一種定量檢測心肌肌鈣蛋白t的熒光免疫層析方法及其試劑盒的制作方法

專利名稱：一種定量檢測心肌肌鈣蛋白t的熒光免疫層析方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，特別涉及一種利用心肌肌鈣蛋白T相關(guān)的免疫反應(yīng)及熒光免疫層析技術(shù)，以早期、敏感、特異的定量檢測急性心肌梗死。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，心血管疾病在世界范圍內(nèi)已成為成年人最大的潛在殺手，僅在美國就有超過7000萬人患有心臟病，每年大約有600萬人因胸痛而進(jìn)急診室，每年急性心肌梗死的死亡人數(shù)超過了 50萬，在我國，心血管疾病的患病率、發(fā)病率及其危險(xiǎn)因素水平均呈不斷上升趨勢(shì)。近年來統(tǒng)計(jì)，心血管病的死亡率在人口死亡中占40%，已高于歐美國家，屬心血管病高發(fā)國。因此，只有做到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)及早救治，才能最大限度的防止致殘、致死后果， 最大限度的改善心血管患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。對(duì)心血管疾病，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測多為心肌酶譜系列。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)，它對(duì)急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)的診斷存在著不足之處，如血液中酶活性升高出現(xiàn)較晚、持續(xù)時(shí)間短及特異性較差等。因此，20世紀(jì)90年代以來，臨床化學(xué)家們逐漸將診斷AMI的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到心肌蛋白標(biāo)志物上。其中心肌肌鈣蛋白(Cardiac troponin, cTn)是唯一存在于心肌中的收縮蛋白，對(duì)心肌壞死具有高度的敏感性和特異性。肌鈣蛋白是肌肉收縮的調(diào)節(jié)蛋白，由三個(gè)結(jié)構(gòu)不同的亞基組成，即肌鈣蛋白T (TnT)、肌鈣蛋白I(TnI)和肌鈣蛋白C(TnC)。肌鈣蛋白具有的3種同分異構(gòu)體，其中兩種同分異構(gòu)體是骨骼肌所特有的，一種同分異構(gòu)體是心肌所特有的，這3種肌鈣蛋白的同分異構(gòu)體存在著結(jié)構(gòu)上的差異。心肌中的T和I亞基結(jié)構(gòu)不同于其它肌肉組織，且由于分子量小，發(fā)病后血中濃度將迅速升高。其中，心肌肌鈣蛋白T(cTnT)在3 6小時(shí)超過參考值上限值，10 M小時(shí)達(dá)峰值，升高倍數(shù)可達(dá)30 200倍，而CK-MB最高僅為5 20倍，此外可持續(xù)10 15天才恢復(fù)正常。即出現(xiàn)早，和CK-MB相當(dāng)或稍早；消失慢，持續(xù)時(shí)間超過 LDl，診斷的窗口期特別長，兼有CK-MB和LDl的優(yōu)點(diǎn)。cTnT的靈敏度為50% 59% (0 6小時(shí))，特異性達(dá)74% 96%。據(jù)報(bào)道cTnT在診斷AMI時(shí)比CK-MB、LD1/LD2比率更為靈敏，且由于消失慢，可作為心肌梗死后期標(biāo)志物。另外，cTnT亦可作為心臟手術(shù)中心肌梗死癥狀出現(xiàn)的指示物，當(dāng)病人接受動(dòng)脈搭橋手術(shù)時(shí)，若cTnT含量增加，表明出現(xiàn)心肌梗死，而此時(shí)CK-MB含量并無變化。目前，多采用化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法及膠體金免疫層析法等測定血清中的 CTnT0但化學(xué)發(fā)光法對(duì)技術(shù)要求高，不易在臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行常規(guī)開展；酶聯(lián)免疫吸附法操作復(fù)雜，檢測耗時(shí)長；膠體金免疫層析法雖然具有樣品用量少，簡便快速，便宜的優(yōu)勢(shì)，然而當(dāng)遇到某些樣品中目標(biāo)分析物含量較低時(shí)，膠體金的顏色將很淺，很難用肉眼來判斷結(jié)果， 容易出現(xiàn)誤判，靈敏度低。中國專利申請(qǐng)?zhí)?01010197148. 0披露了一種肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T的雙通道檢測卡，該申請(qǐng)?zhí)枌＠媚z體金標(biāo)記不同目標(biāo)物的抗體，肉眼觀察檢測結(jié)果，實(shí)現(xiàn)肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T的同時(shí)檢測。該申請(qǐng)?zhí)枌＠荒苓M(jìn)行定性檢測，而不能實(shí)現(xiàn)定量檢測；檢測結(jié)果通過肉眼進(jìn)行觀察，受主觀影響較大，特別是對(duì)于目標(biāo)分析物含量較低的樣品，同一試紙條不同的檢測者可能會(huì)做出不同、甚至錯(cuò)誤的結(jié)果判斷。中國專利申請(qǐng)?zhí)?00710056485. 6公布了一種吖啶酯和堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測心肌鈣蛋白T的超敏感方法。該申請(qǐng)?zhí)枌＠捎眠灌ズ?或堿性磷酸酶作為標(biāo)記物，它們?yōu)殚g斷的、閃爍性發(fā)光，在反應(yīng)過程中易發(fā)生裂變，進(jìn)而導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果不穩(wěn)定。此外，該方法還具有操作步驟多，測試成本高的缺點(diǎn)。在免疫層析系統(tǒng)中，除膠體金、膠體硒、乳膠顆粒及碳顆粒以外，量子點(diǎn)亦可被用作可視或可被儀器檢測的指示物質(zhì)。它具有發(fā)光強(qiáng)度高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光壽命長、表面修飾多功能化及穩(wěn)定性好等眾多優(yōu)點(diǎn)，在熒光檢測領(lǐng)域具有取代傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料的潛力，已成為新一代生物熒光標(biāo)記物。對(duì)膠體金免疫層析而言，定性/半定量分析是依據(jù)膠體金顆粒對(duì)光的吸收和散射進(jìn)行檢測的。與檢測熒光強(qiáng)度相比，具有靈敏度低、定量不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)。因此，基于量子點(diǎn)及免疫層析的諸多優(yōu)勢(shì)，需要研制一種利用量子點(diǎn)來檢測心肌肌鈣蛋白T的方法，彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中檢測心肌肌鈣蛋白T靈敏度低、定量不準(zhǔn)確或操作步驟繁瑣、成本高的不足之處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測心肌肌鈣蛋白T靈敏度低、定量不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，提供了一種定量檢測心肌肌鈣蛋白T的熒光免疫層析方法及其試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為步驟1)用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將人心肌肌鈣蛋白T的特異性抗體連接到量子點(diǎn)表面，得到抗體修飾的量子點(diǎn)，所述抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長范圍為 550 1300nm ；步驟2)將步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)固定在標(biāo)記墊上，且標(biāo)記墊上同時(shí)固定有質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)，所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長不同，且波長范圍為550 1300·，在層析膜上分別設(shè)有定量帶和質(zhì)控帶，其中質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶固定有對(duì)應(yīng)心肌肌鈣蛋白T的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟3)以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊和底板構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱熒光層析膜，底板具低熒光特性；步驟4)試紙條免疫層析后，檢測定量帶和質(zhì)控帶的熒光信號(hào)強(qiáng)度，并以質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度校正定量帶的熒光信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)心肌肌鈣蛋白T的定量檢測。本發(fā)明提供的一種定量檢測CTnT的熒光免疫層析的方法，是一種以量子點(diǎn)為熒光信號(hào)，采用雙色標(biāo)記技術(shù)，在免疫層析試紙條上實(shí)現(xiàn)cTnT快速靈敏檢測的方法。本發(fā)明定量檢測cTnT的熒光免疫層析方法能夠解決現(xiàn)有熒光免疫層析技術(shù)中背景與信號(hào)難區(qū)分、靈敏度低、熒光定量方法不明確的不足和缺陷，可實(shí)現(xiàn)對(duì)微量樣品的檢測。由于量子點(diǎn)熒光受激發(fā)光干擾很小，靈敏度大大提高，其靈敏度是用傳統(tǒng)染料和有色標(biāo)記物檢測方法的10 1000倍。
本發(fā)明采用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將CTnT的特異性抗體連接到量子點(diǎn)表面，得到抗體修飾的量子點(diǎn)，其中所述特異性抗體為抗cTnT的單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明中的化學(xué)交聯(lián)為當(dāng)量子點(diǎn)表面存在活性基團(tuán)時(shí)，可與特異性抗體直接反應(yīng)，不需用化學(xué)交聯(lián)劑；反之，則需采用化學(xué)交聯(lián)劑將抗體與量子點(diǎn)相偶聯(lián)。其中，化學(xué)交聯(lián)劑包括1-乙基-3-(3- 二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)及戊
二醛等。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用EDC/NHS交聯(lián)法對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行蛋白修飾。其一般步驟為將純化后的量子點(diǎn)溶液與EDC和NHS混合，然后加入一定量的蛋白質(zhì)， 以緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)，培育4小時(shí)，加入甘氨酸封閉，并以色譜、層析柱或超濾離心等方式純化，從而得到蛋白修飾的量子點(diǎn)熒光納米顆粒。生物分子間特異性作用包括生物素-親和素系統(tǒng)和抗原-抗體系統(tǒng)。作為優(yōu)選， 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，采用生物素-親和素系統(tǒng)的結(jié)合方式對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行量子點(diǎn)修飾，該結(jié)合方式具有放大信號(hào)的作用。具體為將生物素連接到蛋白質(zhì)分子表面，通過親和素-生物素間的相互作用，將蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)到鏈霉親和素修飾量子點(diǎn)的表面。為了提高信號(hào)與背景的區(qū)分度，本發(fā)明選用發(fā)射光波長為550 1300nm的量子點(diǎn)。因在紫外照射下，層析膜、底板和扣卡的熒光強(qiáng)度在550nm以下遠(yuǎn)強(qiáng)于550nm以上，從而對(duì)低濃度cTnT檢測時(shí)產(chǎn)生一定的影響，故優(yōu)選發(fā)射波長大于550nm的量子點(diǎn)。此外，層析膜、底板和扣卡在近紅外區(qū)域(750 1300nm)熒光強(qiáng)度極弱，結(jié)合量子點(diǎn)合成技術(shù)，優(yōu)選近紅外波長的量子點(diǎn)(750 1300nm)進(jìn)一步提高靈敏度。本發(fā)明所用量子點(diǎn)包含單一化合物形成的量子點(diǎn)或是幾種化合物組裝成的復(fù)合物量子點(diǎn)，且量子點(diǎn)具有較強(qiáng)的光穩(wěn)定性。形成量子點(diǎn)的化合物是從aiS、CdS、HgS、MgS、 CdSe, MgSe, ZnSe, PbSe, PbSe, CdTe, MgTe, ZnTe, HgTe, InAs, InP 組成的組中選擇的，且可摻雜Cu、Mn和Hg。其中，質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)與cTnT抗體修飾的量子點(diǎn)可選用相同發(fā)射波長的量子點(diǎn)。但在本發(fā)明中，為了減弱質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)對(duì)定量帶及背景信號(hào)的影響，采用雙色標(biāo)記技術(shù)，即選用兩種發(fā)射波長不同的量子點(diǎn)分別標(biāo)記質(zhì)控分子和抗體。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)記墊中與cTnT結(jié)合的抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為650nm，質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為570nm。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)記墊中與cTnT結(jié)合的抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為900nm，質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為600nm。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用有機(jī)相方法合成570nm、600nm和650nm的 CdSe/aiS，并把量子點(diǎn)由脂溶性轉(zhuǎn)為水溶性，此過程中量子點(diǎn)熒光無明顯變化；使用水相方法合成900nm的hAs。為了降低對(duì)量子點(diǎn)熒光信號(hào)的影響，本發(fā)明采用弱熒光的層析膜、低熒光的底板以及低熒光的扣卡，從而保證獲得高熒光信背比，能良好區(qū)分信號(hào)與背景，進(jìn)而提高檢測靈敏度。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的實(shí)施例中，底板為黑色，表面附有不干膠，且扣卡、層析膜、 底板及不干膠均不含有熒光劑。
本發(fā)明實(shí)施例中熒光免疫層析試紙條由樣品墊、標(biāo)記墊、過濾膜、層析膜、吸水墊和底板組成，如圖1所示。在標(biāo)記墊上固定有CTnT特異性抗體修飾的量子點(diǎn)，以及質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)。在試紙條層析膜上分別設(shè)有定量帶和兩條質(zhì)控帶，其中定量帶固定有對(duì)應(yīng) cTnT的與上述標(biāo)記墊中特異性抗體不同抗原表位的特異性抗體，質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子。本發(fā)明定量帶是判定樣品中cTnT含量的主要指標(biāo)，并且受質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度校正，以提高定量準(zhǔn)確度。此外，通過增加定量帶的條數(shù)，可擴(kuò)大試紙條的檢測范圍，避免出現(xiàn)HOOK效應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，發(fā)明人所選用的樣品為血清，且樣品進(jìn)一步包含全血和血漿。當(dāng)樣品為全血時(shí)，熒光免疫層析試紙條還包括在樣品墊與層析膜之間設(shè)置的過濾膜，用于凝固、過濾細(xì)胞，該過濾膜可分別與標(biāo)記墊和層析膜直接毛細(xì)作用接觸，如圖1所示，也可與樣品墊和標(biāo)記墊直接毛細(xì)作用接觸，如圖3所示。其中，過濾膜還可以與樣品墊合并為同一結(jié)構(gòu)，同時(shí)擁有樣品收集、釋放及過濾的作用。本發(fā)明實(shí)施例采用預(yù)潤免疫層析方法對(duì)待測樣品中的cTnT進(jìn)行定量檢測。其中預(yù)潤免疫層析為滴加一定體積的緩沖液到層析膜上，潤濕一定時(shí)間后，將樣品加入樣品墊中，然后樣品沿層析膜向吸水墊方向?qū)游鲞\(yùn)動(dòng)。預(yù)潤的目的是預(yù)潤濕層析膜，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，以使量子點(diǎn)標(biāo)記物均勻通過層析膜，減少在層析膜上的非特異性吸附，并減緩樣品的層析速度，從而提高特異性結(jié)合效率。其中滴加緩沖液體積一般為20 80μ 1，潤濕時(shí)間為30秒 2分鐘，而樣品層析時(shí)間通常為8 25分鐘。本發(fā)明的預(yù)潤免疫層析包括將緩沖液直接或間接滴加于層析膜。當(dāng)將緩沖液間接滴加于層析膜時(shí)，熒光免疫層析試紙條還包括潤濕墊和連接墊，其中潤濕墊分別與層析膜和連接墊以毛細(xì)作用接觸，連接墊分別與潤濕墊和吸水墊以毛細(xì)作用接觸。緩沖液通過潤濕墊到達(dá)層析膜。本發(fā)明的緩沖液為ρΗ 7. 2 11的堿性緩沖液，且該堿性緩沖液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白及表面活性劑。其中，表面活性劑可包括吐溫20、吐溫80、曲拉通Χ-100、聚乙二醇及聚乙烯基吡咯烷酮等。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的實(shí)施例中使用包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH 9. 0的磷酸緩沖液。本發(fā)明的檢測用熒光定量儀包含激發(fā)光源模塊、濾光模塊、光電轉(zhuǎn)換模塊、控制分析模塊以及軟件系統(tǒng)。其中激發(fā)光源模塊包含光源及聚光裝置，該光源為發(fā)光二極管或激光二極管，且波長位于300 400nm之間或500 600nm之間。濾光模塊包含濾光片輪，該濾光片輪包含不同種濾光片，以獲取相應(yīng)量子點(diǎn)的熒光信號(hào)。光電轉(zhuǎn)換模塊包括圖像傳感器或者光電倍增管。層析結(jié)束后，在光源激發(fā)下，試紙條產(chǎn)生的熒光信號(hào)經(jīng)濾光模塊濾除雜散光及背景熒光，到達(dá)光電轉(zhuǎn)換模塊，獲得數(shù)字信號(hào)。其中所獲質(zhì)控帶與定量帶的熒光信號(hào)強(qiáng)度具有一定的相關(guān)性，主要影響因素包括溫度、濕度、基質(zhì)等。本發(fā)明檢測結(jié)果的判定方法如果質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度超出熒光定量儀內(nèi)部設(shè)定的可接受值，說明檢測結(jié)果無效；在檢測結(jié)果有效前提下，定量帶與質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度的比值越高，表示樣品中目標(biāo)檢測物的濃度越高，反之越低。本發(fā)明采用熒光定量儀檢測一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度(c)與所對(duì)應(yīng)的校正熒光信號(hào)強(qiáng)度(F)的關(guān)系曲線，關(guān)系式為F = f (c)，校正熒光信號(hào)強(qiáng)度為F= α Fi^i/FIi^，其中α為校正系數(shù)，受溫度、濕度和基質(zhì)等影響。然后檢測樣品，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可獲得樣品中CTnT的濃度。本發(fā)明提供了一種定量檢測心肌肌鈣蛋白T的熒光免疫層析試劑盒，包括扣卡
(13)、熒光免疫層析試紙條及緩沖液，如圖4所示。該試劑盒采用直接預(yù)潤免疫層析方法。 扣卡(1 為熒光免疫層析試紙條的外部殼結(jié)構(gòu)，包括上樣孔(11)、視窗(12)，且具低熒光特性或不含熒光劑。本發(fā)明實(shí)施例中的直接預(yù)潤免疫層析試紙條，其結(jié)構(gòu)包括樣品墊(1)、標(biāo)記墊 O)、層析膜G)、吸水墊( 和底板(6)。層析膜(4)包含質(zhì)控帶(8)和定量帶(7)。當(dāng)進(jìn)行全血樣品檢測時(shí)，試紙條還包括過濾膜(3)，具體結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中樣品墊(1)、標(biāo)記墊O)、過濾膜(3)、層析膜(4)和吸水墊(5)搭載于底板(6)之上，樣品墊⑴位于上樣孔 (11)的下方，且連接于標(biāo)記墊0)，標(biāo)記墊( 連接于過濾膜(3)，過濾膜C3)連接于層析膜 G)，層析膜(4)上固定有兩條質(zhì)控帶(8)和兩條定量帶(7)，且質(zhì)控帶(8)位于定量帶(7) 的兩側(cè)，層析膜(4)位于視窗(12)的下方，層析膜(4)連接于吸水墊(5)。在對(duì)試紙條預(yù)潤時(shí)，可將緩沖液直接滴加于窗口(1 內(nèi)的層析膜上，其中滴加位置為質(zhì)控帶(8)的兩側(cè)，可靠近樣品墊一側(cè)，亦可靠近吸水墊一側(cè)。本發(fā)明還提供了一種定量檢測心肌肌鈣蛋白T的熒光免疫層析試劑盒，包括扣卡(13)、熒光免疫層析試紙條及緩沖液，如圖5所示。該試劑盒采用間接預(yù)潤免疫層析方法。扣卡(1 為熒光免疫層析試紙條的外部殼結(jié)構(gòu)，包括上樣孔(11)、視窗(1 和潤濕孔
(14)，且具低熒光特性或不含熒光劑。本發(fā)明實(shí)施例中的熒光免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)如圖2所示，其包含樣品墊(1)、標(biāo)記墊O)、層析膜、潤濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊( 和底板(6)。層析膜(4)包含質(zhì)控帶(8)和定量帶(7)。其中樣品墊(1)、標(biāo)記墊(2)、層析膜(4)、潤濕墊(9)、連接墊(10) 和吸水墊(5)搭載于底板(6)之上，樣品墊(1)位于上樣孔(11)的下方，且連接于標(biāo)記墊 O)，標(biāo)記墊( 連接于層析膜，層析膜(4)上固定有兩條質(zhì)控帶(8)和兩條定量帶(7)， 且質(zhì)控帶(8)位于定量帶(7)的兩側(cè)，層析膜(4)位于視窗(1 的下方，層析膜(4)連接于潤濕墊(9)，且潤濕墊(9)位于潤濕孔(14)的下方，潤濕墊(9)連接于連接墊(10)，連接墊(10)連接于吸水墊(5)。進(jìn)行全血樣品層析時(shí)，試紙條還包括過濾膜(3)，具體結(jié)構(gòu)如圖3所示，其中試紙條包含樣品墊(1)、標(biāo)記墊O)、過濾膜(3)、層析膜、潤濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊 (5)和底板(6)。過濾膜(3)連接于樣品墊⑴與標(biāo)記墊(2)之間。本發(fā)明構(gòu)建的預(yù)潤免疫層析試紙條，其特征是，增加了潤濕墊(9)和連接墊(10)， 其中潤濕墊分別與層析膜(4)和連接墊(10)毛細(xì)作用接觸，用于緩沖液的滴加，以潤濕層析膜G)，并減少非特異性吸附。連接墊(10)分別與潤濕墊(9)和吸水墊(5)毛細(xì)作用接觸，具有緩慢的吸水速度，以減少潤濕時(shí)的吸水量，促使緩沖液充分潤濕層析膜；當(dāng)加樣品層析時(shí)，吸水墊(5) 可通過連接墊(10)吸水，促使樣品層析。
試紙條的層析膜(4)具有弱熒光特性或不含熒光劑，其熒光噪聲在大于550nm時(shí)很弱，以減少對(duì)低濃度cTnT檢測的影響。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下1)本發(fā)明采用量子點(diǎn)作為特異性抗體的熒光標(biāo)記物，與有機(jī)熒光染料相比，具有發(fā)光強(qiáng)度高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光壽命長、表面修飾多功能化及穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)。 本發(fā)明優(yōu)選了 550 1300nm的量子點(diǎn)，且質(zhì)控分子和特異性抗體修飾的量子點(diǎn)選用兩種不同發(fā)射波長的量子點(diǎn)，以降低非特異性吸附，提高檢測靈敏度。2)本發(fā)明試劑盒組成部件中的扣卡、底板以及層析膜在大于550nm時(shí)均具有低的熒光特性，以減少對(duì)量子點(diǎn)熒光信號(hào)獲取的影響，從而保證獲得高的熒光信背比，進(jìn)而達(dá)到提高靈敏度的目的。3)本發(fā)明所述的定量檢測cTnT的熒光免疫層析方法可利用潤濕層析技術(shù)，減少非特異性吸附，增強(qiáng)特異性結(jié)合，進(jìn)而提高檢測靈敏度，有利于樣品中cTnT含量極低時(shí)的
準(zhǔn)確定量。4)本發(fā)明方法與常規(guī)膠體金免疫層析相比，具有標(biāo)記穩(wěn)定性好、非特異性低、靈敏度高、線性范圍寬以及定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。


圖1為直接預(yù)潤熒光免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為標(biāo)記墊， 3為過濾膜，4為層析膜，5為吸水墊，6為底板，7為定量帶，8為質(zhì)控帶；圖2為間接預(yù)潤熒光免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為標(biāo)記墊， 4為層析膜，5為吸水墊，6為底板，7為定量帶，8為質(zhì)控帶，9為潤濕墊，10為連接墊；圖3為間接預(yù)潤熒光免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為標(biāo)記墊， 3為過濾膜，4為層析膜，5為吸水墊，6為底板，7為定量帶，8為質(zhì)控帶，9為潤濕墊，10為連接墊；圖4為直接預(yù)潤熒光免疫層析試劑盒示意圖，其中13為扣卡，11為上樣孔，12為視窗，8為質(zhì)控帶，7為定量帶。圖5為間接預(yù)潤熒光免疫層析試劑盒示意圖，其中13為扣卡，11為上樣孔，12為視窗，8為質(zhì)控帶，7為定量帶，14為潤濕孔。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種定量檢測心肌肌鈣蛋白T的熒光免疫層析試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案為步驟1)用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將人心肌肌鈣蛋白T的特異性抗體連接到量子點(diǎn)表面，得到抗體修飾的量子點(diǎn)，所述抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長范圍為 550 1300nm ；
步驟幻將步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)固定在標(biāo)記墊上，且標(biāo)記墊上同時(shí)固定有質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)，所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長不同，且波長范圍為550 1300·，在層析膜上分別設(shè)有定量帶和質(zhì)控帶，其中質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶固定有對(duì)應(yīng)心肌肌鈣蛋白T的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊和底板構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱熒光層析膜，底板具低熒光特性；步驟4)試紙條免疫層析后，檢測定量帶和質(zhì)控帶的熒光信號(hào)強(qiáng)度，并以質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度校正定量帶的熒光信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)心肌肌鈣蛋白T的定量檢測。本發(fā)明熒光免疫層析的原理和檢測方法為采用熒光免疫層析技術(shù)及雙抗體夾心法原理定量檢測樣品(全血、血清或血漿)中的心肌肌鈣蛋白T(cTnT)的含量。檢測時(shí)，首先滴加緩沖液將層析膜潤濕，然后將樣品加入到上樣孔中，樣品流經(jīng)標(biāo)記墊時(shí)與量子點(diǎn)標(biāo)記物相混合，并沿著層析膜向吸水墊方向毛細(xì)運(yùn)動(dòng)，分別流經(jīng)層析膜上的定量帶及質(zhì)控帶。 若樣品中含有cTnT，則與量子點(diǎn)表面的cTnT抗體相結(jié)合，當(dāng)層析至定量帶時(shí)，會(huì)被預(yù)先包被于該條帶的抗體所捕獲，從而構(gòu)成雙抗體夾心復(fù)合物。光源激發(fā)下，采用熒光定量儀可獲取定量帶和質(zhì)控帶的熒光信號(hào)強(qiáng)度，依據(jù)熒光定量儀獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而可分析出樣品中含有cTnT的濃度。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1 以共價(jià)交聯(lián)方式將抗體修飾于量子點(diǎn)并采用直接預(yù)潤免疫層析對(duì)cTnT 的定量檢測(一 )量子點(diǎn)與抗體的修飾將發(fā)射波長為650nm的量子點(diǎn)與lmg/mL的cTnT單克隆抗體混合，并在新鮮配制的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，lmg/mL)和碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC，lmg/mL)作用下室溫反應(yīng) 4 證，加入lmol/L甘氨酸封閉，并用色譜柱或?qū)游鲋蛛x純化，得到cTnT單克隆抗體修飾的量子點(diǎn)。同理得到兔IgG修飾的量子點(diǎn)。其中cTnT抗體修飾的量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長為650nm，兔IgG修飾的量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長為570nm。( 二)試劑盒的構(gòu)建以1 1的比例混合兩種量子點(diǎn)標(biāo)記物，并加入牛血清白蛋白(0. 05 2% )、蔗糖(1 15%)以及吐溫20、曲拉通X-100等表面活性劑，其中表面活性劑的含量在0.05 2%之間，隨后均勻噴涂在標(biāo)記墊上，37°C干燥后密封，4°C下保存。如圖1所示，組裝定量檢測cTnT的熒光免疫層析試紙條，由樣品墊(1)、標(biāo)記墊 O)、過濾墊(3)、層析膜0)、吸水墊( 組成，順次粘貼于黑色底板(6)上。其中，樣品墊為孔狀隔膜，選擇玻璃纖維，為待檢樣品收集區(qū)；標(biāo)記墊中含有cTnT抗體修飾的量子點(diǎn)以及兔IgG修飾的量子點(diǎn)；層析膜上包含定量帶(7)和質(zhì)控帶(8)，定量帶和質(zhì)控帶的間隔R 為3mm彡R彡8mm，且定量帶(7)固定有區(qū)別于標(biāo)記墊中cTnT抗體的另一抗原表位cTnT抗體，質(zhì)控帶(8)包被了羊抗兔抗體，位于定量帶的兩側(cè)；潤濕墊與層析膜毛細(xì)搭接1 2mm ； 連接墊分別與潤濕墊和吸水墊毛細(xì)作用接觸，起緩沖連接作用。組裝好后，按照要求切割為所需寬度，并置于扣卡(13)內(nèi)，如圖3所示，加入干燥劑封裝，與堿性緩沖液共同構(gòu)建為熒
1光免疫層析試劑盒。(三)樣品的檢測A)將cTnT抗原標(biāo)準(zhǔn)品用正常人全血作為稀釋液分別配制為Ong/mL和50ng/mL濃度；B)將步驟A)中兩種濃度的cTnT標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次按照5 0、4 1、3 2、2 3、 14和O5的比例進(jìn)行混合；C)在層析膜上滴加20μ L的緩沖液，該緩沖液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的 PH 9. O的磷酸緩沖液，層析反應(yīng)30s ；D)分別將步驟B)中配制的全血溶液(120 μ L)滴加于上樣孔(11)中，正向?qū)游龇磻?yīng) 15min ；E)置于熒光定量儀中獲取熒光信號(hào)強(qiáng)度，并繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；F)同步驟C)和步驟D)操作，對(duì)待測樣品進(jìn)行檢測，層析結(jié)束后，置于熒光定量儀內(nèi)獲取熒光信號(hào)強(qiáng)度，并依據(jù)步驟E)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析該樣品中cTnT的含量；G)輸出檢測報(bào)告。(四)結(jié)果分析結(jié)果表明，其最低檢測限為0. 05ng/mL，最低定量限為0. 17ng/mL，且批內(nèi)與批間重復(fù)性均較好，相關(guān)系數(shù)R2 > 0. 99，對(duì)心血管疾病的診斷具有參考價(jià)值。實(shí)施例2 以生物素-親和素系統(tǒng)將抗體修飾于量子點(diǎn)并采用間接預(yù)潤免疫層析對(duì)cTnT的定量檢測(一 )量子點(diǎn)與抗體的修飾首先采用pH 9. O的碳酸氫鈉緩沖液對(duì)ImL的cTnT單克隆抗體(lmg/mL)進(jìn)行充分透析，加入20 120 μ 1 二甲亞砜(DMSO)新鮮配制的N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯(NHSB， lmg/mL)，室溫避光反應(yīng)4h。加入lmol/L NH4Cl,室溫下振蕩反應(yīng)lOmin，然后將溶液置于透析袋中，過夜透析純化，并采用超濾離心管濃縮，配制為所需濃度，所得即為生物素化cTnT 單克隆抗體。將鏈霉親和素修飾的發(fā)射波長為900nm的量子點(diǎn)和生物素化的cTnT單克隆抗體按照1 3 1 12的比例混合反應(yīng)30 60min，所得即為cTnT單克隆抗體修飾的量子點(diǎn)。依據(jù)實(shí)施例1方式可制得兔IgG修飾的量子點(diǎn)。其中抗cTnT抗體修飾的量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長為900nm，兔IgG修飾的量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長為600nm。( 二)試劑盒的構(gòu)建以1 1的比例混合兩種量子點(diǎn)標(biāo)記物，并加入牛血清白蛋白(0. 05 2% )、蔗糖(1 15%)以及吐溫20、曲拉通X-100等表面活性劑，其中表面活性劑的含量在0.05 2%之間，隨后均勻噴涂在標(biāo)記墊上，37°C干燥后密封，4°C下保存。如圖2所示，組裝定量檢測cTnT的熒光免疫層析試紙條，由樣品墊⑴、標(biāo)記墊 (2)、層析膜(4)、潤濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(5)組成，順次粘貼于黑色底板(6)上。 其中，樣品墊為孔狀隔膜，選擇玻璃纖維，為待檢樣品收集區(qū)；標(biāo)記墊中含有cTnT抗體修飾的量子點(diǎn)以及兔IgG修飾的量子點(diǎn)；層析膜上包含定量帶(7)和質(zhì)控帶(8)，定量帶和質(zhì)控帶的間隔R為3mm彡R彡8mm，且定量帶(7)固定有區(qū)別于標(biāo)記墊中cTnT抗體的另一抗原表位cTnT抗體，質(zhì)控帶(8)包被了羊抗兔抗體，位于定量帶的兩側(cè)；潤濕墊與層析膜毛細(xì)搭接1 2mm ；連接墊分別與潤濕墊和吸水墊毛細(xì)作用接觸，起緩沖連接作用。組裝好后，按照要求切割為所需寬度，并置于扣卡(13)內(nèi)，如圖4所示，加入干燥劑封裝，與緩沖液共同構(gòu)建為熒光免疫層析試劑盒( 二 )試劑盒的構(gòu)建及樣品的檢測A)將cTnT抗原標(biāo)準(zhǔn)品用正常人血清作為稀釋液分別配制為Ong/mL和lOOng/mL 濃度；B)將步驟A)中兩種濃度的cTnT標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次按照5 0、4 1、3 2、2 3、 14和O5的比例進(jìn)行混合；C)在層析膜上滴加40μ L的緩沖液，該緩沖液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的 PH 9. O的磷酸緩沖液，層析反應(yīng)Imin ；D)分別將步驟B)中配制的血清溶液(IOOyL)滴加于上樣孔(11)中，層析反應(yīng) 13min ；E)置于熒光定量儀中獲取熒光信號(hào)強(qiáng)度，并繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；F)同步驟C)和步驟D)操作，對(duì)樣品進(jìn)行檢測，層析結(jié)束后，置于熒光定量儀內(nèi)獲取熒光信號(hào)強(qiáng)度，并依據(jù)步驟E)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析該樣品中cTnT的含量；G)輸出檢測報(bào)告。(四)結(jié)果分析結(jié)果表明，其最低檢測限為0. 03ng/mL，最低定量限為0. Ing/mL，批內(nèi)與批間重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，相關(guān)系數(shù)可達(dá)R2 >0. 99，能夠?yàn)樾难芗膊〉脑\斷提供參考價(jià)值。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種定量檢測心肌肌鈣蛋白T的熒光免疫層析方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1)用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將人心肌肌鈣蛋白T的特異性抗體連接到量子點(diǎn)表面，得到抗體修飾的量子點(diǎn)，所述抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長范圍為550 1300nm ；步驟幻將步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)固定在標(biāo)記墊上，且標(biāo)記墊上同時(shí)固定有質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)，所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長不同，且波長范圍為550 1300·，在層析膜上分別設(shè)有定量帶和質(zhì)控帶，其中質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶固定有對(duì)應(yīng)心肌肌鈣蛋白T的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊和底板構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱熒光層析膜，底板具低熒光特性；步驟4)試紙條免疫層析后，檢測定量帶和質(zhì)控帶的熒光信號(hào)強(qiáng)度，并以質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度校正定量帶的熒光信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)心肌肌鈣蛋白T的定量檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟1)所述抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為900nm，步驟2、所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為600nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟1)所述抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為650nm，步驟2、所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長為570nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟1)所述量子點(diǎn)為單一化合物形成的量子點(diǎn)或幾種化合物組成的復(fù)合量子點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述化合物為選自aiS、 CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP 中的任意一種或幾種，且可摻雜Cu、Mn和Hg。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述層析膜在大于 550nm時(shí)熒光很弱或不含熒光劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述底板為黑色，表面附有不干膠，且兩者均不含熒光劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述熒光免疫層析試紙條還包括能使樣品中液體與細(xì)胞分離的過濾膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟4)所述免疫層析為預(yù)潤免疫層析，其中預(yù)潤免疫層析為先以緩沖液預(yù)潤層析膜，再于樣品墊中加入樣品，當(dāng)樣品流經(jīng)定量帶和質(zhì)控帶后，進(jìn)行熒光定量檢測。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述預(yù)潤層析膜是指將緩沖液直接滴加于層析膜。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，當(dāng)所述預(yù)潤層析膜為將緩沖液間接滴加于層析膜時(shí)，步驟幻所述的熒光免疫層析試紙條還包括潤濕墊和連接墊，其中潤濕墊分別與層析膜和連接墊以毛細(xì)作用接觸，連接墊分別與潤濕墊和吸水墊以毛細(xì)作用接觸。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述堿性緩沖液為PH 7. 2 11的堿性緩沖液。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述堿性緩沖液為包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性劑的堿性緩沖液。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述堿性緩沖液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH 9. 0的磷酸緩沖液。
15.一種定量檢測心肌肌鈣蛋白T的熒光免疫層析試劑盒，包括扣卡(13)、熒光免疫層析試紙條及緩沖液，其特征在于，所述扣卡(1 為熒光免疫層析試紙條的外部殼結(jié)構(gòu)，包括上樣孔(11)、視窗(1 和潤濕孔(14)；所述熒光免疫層析試紙條包括樣品墊(1)、標(biāo)記墊(2)、層析膜(4)、潤濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(5)和底板(6)，其中樣品墊(1)、標(biāo)記墊(2)、層析膜(4)、潤濕墊(9)、連接墊(10)和吸水墊(5)搭載于底板(6)之上，樣品墊(1) 位于上樣孔(11)的下方，且連接于標(biāo)記墊0)，標(biāo)記墊(2)連接于層析膜G)，層析膜(4) 上固定有兩條質(zhì)控帶(8)和定量帶(7)，且質(zhì)控帶(8)位于定量帶(7)的兩側(cè)，層析膜(4) 位于視窗(12)的下方，層析膜(4)連接于潤濕墊(9)，且潤濕墊(9)位于潤濕孔(14)的下方，潤濕墊(9)連接于連接墊(10)，連接墊(10)連接于吸水墊(5)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的熒光免疫層析試劑盒，其特征在于，所述熒光免疫層析試紙條還包括過濾膜(3)，其中所述過濾膜C3)連接于樣品墊(1)和層析膜(4)之間，且通過毛細(xì)作用接觸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的熒光免疫層析試劑盒，其特征在于，所述扣卡(1 具有低熒光特性或不含熒光劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量檢測心肌肌鈣蛋白T(cTnT)的熒光免疫層析方法及其試劑盒。本發(fā)明的定量檢測cTnT熒光免疫層析方法是利用量子點(diǎn)的優(yōu)良熒光特性，結(jié)合雙色標(biāo)記技術(shù)及免疫層析技術(shù)，在優(yōu)化試紙條各組成部件基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)的熒光定量檢測。與常規(guī)膠體金免疫層析方法相比，本發(fā)明具有標(biāo)記穩(wěn)定性好、非特異性低、靈敏度高、線性范圍寬以及定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明試劑盒對(duì)cTnT進(jìn)行的定量檢測，可同時(shí)檢測全血、血清及血漿樣品，適用于各級(jí)醫(yī)院，特別有助于在基層醫(yī)院及診所的廣泛推廣。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102565422SQ20111045162
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者王秀利 申請(qǐng)人:深圳康美生物科技股份有限公司