專利名稱：一種血漿中利可君濃度的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種血漿中利可君濃度的檢測方法，特別涉及一種采用液相色譜-質譜聯用技術分析利可君濃度的方法。
背景技術：
利可君為升白細胞藥，用于預防和治療各種原因引起的白細胞減少、再生障礙性貧血及血小板減少癥等，化學名為:2- ( α -苯基-α -乙氧羰基-甲基)噻唑烷-4-羧酸。對利可君的藥理活性研究已有許多，但是生物樣品中利可君的濃度測定及其藥代動力學研究報道卻沒有。另外，利可君存在3個手性中心，有多個手性中心，因此，提供一種可靠的可檢測所有這些異構體的方法就成為積極困難的事情。
發明內容
本發明要解決技術問題是，克服現有技術的缺陷，提供一種簡單、快速、靈敏的測定血漿中利可君血藥濃度的方法。本發明提供了一種血漿中利可君濃度的檢測方法，包含以下步驟:
(a)對血漿樣品進行前處理:取待測樣品，加入內標和高氯酸進行蛋白沉淀，并取上清液，所述的內標為替硝唑，其用量為使樣品中含替硝唑濃度為100ng-lmg/ml，所述的高氯酸溶液的用量為每Iml樣品中加入高氯酸重量為10-100mg。
(b)采用液相色譜-質譜(LC-MS)聯用儀測定上述上清液中利可君的濃度，其中，LC-MS聯用的色譜條件是:色譜柱是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；內標法，以替硝唑作為內標；流動相為乙腈-水-冰乙酸的混合液，其體積比例范圍為20±1:80±5:0.3±0.03) ；LC-MS聯用的質譜條件是:離子源為ESI離子源，正離子檢測。所述步驟(a)中高氯酸可預先配置成水溶液，濃度為1_10%，優選為3-7%，最優選為4% ο所述步驟(a)中替硝唑可預先配置成水溶液，濃度為1.0-1.5 μ g/ml。 所述的分析血漿中利可君含量的方的檢測方法，色譜條件流動相由乙腈-水-冰乙酸組成，其配比為乙腈-水-冰乙酸=20:80:0.3.
所述的的檢測方法，其特征在于，步驟LC-MS聯用質譜條件中，掃描方式為選擇性離子檢測。上述色譜條件為典型條件，實際應用中根據所使用儀器的不同特點，可以對各參數做出適當調整，以期獲得最佳的效果。本發明建立了簡單、靈敏、快速的LC-MS法測定血漿中利可君的濃度，其高靈敏度、較小的樣品需求量以及相對較短的分析時間使得本發明方法適用于利可君的臨床前和臨床藥代代動力學研究，利用該方法，可以很好的分離檢測利可君及其非對映異構體。
圖1為利可君的結構式。圖2A為利可君的質譜全掃描圖。圖2B為替硝唑的質譜全掃描圖。圖3A-3C為實施例一中利可君和替硝唑的總離子流色譜圖，I代表替硝唑的色譜峰，I1、II1、IV和V分別代表利可君的四種非對映異構體；其中:圖3A代表空白血漿；圖3B代表空白血漿中加入利可君和內標替硝唑；圖3C代表血漿樣品。圖4A-4C為另一實施例中利可君和替硝唑的總離子流色譜圖，I代表替硝唑的色譜峰，I1、II1、IV和V分別代表利可君的四種非對映異構體；其中:圖4A代表空白血漿；圖4B代表空白血漿中加入利可君和內標替硝唑；圖4C代表血漿樣品。
具體實施例方式實施例一
I儀器、材料與試劑
1.1儀器LC-MS聯用儀(島津LC-MS2020)
1.2樣品與試劑利可君(純度為> 99.5%);替硝唑(純度> 99.8%)，購自中國藥品生物制品檢定所；其他化學試劑均為分析純。2實驗部分
2.1血漿樣品前處理取靜脈注射給藥后采集的大鼠血漿樣品IOOyL置于1.5mL塑料Ep管中，加入30 μ L內標溶液(1140ng/mL)，渦旋混合30s，再加入100 μ L4%高氯酸溶液，渦旋混合3min, 4°C條件下20000rpm離心IOmin兩次,取上清液10 μ L進行LC-MS分析。2.2 LC-MS 分析條件
2.2.1 色譜條件色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (2.l*150mm,5-Micro);流動相:乙腈:水:冰乙酸=20;80;0.3 ;柱溫:30°C ;流速:0-4min為0.3mL/min, 4-5min由0.3mL/min線性升至0.6mL/min,維持0.6mL/min至分析時間結束；進樣量:
10μ L02.2.2質譜條件ESI離子源，正離子檢測；掃描方式:選擇性離子檢測；定量分析的離子分別為:m/z 296.2 (利可君)和m/z 248.1 (替硝唑，內標)。2.3 LC-MS 分析結果
對樣品利可君和內標替硝唑的質譜掃描圖參見圖2A和圖2B。3方法確證
3.1專屬性本方法中待測物與內標的專屬性以標準曲線中一個濃度點與同法操作的空白血漿進行對比來進行評價。空白血漿、空白血漿中加入利可君和內標替硝唑、血漿樣品的色譜圖分別見圖3A、3B和3C，從圖中可以看出，空白血漿中的內源性物質不干擾利可君和內標的測定，內標替硝唑的保留時間為3.2min,利可君四個非對映異構體的保留時間分別為9.5min、10.6min、
11.9min 和 13.2min。3.2線性與靈敏度利可君的標準系列工作液 由乙腈配制。取空白血漿lOOyL，加入內標溶液30 μ L，再依次加入利可君標準系列工作液指定體積，配制成相當于血漿濃度為50、100、200、400、1000、2000、5000 和 10000ng/mL 的血漿樣品，按 2.I 項下操作，進行 LC-MS分析，求得直線回歸方程，即為工作曲線。其測定和分析結果見表I。表I利可君的標準曲線
權利要求
1.一種血漿中利可君濃度的檢測方法，其特征在于包含以下步驟: (a)對血漿樣品進行前處理:取待測樣品，加入內標和高氯酸進行蛋白沉淀，并取上清液，所述的內標為替硝唑，其用量為使樣品中含替硝唑濃度為100ng-lmg/ml，所述的高氯酸溶液的用量為每Iml樣品中加入高氯酸重量為10-100mg。
2.(b)采用LC-MS聯用儀測定上述上清液中利可君的濃度，其中，LC-MS聯用的色譜條件是:色譜柱是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；內標法，以替硝唑作為內標；流動相為乙腈-7K -冰乙酸的混合液，其比例范圍為20 ± 1:80 ± 5:0.3 ± 0.03 );LC-MS聯用的質譜條件是:離子源為ESI離子源，正離子檢測。
3.根據權利要求1所述的的檢測方法，其特征在于，步驟(a)中高氯酸可預先配置成水溶液，濃度為1-10%，優選為3-7%，最優選為4%。
4.根據權利要求1所述的的檢測方法，其特征在于，步驟(a)中替硝唑可預先配置成水溶液，濃度為l.0-l.Syg/ml。
5.根據權利要求1所述的分析血漿中利可君含量的方的檢測方法，其特征在于，所述的色譜條件流動相由乙腈-水-冰乙酸組成，其體積比為乙腈-水-冰乙酸=20:80:0.3。
6.根據權利要求1所述的的檢測方法，其特征在于，LC-MS聯用質譜條件中，掃描方式為選 擇性離子檢測。
全文摘要
本發明提供了一種血漿中利可君濃度的檢測方法。該方法將血漿中利可君與替硝唑經高氯酸沉淀蛋白后采用LC-MS法進行分離測定。本發明的方法經方法學驗證準確可靠，可用于血漿中利可君的濃度測定。
文檔編號G01N30/88GK103226142SQ20111040501
公開日2013年7月31日 申請日期2012年1月30日 優先權日2012年1月30日
發明者謝少斐, 韓亮, 范婧, 霍立茹, 楊曉兵, 余麗麗, 曾瀅 申請人:南京長澳醫藥科技有限公司