專利名稱：一種熱帶假絲酵母菌pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及一種熱帶假絲酵母菌菌株PCR檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
近年來，由于廣譜抗生素的廣泛應用，腫瘤化療、器官移植的開展以及免疫力低下患者尤其是艾滋病患者的增多，由真菌尤其是念珠菌引起的深部感染機會日益增多。念珠菌屬于真菌界-半知菌亞門-芽孢菌綱-隱球酵母目-隱球酵母科。是雙相型單細胞酵母菌。念珠菌是一種芽生的酵母狀真菌，一種典型的條件致病菌。已知可以致病的常見念珠菌有白念(Candida albican)、熱帶(Candida tropicalis)、近平滑 (Candida, parapsilosis)、胃· (Candida krusei)(Candida stellatoidea)、_iii 蒙(Candida guilliermondii)和光滑念珠菌(Candida, glabrata)等八種在人體中，無癥狀時常表現為酵母細胞型；侵犯組織和出現癥狀時常表現菌絲型。念珠菌是一種腐物寄生菌，廣泛存在于自然界。是人體正常菌群之一，平時主要生存于人體的口腔、皮膚、粘膜、消化道、陰道及其他臟器中。正常人群白色的帶菌率可高達 40%;從陰道粘膜分離出來的念珠菌85% 90%為白色，而白色念珠菌(Candida albican) 的致病性最強。白色念珠菌(簡稱白念，Candida albicans, CA)、熱帶假絲酵母菌(簡稱熱帶， Candida tropicalis, CT)和光滑假絲酵母菌(簡稱光滑，Candida glabrata, CG)是其中的主要致病菌，其分布廣泛，感染類型多樣，已成為臨床抗感染治療的難點。目前臨床應用的念珠菌的檢測方法有以下幾種常規涂片鏡檢是最基本的細菌學檢查方法。其優點是簡便、快速和價廉，當天出結果；缺點是敏感性低，特異性差，無法辨別死菌與活菌。通常需用科瑪嘉念珠菌顯色培養基進一步證實。沙氏培養基是念珠菌感染診斷較為常用的培養基，但臨床上念珠菌感染癥有的為混合感染，不同的念珠菌在沙氏培養基上生長均呈現白色菌落，要進一步鑒定不同的菌種， 有時還必須要做念珠菌的發酵試驗和芽管試驗，給實驗室的診斷帶來很大的不便。科瑪嘉(CHROMagar)培養基培養法，該培養基含有特殊顯色物質，無需通過任何儀器，僅通過觀察菌落顏色即能在M 48小時(大多為48小時，30 37°C )用肉眼對念珠菌等進行定性和定量分析。但是培養所用的時間相對較長，不利于快速診斷。另外，隨著儀器分析技術的進步和計算機的廣泛應用，微生物菌種鑒定逐漸由傳統的形態學觀察和人工生理生化實驗鑒定發展進入了基于儀器自動化分析的鑒定系統階段。如Biolog微生物自動分析系統、API 20C、ATB 32C、VITEK YBC和API Candid系統等。 這些快速鑒定系統大多數是應用于臨床酵母菌的鑒定，如假絲酵母屬、隱球酵母屬等，針對性較強，能鑒定的酵母菌種類較少，其中API 20C能鑒定的酵母菌種類為37種，ATB 32C能鑒定的酵母菌種類為69種。雖然，目前我國已累計引進Biolog微生物自動分析系統有100
3余臺，但主要是應用于細菌的鑒定分析，應用于酵母菌鑒定的研究成果很少。乳膠凝集反應、放免測定以及酶聯免疫吸附測定，也可以作為念珠菌的輔助檢測手段，但它們的敏感性和特異性均較差。RAPD分型法，又稱任意引物聚合酶鏈反應(Arbitrarily primed PCR)，AP-PCR)， 是一種以PCR為基礎揭示基因組多態性的方法。該法采用隨機合成的單個寡核苷酸引物。 在未知模板DNA序列情況下，以低退火溫度與基因DNA兩條鏈的多個非特異位點通過錯配而復性，擴增產物經瓊脂凝膠電泳分離產生指紋圖譜。由于不同種細菌或同種細菌的不同菌株與引物結合的退火點的親和性、數量和位置不同，所產生的指紋圖譜均有各自的特征， 以此反映種系發育過程中的相互聯系及不同克隆間的差異。該方法目前在日常醫院感染的監測與預防控制中占主導地位，但存在分辨率低、 影響因素多、重復性較差等諸多不足。
發明內容
本發明目的是采用聚合酶鏈式反應及分子信標熒光探針技術對熱帶假絲酵母菌基因中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷熱帶假絲酵母菌的存在，對熱帶假絲酵母菌感染的輔助診斷。本發明的技術方案為提供一種熱帶假絲酵母菌核酸檢測試劑盒，包括PCR反應液，其特征在于，所述PCR反應液包括引物和熒光探針，所述引物分為上游引物A和下游引物A;所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述熒光探針A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。優選的，所述試劑盒還包括DNA提取液，dNTPs、tap酶、UNG酶、陽性對照、陰性對照。優選的，所述dNTPs 包括 dATP、dCTP、dGTP、dUTP。優選的，所述DNA提取液包括聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇、正辛酸， 所述聚乙二醇辛基苯基醚的質量百分數為2%，所述乙基苯基聚乙二醇的質量百分數為 1%，所述正辛酸的摩爾濃度為0. 04M。優選的，所述試劑盒還包括提取固形物，所述提取固形物為直徑0. 5mm和1. Omm兩種玻璃珠，按質量配比9 1比例配制出。優選的，所述試劑盒引入了一個人工構建的neo內參照系統用于避免檢測結果假陰性，所述內參照系統包括上游引物B核苷酸序列SEQ IDN0. 4 ；下游引物B核苷酸序列 SEQ ID NO. 5 ；熒光探針B核苷酸序列=SEQ ID NO. 6。優選的，所述熒光探針的5’端標記FAM熒光基團，3’端標記BHQ淬滅基團。本發明的有益效果為利用熱帶假絲酵母菌基因中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷熱帶假絲酵母菌的存在。本試劑盒具有DNA提取效果好，操作簡單、耗時短O 3小時)，結果客觀可靠，儀器自動收集和分析數據。最低檢出限為1. 0 X IO2Copies/ mL，具有靈敏度高和特異性高等優點。使用了大腸桿菌新霉素基因作為內參照基因，它在熱帶假絲酵母菌基因組和人類基因組中均無同源基因，因此可作為內參照以檢測每次PCR反應中是否有PCR抑制物存在，從而確保PCR結果的可信性。
圖1 :CT基因靈敏度檢測結果圖；圖2 =CT基因精密度結果圖；圖3 =CT基因特異性結果圖。
具體實施例方式本發明采用聚合酶鏈式反應(PCR)及分子信標熒光探針(Molec μ LA. r beacon) 技術對熱帶假絲酵母菌(簡稱熱帶，Candida tropicalis,CT)基因中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷熱帶假絲酵母菌的存在。從而指導臨床醫生對熱帶假絲酵母菌感染的病人用藥，幫助預后判斷。上述高保守特異性核酸序列如SEQ ID NO. 7所示，其核苷酸序列如下GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATC TTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCCCGGG TTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAACGTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATC CAAAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTG AACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。內參照原理試劑盒設置了內參照，該內參照為含大腸埃希氏菌新霉素基因(neo 基因)的質粒，neo基因在念珠菌基因組和人類基因組中均無同源基因，因此可作為內參照以檢測每次PCR反應中是否有PCR抑制物存在，從而確保PCR結果的可信性。當內參照結果為陽時，表示PCR反應體系以及操作正常；因此當目的基因結果為陰時，內參照結果為陽就顯得十分重要了 ；但當目的基因結果為陽時，內參照的擴增曲線較目的基因擴增曲線要推遲，或是內參照結果為陰都是正常的；然而目的基因和內參照基因結果都為陰時，該實驗視為無效，需再重復。陽性對照原理每次試驗都需同時做陽性對照。陽性對照結果為陽，表明對靶基因的檢測系統是正常的；而當結果為陰時，表明該次實驗無效，需重復。陰性對照原理為證明有否污染存在，每次試驗也需同時做陰性對照。陰性對照結果為陰，表明本次試驗無污染；如結果為陽，則表明該次實驗無效，需重復。實施例1本發明試劑盒的組成主要原材料來源及制備方法Tris 分析純，有合格資質的供應廠商的產品，含量99.7%，紅外合格，pH(5% 水)10. 3-10. 9，水份0. 3%，熔點167-171°c，吸收系統合格，雜質最高含量合格。MgCl2 分析純，有合格資質的供應廠商的產品，含量不少于99%，水溶液反應合格，雜質最高含量合格。(MgC12極易吸潮，啟用新瓶后放于干燥器下保存)。EDTA 分析純，有合格資質的供應廠商的產品，為白色結晶狀粉末，溶于水，溶液呈酸性，難溶于醇，含量不少于99. 5 %，水溶液反應合格，絡合力試驗合格，雜質最高含量合格。HCl 分析純，北京化學試劑廠產品或有合格資質的供應廠商的產品。純化水購買樂百氏桶裝純凈水，然后經Millipore公司的Milli-Q Biocel型純水機處理，電阻率16 18ΜΩ。引物和探針本發明所應用的引物、探針均委托Sigma和Biosearch公司合成，并經Sigma質檢合格(含質譜鑒定)；其中CT基因保守序列最優引物、探針序列組合如下5， -GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT-3，；所述下游引物A的核苷酸序列為5， -ATTGCTCAACACCAAACCCG-3‘；所述熒光探針A的核苷酸序列為5’ -FAM-ACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCG-BHQ-3，。其中neo內參照系統的引物、探針序列組合如下上游引物B (SEQ ID NO. 4) :5，-GACTAAACTGGCTGACGG-3，；下游引物B (SEQ ID NO. 5) :5，-GTATTTCGTCTCGCTCAG-3，；熒光探針B (SEQ ID NO. 6) 5，-TEXrd-ATGCCTCTTCCGA-BHQ-3，。用于PCR反應的引物，紫外檢測結果A260nm:A280nm彡1.5可視為合格引物。_20°C保存。熒光探針A 在寡核苷酸5’端標記FAM，3，端標記BHQ，紫外檢測結果A260nm A280nm彡1. 5，在FAM熒光素的激發波長494nm處有吸收峰，-20°C保存。neo熒光探針B:在寡核苷酸5’端標記TE&d，3’端標記BHQ，紫外檢測結果 A260nm :A280nm彡1. 5，在TE)(rd熒光素的激發波長610nm處有吸收峰。_20°C保存。dNTPs :dATP、dCTP、dGTP、dUTP購自上海宏誼公司，或其他有合格資質的供應商， 并經出廠檢測合格；按照本公司相應的質量標準進行檢測合格后使用。根據供應商質量標準為HPLC純，無DNase和RNase污染。_20°C保存。Taq酶本產品在研制開發及生產過程中，所應用的Taq酶購自大連TaKaRa公司， 或其他有合格資質的供應商。濃度5υ/μ 1，含10XPCRBuffer、25mmOl/LMgCl2，根據供應商質量標準本品具有DNA聚合酶活性，無3’ 一5’核酸外切酶活性及核酸內切酶活性；具熱穩定性，94V保溫1小時后仍保持50 %活性。-20 V保存。UNG酶本產品在研制開發及生產過程中，所應用的UNG酶購自Promega公司或其他有合格資質的供應商，按照本公司相應的質量標準進行檢測合格后使用。濃度> lU/μ 1， 根據供應商質量標準本品具有尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性， IUUNG在50°C 2min能降解至少IO3Copies含dU的模板，使其不能產生擴增產物。_20°C保存。基礎試劑配制10 X濃縮清洗液A 配制0. 2N NaOH, 5mL/管分裝；10 X濃縮清洗液B 配制10 X TE緩沖液(ρΗ8· 0)，IOmL/管分裝；DNA 提取液按"Triton X-100 2%, NP-40 1 %、正辛酸0. 04M濃度配制成DNA提取液，充分混勻后按5mL/管分裝。提取固形物取直徑為0. 5mm和1. Omm兩種玻璃珠，按質量配比約為0.5mm LOmm = 9 1比例配制出提取固形物，每管約0. 15g分裝。IOmmol/L iTris-HCl溶液的配制稱取0. 12114g的Tris，加入已含60mL蒸餾水的 IOOmL燒杯中，振搖使之充分溶解，移入IOOmL的容量瓶中，用IOmL蒸餾水洗滌燒杯3次并移入容量瓶中，用HCl調pH值為8. 0，最后用蒸餾水定容到IOOmL,翻轉容量瓶使之充分混勻。移入試劑瓶并標記名稱、濃度、配置時間。dNIPs的配制如表1。表 權利要求
1.一種熱帶假絲酵母菌PCR檢測試劑盒，包括PCR反應液，其特征在于，所述PCR反應液包括引物和熒光探針，所述引物分為上游引物A和下游引物A ；所述上游引物A的核苷酸序列為5’ -GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT-3，；所述下游引物A的核苷酸序列為5' -ATTGCTCAACACCAAACCCG-3‘；所述熒光探針A的核苷酸序列為5’ -FAM-ACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCG-BHQ-3’。
2.按權利要求1所述的熱帶假絲酵母菌PCR檢測試劑盒，其特征在于，還包括DNA提取液，dNTPs、tap酶、UNG酶、陽性對照、陰性對照。
3.按權利要求2所述的熱帶假絲酵母菌PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述dNIPs包括 dATP、dCTP、dGTP、dUTP。
4.按權利要求2所述的熱帶假絲酵母菌PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA提取液包括聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇、正辛酸，所述聚乙二醇辛基苯基醚的質量百分數為2%，所述乙基苯基聚乙二醇的質量百分數為1%，所述正辛酸的摩爾濃度為 0. 04M。
5.按權利要求1所述的熱帶假絲酵母菌PCR檢測試劑盒，其特征在于，還包括提取固形物，所述提取固形物為直徑0.5mm和1.0mm兩種玻璃珠，按質量配比9 1比例配制出。
6.按權利要求1所述的熱帶假絲酵母菌PCR檢測試劑盒，其特征在于，引入了一個人工構建的neo內參照系統用于避免檢測結果假陰性，所述內參照系統的引物、探針序列組合如下上游引物 B :5’ -GACTAAACTGGCTGACGG-3，；下游引物 B :5’ -GTATTTCGTCTCGCTCAG-3，；熒光探針 B :5，-TEXrd-ATGCCTCTTCCGA-BHQ-S'
7.按權利要求1所述的熱帶假絲酵母菌PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光探針的 5’端標記FAM熒光基團，3’端標記BHQ淬滅基團。
8.一種熱帶假絲酵母菌PCR檢測方法，其特征在于，其中PCR擴增的靶序列如SEQ ID NO. 7，PCR擴增所用引物為上游引物A序列如SEQ ID NO. 1，下游引物A序列如SEQ ID NO. 2，熒光探針A序列如=SEQ ID NO. 3。
全文摘要
本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及一種熱帶假絲酵母菌PCR檢測試劑盒。本發明的技術方案為提供一種熱帶假絲酵母菌PCR檢測試劑盒，包括PCR反應液，所述PCR反應液包括引物和熒光探針A，所述引物分為上游引物A和下游引物A；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述熒光探針A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本試劑盒具有靈敏度和特異性高、穩定、及時、操作方便等優點。
文檔編號G01N21/64GK102409107SQ20111041670
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月13日 優先權日2011年12月13日
發明者何華東, 黃發平 申請人:泰普生物科學(中國)有限公司