乳類動物的肝和脾中含量最多，其外徑約12 14nm，空囊腔徑長約6nm，外殼(即脫鐵鐵蛋白)由24個亞基組成，每個亞基約含163個氨基酸殘基，每個分子最多可結合4500個鐵原子。分子量約為900，000。結合鐵的鐵蛋白是“溶”于水的，血漿鐵蛋白的濃度與體內儲存的鐵成正比。鐵蛋白為機體內ー種貯存鐵的可溶組織蛋白。正常人血清中含有少量鐵蛋白，但不同的檢測法有不同的正常值。一般正常均值男性約80-130 μ g/L(80-130ng/ml)女性約35-55 μ g/L(35-55ng/ml)。血清鐵水平在妊娠期及急性貧血時降低，急慢性肝臟損害和肝癌時升高，國內報道肝癌患者陽性率高達90%。近年來發現肝癌還含有ー種酸性的異鐵蛋白，稱為癌胚異鐵蛋白，可能有助于早期診斷。肝癌患者有鐵蛋白增高的原因可能是①肝癌細胞能合成和分泌鐵蛋白或異鐵蛋白肝癌組織對鐵蛋白的攝取及清除受到影響肝細胞損害壞死，貯存在肝細胞漿中的鐵蛋白溢入血中。血清鐵蛋白雖非特異性，但除肝癌、胰腺癌中度升高外，其它消化道腫瘤如食管癌、胃癌、直結腸癌均不升高。肝癌患者治療有效者血清鐵蛋白下降，而惡化和再發者升高，持續增高則預后不良，故血清鐵蛋白測定可作為療效監測手段之一，特別是對AFP陰性的患者尤有意義。
發明內容
本發明的目的在于提供ー種鐵蛋白檢測試劑的改進，具有樣本(血清)無需稀釋、靈敏度高、特異性強、線性范圍寬、適用于各種類型的全自動生化分析儀的特點。一方面，本發明提供利用IGY型鐵蛋白抗體、通過膠乳增強免疫比濁法測定血清中鐵蛋白的液體雙試劑試劑盒，該試劑盒包括試劑R1、試劑R2和已知濃度的鐵蛋白抗原校準品，其中，試劑Rl包含高分子加速劑、防腐剤、表面活性剤、電解質及緩沖液；試劑R2包含結合抗人鐵蛋白抗體的聚苯こ烯膠乳顆粒，膠乳顆粒直徑為100-200nm，還包含防腐剤、表面活性劑、電解質及緩沖液；已知濃度的鐵蛋白抗原標準品包含防腐劑、純化人鐵蛋白、電解質及緩沖液。更進一歩地，在本發明的一實施方案中，利用IGY型鐵蛋白抗體、通過膠乳增強免疫比濁法測定血清中鐵蛋白的液體雙試劑試劑盒包括試劑R1、試劑R2和已知濃度的鐵蛋白抗原校準品。其中所述試劑Rl中高分子加速劑的質量百分比為2% _6%，防腐劑的質量百分比為O. 05% -0.5%，表面活性劑的質量百分比為O. 1% -1.0%，電解質的質量百分比為O. 1% -10. 0%，緩沖液的濃度為 10mmol/L-200mmol/L。所述試劑R2中膠乳顆粒的含量百分比為O. 05% -O. 5%, IGY型鐵蛋白多克隆抗體的含量為O. 05mg/mL-0. 5mg/mL,防腐劑的質量百分比為O. 05% -O. 5%，表面活性劑的質量百分比為O. 1^-1.0%,電解質的質量百分比為O. 1^-10.0%,緩沖液的濃度為IOmmol/L-200mmol/Lo 已知濃度的鐵蛋白抗原標準品，純化的鐵蛋白抗原的含量為100ng/mL-1000ng/mL,防腐劑的質量百分比為O. 05% -O. 5%，電解質的質量百分比為O. 1% -10. O%，緩沖液的濃度為 10mmol/L-200mmol/L。在本發明所述利用IGY型鐵蛋白抗體、通過膠乳增強免疫比濁法測定血清中鐵蛋白的液體雙試劑試劑盒中，所述的IGY型鐵蛋白抗體來自雞或鴨，優選為來自于雞。此多克隆抗體可特異地識別鐵蛋白多個抗原位點，因此能特異結合鐵蛋白単體和聚合體，同時也消除了傳統IGG型抗體中類風濕因子等因素對測值的影響。因此，該多克隆抗體既可以保障抗原抗體的高效親和力，也保障了試劑盒的特異性，提高了抗干擾能力。本發明所述試劑Rl、R2的緩沖液是三羥甲基氨基甲烷緩沖液或甘氨酸緩沖液，優選為三羥甲基氨基甲烷緩沖液。所述試劑Rl、R2緩沖液的pH值為6. 0-8. 5，優選為7. O-8. O ο本發明所述試劑中高分子加速劑選自PEG2000、PEG6000、PEG8000，優選為PEG6000。本發明所述試劑中防腐劑選自疊氮鈉或對羥基苯甲酸こ酷，優選為疊氮鈉。本發明所述試劑中表面活性劑選自Tween系列或聚氧こ烯苯基醚,優選為Tween。本發明所述試劑中電解質為氯化鈉或氯化鈣，優選為氯化鈉。本發明采用膠乳顆粒增強透射免疫比濁法，其原理是包被了高特異性抗體的膠乳顆粒，與樣本中相應的抗原發生特異性結合，形成抗原-抗體-膠乳顆粒的復合物，在特定的緩沖液中這種復合物形成一定的濁度，濁度的增加程度與樣本中的抗原濃度成正比關系，在一定的波長下進行濁度測定，即可測得樣本中被檢抗原的含量。在本發明中，血清中的鐵蛋白抗原與結合在膠乳顆粒表面的特異性雞抗人鐵蛋白多克隆抗體結合，發生抗原抗體反應，形成免疫復合物，形成一定濁度，測定此濁度在570nm波長處的吸光度，對照標準曲線即可求出樣本中鐵蛋白的含量。采用本發明所述的利用IGY型抗體，通過膠乳增強免疫比濁法測定血清中鐵蛋白的液體雙試劑試劑盒進行測定吋，先將樣本與試劑Rl混勻，讀取吸光度Al，之后加入試劑R2，讀取吸光度A2，計算反應吸光度變化值，對照標準曲線得出樣本中鐵蛋白的含量。本發明的技術核心在于使用特異性IGY型鐵蛋白抗體，可識別鐵蛋白多個抗原位點，同時消除了傳統IGG型抗體中類風濕因子等因素對測值的影響。因此提高了試劑盒的測定靈敏度和抗干擾能力。使用本發明的方法能夠保證檢測極低水平的鐵蛋白，具有很好的臨床應用價值。本發明所述液體雙試劑試劑盒，具有準確性高、特異性好、靈敏度高及抗干擾能力強等優點，可用于檢測血清中鐵蛋白的濃度，適用于臨床各種全自動生化分析儀。
圖I :鐵蛋白測定方法示意圖。圖2 :本發明試劑與對比試劑相關性。
具體實施例方式實施例I :利用IGY型鐵蛋白抗體、通過膠乳增強免疫比濁法測定血清中鐵蛋白的液體雙試劑試劑盒試劑盒的主要成分及配比如下試劑Rl
三羥甲基氨基甲烷緩沖液45 mmol/L
疊氮鈉0.1%
氯化鈉1%
PEG-60004%
Tween-200.1%試劑R2
三羥甲基氨基甲烷緩沖液45 mmol/L
疊氮鈉0.1%
氯化鈉1%
Tween-200.1%
IGY型鐵蛋白多克隆抗體O.lmg/mL
100-150nm粒徑的聚苯こ烯膠乳0.1% w/v鐵蛋白標準品
三羥甲基氨基甲烷緩沖液45 mmol/L
疊氮鈉(防腐劑)0.1% 氯化鈉(電解質)1% 純化的人鐵蛋白1-5%試劑盒測定方法如圖I所示。分析方法兩點終點法，反應時間10min,讀點19點到31點，樣本量7 μ L，試劑Rl :140yL，試劑R2 :70 μ L，主波長570nm，副波長800nm，反應方向上升反應，校準方式Spline,定標方法5點定標,定標第一點為儀器設置的水點，第二、三、四、五點是濃度為100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL的鐵蛋白標準
品O
實施例2 :檢測試劑盒的相關性、靈敏度及線性范圍實驗中使用本發明試劑(具體配方參見實施例I)及對比試劑(英國RANDOX公司Feiritin試劑盒，產品批號為214284)。I、相關性實驗分別使用本發明試劑和對比試劑，釆用日立7080全自動生化分析儀對50份人血清(包含正常和異常標本)按各自參數同時進行測定(表1)，本發明試劑參數見實施例I。對測定值進行線性回歸，得回歸方程為y= I· 0346X-3. 2384，相關系數為R2 = O. 9996 (y為本發明試劑，X為對比試劑)(圖2)，結果表明本發明試劑與對比試劑相關性很好，進而說明本發明試劑具有很好的特異性和準確度。此外本試劑不僅適用于日立7080全自動生化分析儀，還可用于日立、奧林巴斯等其他系列的全自動和半自動生化分析儀，具體參數可根據主要參數做適當調整。表I :本發明試劑與對比試劑相關性
權利要求
1.ー種利用IGY型鐵蛋白抗體、通過膠乳增強免疫比濁法測定血清中鐵蛋白的液體雙試劑試劑盒，試劑盒包括試劑R1、試劑R2和已知濃度的鐵蛋白抗原標準品，其中， 所述試劑Rl包含高分子加速劑、防腐剤、表面活性剤、電解質及緩沖液； 所述試劑R2包含結合抗人鐵蛋白抗體的聚苯こ烯膠乳顆粒，膠乳顆粒直徑為.100-200nm，還包含防腐劑、表面活性剤、電解質及緩沖液； 所述已知濃度的鐵蛋白抗原標準品包含防腐剤、純化人鐵蛋白、電解質及緩沖液。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其中IGY型鐵蛋白抗體來自雞或鴨，優選為來自雞。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，該試劑盒包括試劑R1、試劑R2和已知濃度的鐵蛋白抗原標準品，其中 所述試劑Rl中高分子加速劑的質量百分比為2% -6%，防腐劑的質量百分比為O. 05% -0.5%，表面活性劑的質量百分比為O. 1% -1.0%，電解質的質量百分比為.O.1% -10. 0%，緩沖液的濃度為 10mmol/L-200mmol/L ； 所述試劑R2中膠乳顆粒的含量百分比為O. 05% -O. 5%, IGY型鐵蛋白多克隆抗體的含量為O. 05mg/mL-0. 5mg/mL,防腐劑的質量百分比為O. 05% -O. 5%，表面活性劑的質量百分比為O. 1% -1.0%,電解質的質量百分比為O. 1% -10.0%，緩沖液的濃度為IOmmol/L-200mmol/L ； 所述已知濃度的鐵蛋白抗原標準品，純化的鐵蛋白抗原的含量為100ng/mL-1000ng/mL，防腐劑的質量百分比為0. 05% -0.5%，電解質的質量百分比為0. 1% -10.0%，緩沖液的濃度為 10mmol/L-200mmol/L。
4.根據權利要求I或3所述的試劑盒，其中緩沖液是三羥甲基氨基甲烷緩沖液或甘氨酸緩沖液，優選為三羥甲基氨基甲烷緩沖液。
5.根據權利要求I或3所述的試劑盒，其中緩沖液pH值為6.0-8. 5，優選為7. 0-8. O。
6.根據權利要求I或3所述的試劑盒，其中試劑Rl中的高分子加速劑選自PEG2000、PEG6000、PEG8000，優選為 PEG6000。
7.根據權利要求I或3所述的試劑盒，其中防腐劑選自疊氮鈉或對羥基苯甲酸こ酷，優選為疊氮鈉。
8.根據權利要求I或3所述的試劑盒，其中試劑R1、R2中的表面活性劑選自Tween系列或聚氧こ烯苯基醚，優選為Tween。
9.根據權利要求I或3所述的試劑盒，其中電解質為氯化鈉或氯化鈣，優選為氯化鈉。
10.根據權利要求I或3所述的試劑盒，其中已知濃度的鐵蛋白抗原標準品的鐵蛋白濃度分別為 100、200、500、1000ng/mL。
11.根據權利要求I或3所述的試劑盒，其中鐵蛋白抗原標準品為添加重組人鐵蛋白純品的人血清或其他類似血清基質的液體。
全文摘要
本發明公開一種利用IGY型鐵蛋白抗體、通過膠乳增強免疫比濁法測定血清中鐵蛋白的液體雙試劑試劑盒。本發明提供的試劑盒包括試劑R1、試劑R2和鐵蛋白標準品，其中，試劑R1包含高分子加速劑、防腐劑、表面活性劑、電解質及緩沖液；試劑R2包含結合抗人鐵蛋白抗體的聚苯乙烯膠乳顆粒，膠乳顆粒直徑為100-200nm，還包含防腐劑、表面活性劑、電解質及緩沖液；鐵蛋白標準品包含防腐劑、純化人鐵蛋白、電解質及緩沖液。本發明的試劑盒特異性強、靈敏度高、線性范圍寬、操作簡便，適用于各種全自動生化分析儀。
文檔編號G01N33/68GK102628866SQ20111045498
公開日2012年8月8日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者劉希, 王恒強, 高愛民 申請人:北京九強生物技術股份有限公司