專利名稱：一種小麥矮腥黑粉菌的特異性單克隆抗體及免疫熒光檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測技術，涉及一種小麥矮腥黑粉菌的特異性單克隆抗體以及免疫熒光檢測法。
背景技術：
小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kilhn，簡稱TCK)引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要的國際檢疫性病害，對小麥生產具有毀滅性危害，也是我國外來生物入侵研究的主要物種之一(王圓.小麥矮腥黑穗病菌[M].中國進境植物檢疫有害生物選編，中華人民共和國動植物檢疫局和農業部植物檢疫實驗所編，北京中國農業出版社，1997，95 98)。在小麥矮腥黑穗病流行年份引起的產量損失一般為20 50%，嚴重時可達75 90%，甚至絕產。病菌抗逆性極強，其冬孢子在土中可存活3 7年，包裹在菌癭中的冬孢子甚至可保持活力長達10年以上。此病害一旦發生，很難防治或根除，所以國際上有15個國家將其列為檢疫對象加以防范。我國從20世紀60年代開始一直將此病害列為一類對外檢疫對象。在腥黑粉菌中，TCK與其近緣種小麥網腥黑粉菌在形態學上極為相似，難于區別。傳統的病害診斷、檢測方法主要是依據病原形態學、生理學和生物化學的特性， 不但過程繁瑣、時間周期長，而且準確性差、精度不高。分子生物學手段快速、準確地鑒別小麥矮腥黑粉菌具有重要的理論意義和實用價值。1996年!^erreira等(Ferreira Μ. A.， Tooley P. W. , Hatziloukas E.etc.Isolation of a species specific mitochondrial DNA sequence for identification of Tilletia indica, the Karnal bunt of wheat fungus [J], Application Environment Microbiology, 1996,62 87 ~ 93)PCR 引進到印度腥黑穗病(Tilletia indica Mitra)的鑒定中來，他們選擇了印度腥黑粉菌線粒體DNA的一個2. 3kb的EcoR I片段進行了克隆和測序，設計的特異性引物Til/Ti4從 25種腥黑穗病菌菌株中鑒定出了印腥。另外，Smith等(Smith 0. P.，Peterson G. L. Beck R. J. etc. Development of a PCR-based method for identification of Tilletia indica, causal agent of karnal bunt of wheat[J]. Phytopathology,1996,86 115 ~ 122)通過克隆印度腥黑粉菌線粒體DNA的Dra I片段，進行了序列分析，設計了兩套寡核苷酸引物對Til7/Ml和 17/Μ2，能分別從印度腥黑粉菌中擴增出大小為825bp和IlSbp特異性片段，也實現了對印度腥黑穗病的檢測鑒定工作。2000年Frederic等(Frederick R. D.， Snyder K. Ε. , Tooley P.W.Identification and Differentiation of Tilletia indica and T. walkeri using the Polymerase Chain Reaction[J]. Phytopathology, 2000,90 951-960.)根據線粒體的差異設計了 5對針對印度腥黑粉菌的特異性引物和3對針對黑麥草腥黑粉菌的特異性引物，分別能將印度腥黑粉菌菌株和黑麥草腥粉菌病菌株從其近緣屬種中鑒別出來。張競宇等(張競宇，張正光，鄭小波，等.小麥印度腥黑穗病菌的分子檢測 [J].高技術通訊，2004，1 :31 36)利用核糖體ITS序列上的差異在Tilletia屬20個種中設計了一對特異性引物T1/T2，能將T. indica和T. walkeri從其它種中區分開來，而后又根據T. indica和T. walkeri線粒體之間的差異設計了一對特異性引物M1/M2，可以將二者區分開來，為了使反應更為靈敏，建立了套式PCR技術，以便于提供更簡單的鑒定方法。梁宏等(梁宏，彭友良，張國珍，等.腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌rDNA2IGS區的擴增及其序列分析[J].植物病理學報，2006，36 (5) =407-412)依據核糖體的IGSl區特性，設計了一對特異性引物，可以將小麥光腥黑粉菌菌株從其近緣屬種中鑒別出來。2004年高強(高強.小麥矮腥黑穗病的分子檢測[D].長沙，湖南農業大學，2004)利用RAPD技術找到了一條可以將小麥網腥黑粉菌菌株和小麥矮腥黑粉菌菌株區別于其它黑粉菌株的條帶，但是很遺憾在矮腥黑粉菌和網腥黑粉菌之間沒有找到有差異的條帶，沒能將二者分開。2006年周業琴，劉素萍等(周業琴，劉素萍，周國梁，等.水稻腥黑粉病菌的單孢檢測[J]。植物檢疫，2006，20: 38 41)應用核糖體ITS序列的通用引物Till/Til4和兩對特異性引物(Hor2/Hor9 ；Hml/ Hm5)結合建立了套式PCR技術，可以將水稻腥黑粉菌標定出來。本實驗室陳萬權、劉太國、 劉建華利用AFLP技術，找到了小麥矮腥黑粉菌的特異性片段，能將小麥矮腥黑粉菌從其近緣屬種中區分開來，該技術已經獲得國家發明專利，專利號為200510080073. 7，本實驗室的另外三個專利涉及采用ISSR的方法獲得小麥矮腥黑穗病的特異性分子標記，靈敏度分別可達到lng/25ul.分子檢測可實現準確、快速、高通量，但是需要較高的檢測設備要求如PCR儀、電泳儀等，并且，這些方法在海關的實際檢測過程中不僅耗時費工，且其準確性和可靠度在很大程度上取決于工作人員的經驗積累與技術水平。因此，有必要研發簡單易行、靈敏準確的快速診斷和檢測技術，其于鑒別病害、提高病害預測預報的準確度均具有重要的理論意義和實際應用價值。單克隆抗體技術，是由單細胞系列產生的同一種抗體蛋白，其僅與抗原分子中的一個抗原決定簇結合，故與抗原性物質反應時相對專一，不受其它物質干擾，能區別物種間的細微差異。利用該方法檢測病原菌具有諸多優點，如易于大量生產、可高通量檢測、免用標記物，較易實現病菌的快速、實時、實地檢測(Ward et al. ,2004 ；Werres & Steffens， 1994)，促使其迅速在農學、醫學和食品學中得到廣泛應用。同時，該方法涉及的儀器化程度較低、操作簡便，特別是對樣本前處理要求簡單易于推廣，國際上許多權威機構將其列為優先發展的分析技術之一。因而，單克隆抗體技術是實現田間快速檢測病原菌的好方法(Danks & Barker，2000 ;Dewey et al. , 1990 ；Ward et al.，2004)。自上世紀 80 年代以來，單克隆抗體技術已廣泛應用于一些卵菌病原菌的生物學、分類學及致病性方面的研究，諸如 Phytophthora cinnamomi (Hardham et al. , 1986 ；Gabor et al. , 1993), Pythium aphanidermatum(Estrada-Garcia et al. ,1989), 及 Aphanomyces invadans(Miles et al. , 2003),且成功石if 發了水生真菌 Salmonella sp. , Escherichia coli、Listeria monocytoenes(Bokken et al. ,2003 ；Fratamico et al. , 1998 ；Kouboves et al. ,2001 ； Leonard et al.，2004)及幾種細菌病原菌單克隆抗體檢測技術(Ipbal et al.，2000)。免疫熒光技術是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原 (或抗體)。在組織或細胞內形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發光的照射而發生明亮的熒光，可以看見熒光所在的組織細胞， 從而確定抗原或抗體的性質、種類。我們采用熒光免疫技術可以實現對二種小麥黑粉菌的
4區別。
發明內容
本發明針對小麥矮腥黑粉菌單克隆抗體檢測的空白現狀，提供一種特異性識別小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體，分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞，結合免疫熒光技術，提供一種小麥矮腥黑粉菌免疫熒光檢測方法的應用，具有特異性好、靈敏度高、操作簡便快速的優
點ο一種雜交瘤細胞株，其保藏號為=CGMCC No. 5270。一種小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa KLJHN )的單克隆抗體，由上述雜交瘤細胞株分泌而得。上述單克隆抗體在檢測小麥矮腥黑粉菌中的應用。一種檢測小麥矮腥黑粉菌的酶聯免疫試劑盒，其特征在于酶標板上直接或間接包被有上述單克隆抗體。一種小麥矮腥黑粉菌的酶聯免疫熒光檢測方法，步驟如下(1)用水溶解待測孢子5X105，加入粘片劑，涂于載玻片上，晾干，備用；(2)玻片用PBS洗2次，各5分鐘；(3)在玻片上加上述單克隆抗體作為一抗，4°C，孵育過夜；(4)復溫10分鐘，PBS洗5分鐘，3次；(5)在玻片上加PE_cy3標記的羊抗鼠IgG 二抗孵育37°C，90分鐘，PE_cy3標記的羊抗鼠IgG 1 50；(6) PBS洗5分鐘，3次，甘油緩沖液封片；(7)鏡檢，顯示邊緣黃綠色為小麥矮腥黑粉菌，暗褐色邊緣不帶亮色熒光的小麥網腥黑穗病菌。本發明以小麥矮腥黑粉菌冬孢子為抗原制得了專門分泌抗小麥矮腥黑粉菌冬孢子的單克隆抗體的雜交瘤細胞，經特異性和血清效價檢測，該雜交瘤細胞能夠產生高特異性和高效價的小麥矮腥黑粉菌冬孢子抗單克隆抗體。本發明得到的單克隆抗體可用于檢測和鑒定小麥矮腥黑粉菌冬孢子。本發明在獲得該單克隆抗體的基礎上，用熒光素標記該單克隆抗體，可實現在熒光顯微鏡下對兩種黑粉菌的區分，使技術人員可以快速鑒定小麥是否感染小麥矮腥黑粉菌，并與其他種類致病菌區分開。雜交瘤保藏信息雜交瘤細胞株名稱抗小麥矮腥黑粉菌冬孢子的單克隆抗體雜交瘤細胞株 3B5-D1。分類命名抗黑粉菌(TCK)的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。保藏號CGMCCNo. 5270。保藏日期2011年9月27日。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
圖1.本發明的單克隆抗體在免疫熒光方法檢測上的應用及結果。
具體實施例方式實驗材料小麥矮腥黑粉菌冬孢子，本實驗室有保存，可向公眾發放。實施例1 小麥矮腥黑粉菌冬孢子免疫小鼠1.稱量小麥矮腥黑粉菌冬孢子各0. 3mg (5 X IO5個孢子/ml)，加入675 μ 1生理鹽水與675μ1弗氏完全佐劑(美國sigma公司，貨號F5881)制得孢子懸液，放入注射筒中， 將2個注射筒接起來，來回推動混勻得到乳化抗原。2.取4 8周齡雌性Balb/C小鼠，取200 μ 1乳化抗原以皮下多點注射的方式進行免疫。3周后，夏孢子懸液與弗氏不完全佐劑混合乳化，3周后，以弗氏不完全佐劑(美國 sigma公司，貨號F5506)代替弗氏完全佐劑與菌液混合乳化，按照相同劑量及方式進行免疫，后續免疫均按照此方案進行。第3次加強免疫后，每次免疫后的第10天進行小鼠眼下部位采血，采用間接ELISA法測定血清的效價與特異性。3.測定血清效價時，須預先準備預包被有小麥矮腥黑粉菌冬孢子的酶標板孔，具體操作如下(1)將步驟1中的冬孢子懸液，以每孔100μ 1加入酶標板孔，放置于37°C恒溫箱中孵育16h，取出后以PBS-T (含有0. 05%的吐溫20)洗板3次，再向每孔加入200 μ 1含有
的脫脂奶粉的PBS于37°C封閉池后儲存備用。(2)將梯度稀釋的抗血清100 μ 1加入酶標板孔，放置于37°C孵育lh，而后加入用 PBS稀釋1000倍的羊抗鼠酶標二抗，37°C孵育Ih后取出洗板。(3)加入100 μ 1的單組份顯色底物(丹麥Kem-en-tec司，貨號4800H)，37°C孵育 IOmin0(4)以0. 2M的硫酸溶液中止反應，用酶標儀測定450nm吸光度值。表1為其中一次的測定數據。表 1
包被原稀釋倍數抗體稀釋倍數1000300090002700010002.5252.4291.6970.623實施例2 小麥矮腥黑粉菌雜交瘤細胞株的篩選及單克隆抗體的制備取實施例1中血清效價較高的小鼠，以實施例1中的冬孢子懸液150 μ 1加強免疫，于5天后取小鼠脾臟與骨髓瘤細胞進行細胞融合，“二步篩選法”篩選陽性克隆，同時對于檢測出特異性抗體陽性孔的細胞，及時地轉種并進行克隆化。采用“有限稀釋法”進行雜交瘤細胞的克隆化，將細胞懸浮液連續稀釋至統計上每孔加樣僅含單個細胞，接種至培養板，就可由此單個細胞繁殖形成同源性的細胞克隆，有多孔陽性時，盡可能取單克隆孔進行再次克隆化，同時轉入M孔板，繼而轉入培養瓶中進行擴大培養，直至所有細胞孔的培養上清液均為陽性。陽性細胞株的篩選方法與實施例1中所述血清效價測定方法基本相同。唯一不同之處在于將實施例1中梯度稀釋的抗血清用陽性細胞株的培養液上清進行替換。將最終選得的陽性細胞株(保藏號CGMCC No. 5270)，擴大培養后，以體內誘生法制備腹水。將制備的腹水中單克隆抗體經鹽析沉淀后以蛋白A親和柱層析純化后備用。取與小麥矮腥黑粉菌冬孢子同類的小麥網腥黑穗病菌冬孢子、小麥光腥黑穗病菌冬孢子等，分別按照實施1的方法包被酶標板，用于包被的冬孢子的濃度為0. 5mg/ml，將純化的單克隆抗體稀釋后加入酶標板孔，進行ELISA測定。根據吸光度值結果判定所篩選的單克隆抗體對這幾種孢子的交叉反應。由表2可知，所制抗體對于小麥矮腥黑粉菌冬孢子OD值較高(0D > 0. 6，其余均較低(0D < 0. 6)。說明本發明制備的單克隆抗體是對小麥矮腥黑粉菌的特異性抗體，可用于鑒別診斷小麥矮腥黑粉菌。表權利要求
1.一種雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCC No. 5270。
2.一種小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa KLJHN )的單克隆抗體，由權利要求 1所述的雜交瘤細胞株分泌的得。
3.權利要求2所述的單克隆抗體在檢測小麥矮腥黑粉菌中的應用。
4.一種檢測小麥矮腥黑粉菌的酶聯免疫試劑盒，其特征在于酶標板上直接或間接包被有權利要求2所述的單克隆抗體。
5.一種小麥矮腥黑粉菌的酶聯免疫熒光檢測方法，步驟如下(1)用水溶解待測孢子5X IO5孢子/毫升，加入粘片劑，涂于載玻片上，晾干，備用；(2)玻片用PBS洗2次，各5分鐘；(3)在玻片上加權利要求2所述的單克隆抗體作為一抗，4°C，孵育過夜；(4)復溫10分鐘，PBS洗5分鐘，3次；(5)在玻片上加PE-cy3標記的羊抗鼠IgG二抗孵育37°C，90分鐘，PE-cy3標記的羊抗鼠 IgG 1 50 ；(6)PBS洗5分鐘，3次，甘油緩沖液封片；(7)鏡檢，顯示邊緣黃綠色為小麥矮腥黑粉菌，暗褐色邊緣不帶亮色熒光的為小麥網腥黑穗病菌。
全文摘要
本發明“一種小麥矮腥黑粉菌的特異性單克隆抗體及免疫熒光檢測方法”，屬于生物檢測技術。本發明提供了分泌小麥矮腥黑粉菌的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞CGMCC No.5270，以及該單克隆抗體在檢測和鑒別小麥矮腥黑粉菌中的應用，特別是采用該單克隆抗體的試劑盒以及熒光檢測方法。
文檔編號G01N33/577GK102399753SQ20111042471
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者劉博 , 劉太國, 陳萬權, 高利 申請人:中國農業科學院植物保護研究所