作為心血管病的標志和治療靶的1l1rl-1的制作方法

專利名稱：作為心血管病的標志和治療靶的1l1rl-1的制作方法
作為心血管病的標志和治療靶的1L1RL-1
本申請是發明人于2003年5月9日提交的題為“作為心血管病的標志和治療靶的 1L1RL-1”的中國專利申請03816298. 9的分案申請。發明領域
本發明涉及診斷和治療心血管疾病的方法和組合物。更特別地，本發明涉及可用于治療心血管疾病的分離的分子，所述心血管疾病包括心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化,和心力衰竭。
發明背景
在發達國家中，盡管在心血管疾病的治療上已經取得了很大進展，但是心血管疾病仍然是疾病和死亡的最常見的原因。因此，心血管疾病如心肌梗塞和中風的預防和治療已經成為主要為公共健康服務的一個重要領域。目前已經認識到了幾個心血管疾病發病的危險因素，并且已經在臨床上廣泛用于發現高危患者。這種篩選檢查包括評估總的和HDL 膽固醇水平。但是，許多明顯是低度到中度危險的患者也會發生心血管疾病，而辨別這類患者的能力還非常有限。而且，累積數據表明在不同的患者人群中，對具有患心血管疾病危險的患者和已患有心血管疾病的患者進行的預防性和治療性治療的有益效果的程度也有所不同。然而，目前還缺乏用于確定某種治療效果較好還是效果較差的診斷性檢測數據。
發明簡述
本發明提供了用于診斷和治療心血管疾病的方法和組合物。更特別地，本發明識別了基因，當心臟細胞受到機械誘導而變形的時候該基因在細胞中受到正調控。基于這個發現，本發明的分子可用于治療心血管(包括血管)疾病，包括心臟肥大，心肌梗塞，中風， 動脈硬化，和心力衰竭。
除此之外，還提供了使用這些分子診斷任何上述心血管(血管)疾病的方法。
還進一步提供了用于制備治療上述疾病的治療劑的組合物。
因此本發明在幾個方面包括了多肽，編碼這些多肽的分離核酸，上述分子的功能性修飾物和變體，上述分子的有用片段，以及相關的治療方法和診斷方法。
根據本發明的一個方面，提供了一種診斷由核酸分子的異常表達及其表達產物的異常(或上述分子的獨特片段的異常)表征的疾病的方法。該方法包括使來自患者的生物樣品與試劑接觸，所述試劑特異地與所述核酸分子，其表達產物，或者其表達產物的片段結合，檢測所結合試劑的量，由此確定所述核酸分子的表達或者其表達產物是否有異常，表達有異常即診斷為疾病，其中所述核酸分子為白介素ι受體樣1(IL1RL-1，也稱為T1/ST2， ST2，和Fit-1，SEQ ID NO :1和2是可溶形式，SEQ ID NO :3和4是膜結合形式)。術語 IL1RL-1，T1/ST2，ST2和Fit-I在本說明書中可以互換使用。在一些實施方案中，所述疾病是選自下組的心血管疾病心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。在一個實施方案中，所述疾病是心臟肥大。在另一個實施方案中，所述疾病是心力衰竭。在特定的實施方案中，生物樣品包括生物活組織切片樣品，以及生物流體例如血液/血清。
根據本發明的另一個方面，提供了確定患者的心血管疾病階段(例如退化，發展或者發作)的方法，其中所述階段由核酸分子的異常表達及其表達產物的異常(或上述分子的特定片段的異常)表征。所述方法包括監控患者樣品的選自下組的參數(i) ILlRL-I 核酸分子(或其獨特片段)，( )由ILlRL-I核酸編碼的多肽，(iii)由該多肽衍生的肽 (或其獨特片段)，以及(iv)可選擇性結合所述多肽或肽(或其獨特片段)的抗體，這些參數可以確定患者的所述心血管疾病(例如退化，發展或者發作)所處的階段。在一些實施方案中，所述樣品是任何前述實施方案中所述的生物流體或是組織。在特定的實施方案中， 監控的步驟包括使所述樣品與一種選自下組的可檢測到的試劑接觸(a)可在嚴謹條件下與(i)所述核酸分子選擇性雜交的分離的核酸分子，(b)可選擇性地與(ii)所述多肽，或者(iii)所述的肽結合的抗體，以及(c)可選擇性地與(iv)的抗體結合的多肽或肽。所述抗體，多肽，肽，或核酸都可以用可檢測到的標記例如放射性標記或酶進行標記。在另一個實施方案中，所述方法包括監控(檢測)樣品中的肽。在另一個實施方案中，對樣品的監控持續一段時間。
根據本發明的一個方面，提供了一種試劑盒。所述試劑盒包括容器，其中含有可以選擇性地與任何上述ILlRL-I分離核酸，或其表達產物結合的試劑，以及對照，用于與所述試劑與任意上述分離核酸或其表達產物的結合的測量值進行比較。在一些實施方案中，用于與測量值進行比較的對照具有預先確定的值。在特定的實施方案中，對照包括任意上述分離核酸的表達產物的表位。
根據本發明的一個方面，提供了一種治療心血管疾病的方法。所述方法包括給需要這種治療的患者施用有效量的可治療心血管疾病的ILlRL-I分子。在特定的實施方案中，所述心血管疾病選自心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。在一些實施方案中，所述方法進一步包括同時給予選自下組的制劑抗炎制劑，抗血栓形成制劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑，能與細胞粘附分子結合并能抑制白細胞與這些分子接觸的能力的制劑，鈣通道阻斷劑，β -腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2抑制劑，或者血管緊張素系統抑制劑。
根據本發明的另一個方面，提供了一種治療心臟肥大的方法。所述方法包括給需要這種治療的患者施用有效量的可治療患者的心臟肥大的制劑以增加ILlRL-I核酸分子或者其表達產物的表達。
根據本發明的另一個方面，提供了一種治療患者以減少患者發生心血管疾病的危險性的方法。所述方法包括給ILlRL-I分子表達水平異常的患者施用有效量的能減少心血管疾病危險性，或者降低患者在未來發生心血管疾病的危險性的制劑，其中所述制劑是抗炎制劑，抗血栓形成制劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑，能與細胞粘附分子結合并能抑制白細胞與這些分子接觸的能力的制劑，鈣通道阻斷劑，β -腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2抑制劑，或者血管緊張素系統抑制劑。在特定的實施方案中，所述患者沒有需要用所述制劑治療的其它癥狀。
根據本發明的一個方面，提供了一種鑒定可用于治療心血管疾病的候選試劑的方法。所述方法包括在不存在候選試劑的條件下測定心臟細胞或組織中ILlRL-I分子的表達，其中所述心臟細胞或組織中ILlRL-I分子的為第一種表達量，使所述心臟細胞或組織與候選試劑接觸，測定所述ILlRL-I分子表達的檢測量，其中在存在候選試劑的條件下表達的檢測量與第一種表達量相比有所降低，表明該候選試劑可用于治療心血管疾病。在重要的實施方案中，ILlRL-I分子是任一個SEQ ID N0:l_4所述的分子。在特定的實施方案中，所述心血管疾病選自心臟肥大(例如非適應性肥大)，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
根據本發明的另一個方面，提供了一種藥物組合物。所述藥物組合物包括一種試劑，所述試劑包括制藥有效量的可治療心血管疾病的ILlRL-I分離核酸分子(SEQ ID NO=I 或3)，或其表達產物(例如SEQ ID NO :2或4)，以及藥學可接受的載體。在特定的實施方案中，所述心血管疾病選自心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
根據本發明的再一方面，還提供了制備用于治療心血管疾病的藥物的方法。所述藥物優選包括有效量的至少一種上述分子或組合物。
根據本發明的另一個方面，提供了固相核酸分子陣列。所述陣列基本由一組核酸分子，其表達產物，或其片段(核酸片段或者多肽分子片段)組成，其中至少一種ILlRL-I 分子(包括其表達產物，或其片段)固定于固相底物之上。在一些實施方案中，固相陣列進一步包括至少一種對照核酸分子。
在特定的實施方案中，所述固相底物包括選自下組的物質玻璃，硅，硅酸鋁，硅酸硼，金屬氧化物例如氧化鋁和氧化鎳，各種粘土，硝化纖維素，和尼龍。優選所述底物是玻璃。在一些實施方案中，所述核酸分子通過共價結合固定于固體底物之上。
根據本發明的另一個方面，提供了評價患者在用能減少心血管疾病危險性的試劑進行的治療中獲益的可能性的方法。在重要的實施方案中，所述試劑選自抗炎制劑，抗血栓形成制劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白Ilb/IIIa 受體抑制劑，能與細胞粘附分子結合并能抑制白細胞與這些分子接觸的能力的制劑，鈣通道阻斷劑，β-腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2抑制劑，或者血管緊張素系統抑制劑。所述方法包括獲得患者的ILlRL-I分子水平，將所述ILlRL-I分子水平與心血管疾病診斷特異性的預定值相比較。所述ILlRL-I分子水平與預定值的比較可以表明患者是否通過用所述試劑進行的治療而獲益。在特定的實施方案中，心血管疾病診斷特異性的預定值是多個預定標記物水平范圍，所述的比較步驟包括確定所述患者的水平落在哪個預定標記物水平范圍中。所述心血管疾病可以是選自心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭中的疾病。
本發明的另一個方面提供了一種預測心血管疾病結果的方法。所述方法包括獲得患者的ILlRL-I分子水平，將所述ILlRL-I分子水平與心血管疾病的預測結果特異性的預定值相比較。所述ILlRL-I分子水平與預定值的比較可以表明患者是會具有好的/正的結果還是會具有壞的/負的結果。在一些實施方案中高水平的ILlRL-I分子可能表示負的結果，而低水平可能表示正的結果。在特定的實施方案中，心血管疾病的預測結果特異性的預定值是多個預定標記物水平范圍，所述的比較步驟包括確定所述患者的水平落在哪個預定標記物水平范圍中。所述心血管疾病可以是選自心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭中的疾病。
ILlRL-I分子的任何序列都可以用于本發明的任何方面和任何實施方案中。例如， 除了如SEQ ID NO :1和3所述的核苷酸序列之外，還包括如SEQ ID NO 5和7所述的核苷酸序列。除了包括如SEQ ID NO :2和4所述的預測氨基酸序列之外，還包括如SEQ ID NO: 6和8所述的預測氨基酸序列。7
本發明的這些方面和其他方面將通過發明詳述來進一步詳細描述。
序列簡述
SEQ ID NO 1是人ILlRLl (可溶的)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO :2是人ILlRLl (可溶的)cDNA (SEQ ID NO 1)的翻譯產物的預測氨基酸序列。
SEQ ID NO 3是人ILlRLl (膜結合的)cDNA的核苷酸序列
SEQ ID NO 4是人ILlRLl (膜結合的)(SEQ ID NO 3)的翻譯產物的預測氨基酸序列。
SEQ ID NO 5 是鼠 Fit-lS cDNA 的核苷酸序列。
SEQ ID NO :6是鼠Fit-IS cDNA(SEQ ID NO 5)的翻譯產物的預測氨基酸序列。
SEQ ID NO 7 是鼠 Fit-IM cDNA 的核苷酸序列。
SEQ ID N0:8是鼠Fit-IM cDNA(SEQ ID NO :7)的翻譯產物的預測氨基酸序列。
附圖簡述


圖1是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以后8%周期性機械應變對于培養的心肌細胞中Fit-I的表達的影響。
圖2是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以后，8%周期性機械應變，血管緊張素受體的阻斷，血管緊張素II，IL-lb，和佛波酯對于培養的心肌細胞中ILlRL-I的表達的影響。
圖3是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以后，8%周期性機械應變，過氧化氫，和TIRON對于培養的心肌細胞中ILlRL-I的表達的影響。
圖4是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以后，在心肌細胞發生8%周期性機械應變的過程中，放線菌素D和環己亞胺對于ILlRL-I表達的誘導的影響。
圖5是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以后，8%周期性機械力單獨，或與IL-Ib —起，以及在沒有機械應變的條件下的佛波酯，對于ILlRL-I的表達的影響。
圖6是Northern Blot結果，顯示了經過一段時間以后，8 %周期性機械應變對于培養的心肌細胞中空泡型ATP酶的表達的影響。
圖7顯示了本發明的試劑盒的外形特征。
圖8顯示了心肌細胞中機械應變對T2/ST2的mRNA誘導的早期(左)和晚期(右) 階段。3小時達到最大誘導量，維持9小時，然后經15小時下降。頂部組為T1/ST2RNA ；底部組為溴化乙錠。無應變為沒有機械應變。
圖9顯示了通過機械應變(8% )，白介素-1 (10ng/ml)和佛波酯(PMA，200nM)在1 小時和3小時對T1/ST2的mRNA的誘導。PMA >機械應變> IL-I。頂部組為Tl/ST2mRNA， 底部組為溴化乙錠。
圖10顯示了 T 1/ST2可能是在心肌細胞中IL1/IL-受體信號傳導中由NF_kB的激活誘導的一種基因。IL-I和機械應變在用對照腺病毒感染的條件下誘導Tl/ST2mRNA (左)。 在被I B腺病毒感染的條件下(右)會降低NF-B DNA的結合活性，IL-I對T1/ST2的誘導被阻斷。機械應變對T1/ST2的誘導被I B腺病毒感染部分阻斷，表明機械應變還通過另一種途徑誘導T1/ST2。頂部組為Tl/ST2mRNA，底部組為溴化乙錠。
圖11顯示了小鼠心肌梗塞后T1/ST2蛋白的表達，在梗塞后1天和3天進行免疫組化分析。40倍放大。
圖12以圖解方式顯示了人患者心肌梗塞后體循環中的ST2蛋白水平；a.在心肌梗塞后1天與14天和90天相比ST2蛋白顯著增加；b.線性回歸分析證明了在心肌梗塞后1 天循環ST2蛋白和肌酸激酶之間有顯著的正相關關系(ρ < 0. 001)。Log ST2 = 0. 454 (log CK)-1. 07 ；c.心肌梗塞后1天循環ST2蛋白水平和和射血分數的四分位值分析。較低的射血分數伴隨著較高的ST2蛋白。
圖13顯示了在隨訪的30天內，ST2基準水平的升高表示較高的死亡率。(對數秩，ρ = 0. 0009)。
發明詳述
本發明涉及多個基因的發現，當心臟細胞受到機械誘導發生應變變形的時候所述基因在細胞中受到正調控。由于這個發現，本發明的分子可以用于治療心血管疾病，包括心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和/或心力衰竭。
除此之外，還提供了使用這些分子診斷任何上述心血管疾病的方法。
進一步，還提供了用于制備治療上述疾病的治療劑的組合物。
這里所述的“正調控”是指提高基因和/或它所編碼的多肽的表達。“提高表達” 是指提高本發明的任何一種核酸(IL1RL-1,SEQ ID NO :1，3)的復制、轉錄、和/或翻譯(即達到可檢測的水平)，這些過程的任何一種受到正調控都會導致該基因(核酸)編碼的多肽的濃度/量的增加。相反地，這里所述的“負調控”或“降低表達”是指降低基因和/或它所編碼的蛋白的表達。基因表達的正調控或負調控可以直接根據分別檢測所述基因的mRNA 水平，或所述基因編碼的多肽的蛋白表達水平的升高或降低確定，檢測可以用所屬領域已知的任何適當的方法，例如分別用核酸雜交或抗體檢測方法，并與對照相比較。
這里所說的“心臟細胞”是指心肌細胞。
這里所說的“分子”包括“核酸”和“多肽”兩者。
這里所說的“表達”指核酸和/或多肽表達。
這里所說的“患者”指哺乳動物或非人的哺乳動物。在所有的實施方案中，人核酸， 多肽，以及人患者都是優選的。用人分子和其它文獻所述的鼠分子得到的結果預示著用其它同源序列也可以得到這樣的結果。
通常，同源序列和等位基因與本發明的人序列具有至少80%的核苷酸相同性和/ 或至少85%的氨基酸相同性。進一步，同源序列和等位基因可以與人序列分別具有至少 90%,95%,或甚至99%的核苷酸相同性和/或至少95%，98%，或者甚至99%的氨基酸相同性。同源性可以用NCBI (Bethesda，Maryland)提供的各種公開軟件計算。實例包括 Altschul SF等的啟發式算法(J Mol Biol，1990,215 :403-410)，也稱為BLAST。可以用公共軟件(EMBL, Heidelberg, Germany)禾口商業軟件(例如 Oxford Molecular Group/Genetics Computer Group, Madison, WI, Accelrys, Inc. , San Diego, CA 的 Mac Vector 序列分析軟件)進行I^airwise and ClustalW對準排列(BL0SUM30矩陣設置)。本發明還包括上述核酸的Watson-Crick互補序列。
在篩選相關基因，例如本文所述的序列的同源序列和等位基因的時候，可以在嚴謹條件下進行Southern blot,并使用探針。這里所說的術語“嚴謹條件”是指所屬領域所熟悉的參數。對于核酸來說，嚴謹雜交條件通常是指條件為低離子強度，溫度低于DNA雜交復合物的熔解溫度(Tm)(通常是比雜交的Tm低3°C )。較高的嚴謹條件有助于使探針序列和靶之間具有更高的特異性。核酸雜交的嚴謹條件是所屬領域熟知的，可以在描述此方法的文獻中找至丨J，例如，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al. , eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989,或者 Current Protocols in Molecular Biology,F. M. Ausubel, et al. , eds., John Wiley & Sons, Inc.，New York。“高度嚴謹條件”的一個實例是 65°C，6XSSC。高度嚴謹條件的另一個實例是在65°C雜交，雜交緩沖液由3. 5XSSC,0. 02% Ficoll,0. 02%聚乙烯吡咯燒酮，0. 02%牛血清清蛋白，2. 5mM NaH2PO4[pH7], 0. 5% SDS，2mMEDTA 組成。(SSC 是0. 015M氯化鈉/0. 15M檸檬酸鈉，pH7 ；SDS是十二烷基磺酸鈉；EDTA是乙二胺四乙酸)。 雜交后，將DNA轉移膜上，在室溫用2 X SSC洗滌，然后用0. 1XSSC/0. IX SDS洗滌直至溫度達到68°C。在另一個例子中，可用甲酰胺雜交溶液代替雜交水溶液。這時嚴謹雜交條件可以是，例如50%甲酰胺溶液，420C。還可以使用其他條件，試劑等，也可以達到類似的嚴謹程度。所屬領域技術人員熟知這些條件，因此這里不再描述。應當認識到，所屬領域技術人員能夠控制條件使得可以清楚地鑒定本發明的ILlRL-I核酸的同源序列和等位基因。所屬領域技術人員還熟知篩選細胞的方法，表達這些分子文庫，然后從文庫中分離出相關核酸分子并測序。
根據本發明給出的全長人和鼠cDNA的克隆，可以用標準菌落雜交技術從cDNA文庫中分離出其它哺乳動物序列例如與相關人和鼠核酸相應的(小鼠，牛等的)cDNA，還可以用同源性搜索進行識別，例如用這里描述的任何算法或所屬領域已知的算法在GenBank中搜索。例如GenBank序列號Y07519. 1和D13695. 1是小鼠ILlRL-I的同源序列，在本發明的各個方面都可以和本發明的同源鼠序列互換使用，而不背離本發明的精神。
相應這里所說的核酸，術語“分離的”意思是(i)在體外通過例如聚合酶鏈式反應(PCR)擴增；(ii)通過克隆產生重組體；(iii)通過切割和凝膠分離進行純化；或者(iv) 通過例如化學合成進行合成。分離的核酸可以容易地通過所屬領域熟知的重組DNA技術獲得。因此，在其5’和3’端的限制性位點已知的，或者已公開了其聚合酶鏈式反應(PCR)的引物序列的載體中所含有的核苷酸序列被認為是分離的，但是以天然狀態存在的或是存在于其天然宿主中的核酸序列則不是分離的。分離的核酸可以被純化，但是不需要純化。例如在克隆或表達載體內的分離的核酸是不純的，因為在細胞內它可能只包含微量的物質。但是這樣的核酸如本文所用的術語一樣是分離的，因為它可以很容易用所屬領域普通技術人員所公知的標準技術獲得。
根據本發明，本發明的任何上述ILlRL-I核酸的表達，包括上述序列的獨特片段， 可以用不同的方法確定。這里所說的相關核酸的“獨特片段”是指較大核酸的“特征片段”。 例如，獨特片段應足夠長，以確保它的精確序列在人基因組中除上述定義的每一個核酸之外都不存在。所屬領域普通技術人員僅用常規實驗就可以確定一個片段在人基因組中是否是獨特的。但是，獨特片段不包括完全由本申請的申請日之前公開的核苷酸序列組成的片段。
獨特片段可以用作Southern和Northern blot檢測的探針，以識別核酸，或者可以用于擴增檢測例如使用PCR進行的檢測。如所屬領域技術人員所知，優選使用大的探針如200，250，300個或更多個核苷酸用于特定用途如Southern和Northern blots，而優選使用較小的片段用作其它用途如PCR。獨特片段也可以用于產生融合蛋白以生成抗體，或者結合多肽片段，或者生成免疫檢測成分。同樣地，獨特片段可以用于產生非融合片段，例如ILlRL-I多肽，它可用于，例如抗體的制備，免疫檢測或治療。獨特片段進一步可用作反義分子，以分別抑制上述核酸和多肽的表達。
所屬領域技術人員應當認識到，獨特片段的大小取決于它們在遺傳密碼上的保守性。因此，SEQ ID NO :1，和3及其互補序列的一些區域的獨特片段較長，而其它序列的獨特片段較短，一般是 12 到 32 個核苷酸長(例如 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24， 25，26，27，28，四，30，31和32個堿基)或者更多，直至每個公開的序列的全長。如上所述， 本發明公開了每個序列的每一個片段，從第一個核苷酸，第二個核苷酸等等開始，直至離末端8個核苷酸，以每個序列的第8位，第9位，第10位核苷酸等等之后的任一個結束，直至最后一個核苷酸，(該序列如上所述是獨特的)。例如，事實上SEQ ID NO 1從第1個核苷酸到第1357個核苷酸區域，或者SEQ ID NO 3從第1個核苷酸到第2058個核苷酸區域的任何片段，或其具有20個或更多個核苷酸的互補序列都是獨特的。所屬領域技術人員熟知選擇這種序列的方法，典型地是基于獨特片段能將所感興趣的序列選擇性地與人基因組中的其它序列區分開。將片段序列與已知數據庫中的序列相比較就足夠了，雖然還可以在體外進行驗證性的雜交和測序分析。
本發明的特定方面包括選擇性地與編碼多肽的核酸分子結合以降低該多肽活性的反義寡核苷酸。
這里所說的“反義分子”，“反義寡核苷酸”，和“反義”所描述的寡核苷酸是寡核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，修飾的寡核糖核苷酸，或者修飾的寡脫氧核糖核苷酸，它們可在生理條件下與含有特定基因的DNA或該基因的轉錄mRNA雜交，從而抑制該基因的轉錄和 /或抑制該mRNA的翻譯。反義分子應能通過與靶基因或其轉錄產物雜交從而干擾靶基因的轉錄或翻譯。所屬領域技術人員應當認識到反義寡核苷酸的確切長度以及它與靶互補的程度取決于所選擇的特定靶，包括靶的序列以及組成該序列的特定堿基。優選反義寡核苷酸的組成和排布使其能夠在生理條件下選擇性地與靶結合，即在生理條件下相對于靶細胞中的其它序列更多地是與靶序列結合。基于SEQ ID NO :1，和3，或等位基因或同源染色體和/或cDNA序列，所屬領域技術人員可以很容易選擇并合成可用于本發明的任何適當的反義分子。要達到足夠的選擇性和抑制能力，反義寡核苷酸應當包括至少10個，更優選地至少15個與靶互補的連續堿基，雖然在特定的條件下，長度為7個堿基的修飾寡核苷酸也可成功用于反義寡核苷酸(Wagner et al. , Nat. Med, 1995,1 (11) :1116-1118 ；Nat. Biotech.， 1996，14 :840-844)。最優選地，反義寡核苷酸含有20-30個堿基的互補序列。
雖然寡核苷酸可以是基因或mRNA轉錄物的任何區域的反義物，在優選的實施方案中，反義寡核苷酸相應于N末端或者5’上游位點，例如翻譯起始，轉錄起始或者啟動子位點。除此之外，反義寡核苷酸也可以靶定3’未翻譯區域。在所屬領域中，也可以靶定mRNA剪接位點，但是如果存在其它的mRNA剪接則不傾向于使用這種方式。除此之外， 反義物優選靶定不影響mRNA 二級結構的位點(參見，例如，^iinio et al. , Cell Mol. Neurobiol. 14(5) =439-457,1994)和不與蛋白質結合的位點。最后，雖然SEQ IDNO :1和3， 公開了 cDNA序列，所屬領域普通技術人員可以很容易獲得上述序列的基因組DNA序列。因此，本發明還提供了與SEQ ID N0:1和3相應的基因組DNA互補的反義寡核苷酸。類似地，無需過度的實驗就可以獲得其等位基因或者同源的人cDNA和基因組DNA的反義物。
本發明的寡核苷酸可以包括RNAi分子。RNA干擾或者說“RNAi”包括使用雙鏈 RNA(dsRNA)阻斷基因表達(參見，例如 Sui，G，et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 99 5515-5520,2002)。本發明的實施方案中使用的RNAi策略方法是所屬領域普通技術人員公知的。
在一些實施方案中，本發明的反義寡核苷酸可以由“天然的”脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，或其任意組合組成。也就是說一個天然核苷酸的5’端和另一個天然核苷酸的3’ 端可以通過核苷間的磷酸二酯鍵共價結合，如天然狀態那樣。這些寡核苷酸可以通過所屬領域公知的方法，通過人工操作或者用自動合成儀制備。它們也可以通過載體重組產生。
但是，在優選的實施方案中，本發明的反義寡核苷酸還包括“修飾的”寡核苷酸。也就是說，所述寡核苷酸可以通過多種方式修飾，修飾的方式不妨礙它們與其靶雜交，但是可以增強它們的穩定性或者它們對目標的靶定，或者增強它們的治療效果。
這里所說的術語“修飾的寡核苷酸”是指這樣的寡核苷酸(1)其中至少兩個核苷酸通過合成的核苷間連接(即除一個核苷酸的5’端和另一個核苷酸的3’端之間的磷酸二酯鍵以外的連接)相連和/或( 其中通常不與核酸相連的化學基團與該寡核苷酸共價連接。優選的核苷間連接是硫逐磷酸酯，膦酸烷基酯，二硫代磷酸酯，磷酸酯，硫逐磷酸烷基酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯，碳酸鹽，磷酸三酯，乙酰胺，羧甲基酯和肽。
術語“修飾的寡核苷酸”還包括具有共價修飾的堿基和/或糖的寡核苷酸。例如， 修飾的寡核苷酸包括具有與除3’位置的羥基以外的以及除5’位置的磷酸基團以外的低分子量的有機基團共價連接的骨架糖。因此修飾的寡核苷酸可以含有2’ -0-烷基化核糖基團。除此之外，修飾的寡核苷酸可以含有糖例如用阿拉伯糖代替核糖。因此本發明包括含有在生理條件下與編碼SEQ ID NO :2和/或4的多肽的核酸互補并與之雜交的修飾的反義分子的藥物制備物，以及藥學可接收的載體。
反義寡核苷酸可以作為藥物組合物的一部分給藥。這樣的藥物組合物可以含有反義寡核苷酸和所屬領域公知的標準生理學和/或藥學可接收的載體的組合。所述組合物應當是無菌的，并且在適于給患者施用的單位重量或單位體積中含有治療有效量的反義寡核苷酸。術語“藥學可接收的”是指不會干擾活性成分的生物學活性的效果的非毒性物質。 術語“生理學可接收的”是指與生物系統例如細胞，細胞培養物，組織，或生物體相容的非毒性物質。載體的特征取決于給藥的方式。生理學和藥學可接收的載體包括稀釋劑，填充物， 鹽，緩沖液，穩定劑，增溶劑，以及所屬領域熟知的其它物質。
本發明還包括編碼由SEQ ID NO :1和/或3的核酸，片段及其變異體編碼的蛋白質的表達載體，以及含有這些表達載體的宿主細胞。實際上，任何細胞，不論是原核的或真核的，只要能被異源DNA或RNA轉化并能在培養基中生長或維持，都可以用于本發明。實例包括細菌細胞例如大腸桿菌，和哺乳動物細胞例如小鼠，倉鼠，豬，羊，靈長類動物等。細胞可以是多種組織類型，包括肥大細胞，成纖維細胞，卵母細胞和淋巴細胞，它們可以是初始細胞或細胞系。特定的例子包括CHO細胞和COS細胞。也可以使用不含細胞的轉錄系統代替細胞。
這里所說的“載體”可以是任何核酸，其中所需要的序列可以通過限制性切割和連接插入該核酸，以在不同的遺傳環境中傳遞或者在宿主細胞中表達。載體通常是由DNA組成，雖然RNA載體也可以使用。載體包括但不限于質粒，噬菌粒和病毒基因組。克隆載體是能夠在宿主細胞內復制，并且可由一種多種內切酶限制性位點表征的載體，其中該載體可以以確定的方式切割，并且所需的DNA序列可以連接到其中并使新的重組載體保留了其在宿主細胞中復制的能力。如果載體是質粒，當質粒在宿主細菌增加拷貝數的時候所需序列可以復制多次，或者在宿主通過有絲分裂繁殖之前在每個宿主中只復制一次。如果載體是噬菌體，可以在溶胞階段主動復制，或者在溶源階段被動復制。表達載體是所需的DNA序列可以通過限制性切割和連接插入其中并且與調控序列可操作地連接并通過RNA轉錄表達的載體。載體可以進一步包括一個或多個適用于識別已經被或沒有被載體轉化或轉染的細胞的標記序列。標記包括，例如編碼可以增加或減少對抗體或其它化合物的抗性或敏感性的的蛋白的基因，編碼其活性可以用所屬領域公知的標準檢測方法檢測的酶的基因(例如-半乳糖昔酶或堿性磷酸酶)，以及可見的能影響所轉化或轉染細胞，宿主，菌落或噬斑的表型的基因(例如綠色熒光蛋白)。優選的載體是能夠自發復制并表達存在于DNA區段中并與之可操作地連接的結構基因產物的載體。
這里所說的編碼序列和調控序列，當它們共價連接以使編碼序列的表達或轉錄受到調控序列的影響或控制的時候稱為“可操作地連接”。如果需要，編碼序列可以翻譯為功能蛋白。如果5，調控序列的啟動子誘導導致了編碼序列的轉錄，并且如果兩個DNA序列之間的連接狀態不會(1)導致出現移碼突變，(2)干擾啟動子區域指導編碼序列的轉錄，或者 (3)干擾相應RNA轉錄物翻譯成蛋白質的能力，則兩個DNA被稱為可操作地連接。因此，如果啟動子區域能夠影響DNA序列的轉錄并使轉錄產物能夠被翻譯成所需的蛋白質或多肽， 則啟動子區域應當是可操作地與編碼序列連接。
基因表達所需的調控序列的確切特征隨種屬或細胞類型的不同而不同，但是通常包括，轉錄和反義分別所必需的5’非轉錄和5’非翻譯序列，例如TATA盒，帽子序列，CAAT 序列，等等。這種5’非轉錄調控序列通常包括啟動子區域，該啟動子區域含有對可操作連接的基因進行轉錄控制的啟動子序列。調控序列還可以含有所需的增強子序列或者上游活化子序列。本發明的載體可以任選地含有5’前導序列或信號序列。選擇和設計合適的載體在所屬領域普通技術人員的能力和判斷力之內。
含有所有表達所必需元件的表達載體是商業可獲得的，也是所屬領域技術人員公知的。參見，例如，Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。可以通過向細胞中引入編碼多肽或其片段或變體的異源DNA (RNA)構建基因工程細胞。該異源DNA (RNA)可操作地受到轉錄元件的控制，使其可以在宿主細胞中表達異源DNA。
哺乳動物細胞中優選的mRNA表達系統包括例如pcDNA3. 1 (可從hvitrogen， Carlsbad, CA獲得)，其含有可選擇的標記例如賦予G418抗性的基因(有助于選擇穩定轉染的細胞系)，以及人巨細胞病毒(CMV)增強子-啟動子序列。除此之外，適于在靈長類或犬細胞系中表達的是PCEP4載體(Invitrogen，Carlsbad, CA)，其含有Epstein Barr 病毒(EBV)復制起點，有助于使質粒成為多拷貝染色體外元件。另一種優選的表達載體是腺病毒，在Mratford-Perricaudet的文獻中有描述，其是El和E3蛋白缺陷型(J.Clin. Invest. 90 :626-630,1992)。
本發明還包括所謂的表達試劑盒，使得技術人員可以制備所需的表達載體。這種表達試劑盒包括至少上述討論的每一個編碼序列的分離部分。也可以加入其它所需的組分，只要其中含有所需的上述序列。
還應當認識到本發明包括上述SEQ ID NO :1和/或3，含有cDNA序列的表達載體轉染宿主細胞和細胞系，如原核細胞(例如大腸桿菌)，或真核細胞(例如CHO細胞，COS細胞，酵母表達系統和昆蟲細胞中的重組桿狀病毒表達)的用途。特別有用的是哺乳動物例如小鼠，倉鼠，豬，羊，靈長類動物等的細胞。它們可以是多種組織類型，包括靈長類細胞和細胞系。特定的例子包括樹突狀細胞，似93細胞，外周血白細胞，骨髓干細胞和胚胎干細胞。
本發明還提供了由上述核酸(SEQ ID NO :1和3)編碼的分離的多肽(包括整個蛋白和部分蛋白)，還包括SEQ ID NO :2和/或4的多肽，以及它們的獨特片段。這種多肽可單獨使用或作為融合蛋白的一部分生成抗體，或者作為免疫檢測的組分。可以從生物樣品包括組織或細胞勻漿中分離多肽，也可以在多種原核和真核表達系統中重組表達多肽，其是通過構建適合于表達系統的表達載體，將表達載體引入表達系統，分離重組表達蛋白。短的多肽，包括抗原性肽(例如由細胞表面的MHC分子呈遞以進行免疫識別的肽)也可以用已知的肽合成方法化學合成。
就這里所說的多肽而言，術語“分離的”表示以足夠純的形式從其天然環境中分離出來，以使它能夠用于本發明的任何目的。因此分離的表示足夠純以用于(i)產生和/或分離抗體，(ii)作為檢測試劑，(iii)測序，(iv)作為治療劑等。
每一個上述多肽的獨特片段都具有如上所述的與核酸相關的獨特片段的特征。所屬領域技術人員應當認識到，獨特片段的大小取決于各種因素如該片段是否由若干個保守蛋白域組成。因此，多肽的某些區域應當必須具有比較長的片段才是獨特的，而其它區域只需要短的片段，一般是在5到12個氨基酸之間(例如5，6，7，8，9，10，11和12個氨基酸或更多，包括每一個整數直至每個多肽的全長)就可以。
多肽的獨特片段優選是那些能保留該多肽的獨特功能的片段。獨特片段所保留的多肽的功能包括與抗體的相互作用，與其它多肽或其片段的相互作用，與其它分子的相互作用等。一種很重要的活性就是作為識別該多肽的特征。所屬領域技術人員熟知選擇獨特氨基酸序列的方法，通常是基于獨特片段能夠將所感興趣的序列與非家族成員區分開。所需要做的就是將所述片段的序列與已知數據庫中的序列比較。
本發明包括上述多肽的變體。這里所說的多肽的“變體”是其中含有一個或多個天然(例如“野生型”具有選自SEQ ID NO 2和4的氨基酸序列的多肽)多肽的初級氨基酸序列的修飾。能夠產生多肽變體的修飾通常是對編碼該多肽的核酸進行的，可以包括缺失，點突變，截斷，氨基酸取代以及插入氨基酸或非氨基酸分子，其目的是(1)降低或消除多肽的活性；( 增強多肽的一種性質，例如蛋白質在表達系統中的穩定性或者蛋白-配體連接的穩定性；C3)為蛋白提供一種新的活性或性質，例如插入抗原性表位或者插入可檢測到的分子，或者(4)為多肽受體或其它分子提供同等的或更好的連接。可選擇地，修飾可以是直接針對多肽的，例如切割，插入連接體分子，插入可檢測到的分子，例如生物素，插入脂肪酸等。修飾也可以包括含有該多肽全部或部分氨基酸序列的融合蛋白。所屬領域技術人員應當熟悉預測蛋白質序列發生改變對于蛋白質構象的影響，并可以根據已知方法“設計”一種變體多肽。這種方法的一個實例如Dahiyat and Mayo in Science 278:82-87， 1997所述，其中蛋白是完全新設計的。所述方法可以應用于已知蛋白，僅改變該多肽序列的一部分。使用Dahiyat and Mayo所述的的計算方法，可以得到任何上述多肽的特異變體， 并進行檢測以確定所述變體是否具有所希望的構象。
變體可以包括進行特定修飾的改變了與其生理活性無關的多肽性質的多肽。例如半胱氨酸殘基可以被取代或者被刪除以防止產生不希望的二硫鍵。類似地，可以改變特定的氨基酸以通過在表達系統中消除蛋白酶的蛋白質水解作用增強多肽的表達(例如酵母表達系統中的二元氨基酸殘基，其中存在KEX2蛋白酶活性)。
編碼多肽的核苷酸的突變優選保留了編碼序列的氨基酸閱讀框，優選不在核酸中產生可能雜交形成二級結構，例如發卡或環的區域，這不利于表達變體多肽。
可以通過選擇氨基酸取代，或者通過在編碼多肽的核酸的選定位點進行任意突變產生突變。然后表達變體多肽并檢測其一種或多種活性以確定哪種突變得到的變體多肽具有所希望的性質。可以對其中所述多肽的氨基酸序列處于沉默狀態，但是卻具有在特定宿主中進行翻譯的優選密碼子的變體(或者非變體多肽)進行進一步突變。核酸在例如大腸桿菌中翻譯的優選密碼子是所屬領域普通技術人員所熟知的。還可以對基因的非編碼序列或cDNA克隆進行其它突變以增強多肽的表達。
所述領域技術人員應當認識到，可以對任意上述多肽進行保守性氨基酸取代，以提供上述多肽的功能相同的變體，即這些變體保留了每個多肽的功能。這里所說的“保守性氨基酸取代”是指氨基酸取代不顯著改變多肽的三級結構和/或活性。可以使用所屬領域普通技術人員公知的改變多肽序列的方法制備變體，包括那些描述此方法的參考文獻中所述的方法，例如 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al. , eds., Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York, 1989,或者 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, et al. , eds. , John Wiley & Sonsjnc.，New York。氨基酸的保守性取代包括在下列各組內的氨基酸取代(a) M，I,L, V； (b)F，Y，W ； (c)K，R，H ； (d)A，G ; (e)S，T ; (f)Q, N ；和(g)E，D。
因此本發明包括多肽的功能相同的變體，即保留著天然(“野生型”)多肽的功能的多肽變體。產生每個多肽的功能等同性變體的多肽氨基酸序列的保守性氨基酸取代是通過改變編碼所述多肽的核酸得到的。可以用所屬領域普通技術人員所公知的多種方法進行這種取代。例如，根據 Kunkel (Kunke 1,Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 82 :488-492,1985)所述的方法進行PCR定向突變，位點定向突變，或者化學合成編碼多肽的基因以進行氨基酸取代。多肽的功能等同性變體的活性可以通過下述方法檢測將編碼改變的多肽的基因克隆到細菌或哺乳動物表達載體中，將載體引入合適的宿主細胞中，表達改變的多肽，用本文所述的方法檢測多肽功能。
本發明如本文所述具有多種用途，其中一些在本文其它部分描述。首先，本發明使得可以分離多肽。可以用所屬領域技術人員熟知的多種方法得到分離的分子。所述多肽可以從天然能產生該多肽的細胞中通過層析方法或免疫識別純化。可選擇地，可將表達載體引入細胞以生產所述多肽。在另一種方法中，可以將mRNA轉錄物通過顯微注射或其它方法引入細胞中，以生產所述的編碼多肽。mRNA在不含細胞的提取物例如網織紅細胞溶解產物系統中的翻譯也可以用于生產多肽。所屬領域技術人員還可以很容易地用已知的方法分離多肽。這些方法包括但不限于免疫層析，HPLC，排阻層析，離子交換層析和免疫親和層析。
在特定的實施方案中，本發明還包括衍生自多肽的“顯性抑制”多肽。顯性抑制多肽是一種蛋白質的無活性的變體，通過與細胞體系的相互作用，取代活性蛋白與細胞體系的相互作用或者與活性蛋白競爭，由此減少了活性蛋白的作用。例如，與配體結合但在與配體結合的同時不傳遞信號的顯性抑制受體可以減少配體表達的生物學作用。同樣地，顯性抑制無催化活性的激酶可以正常地與靶蛋白相互作用，但是不能磷酸化靶蛋白，這可以減少靶蛋白響應細胞信號時發生的磷酸化。類似地，顯性抑制轉錄因子可以與基因控制區域的啟動子位點結合但是不增加基因轉錄，這可以通過占據啟動子結合位點而又不增加轉錄來減少正常轉錄作用。
在細胞中表達顯性抑制多肽的最終結果是降低了活性蛋白的功能。所屬領域普通技術人員可以評估蛋白質顯性抑制變體潛在的功能，并且使用標準的突變技術產生一種或多種顯性抑制變體多肽。參見，例如，美國專利序列號5，580，723和Sambrook et al. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。所屬領域技術人員然后可以檢測減少了選定的活性和/或保留了此活性的突變多肽群體。其它類似的生成和檢測蛋白質的顯性抑制變體的方法對于所屬領域普通技術人員是顯而易見的。
本發明的cDNA的分離使技術人員有可能診斷由任何上述cDNA的異常表達表征的疾病。這些方法包括確定每一個所識別的核酸，和/或由其生成的多肽的表達。在上述情況下，這種確定可以通過任何標準的核酸確定性檢測，包括聚合酶鏈式反應，或者用標記的雜交探針來進行，如下文例示。在后者的情況下，可以通過標準的免疫檢測，用例如與分泌蛋白結合的抗體進行確定。
本發明還包括分離的肽結合試劑，例如，該試劑可以是抗體或者抗體的片段(“結合多肽”)，具有能選擇性地與本發明的任何多肽(例如SEQ ID N0:2或4)結合的能力。抗體包括多克隆和單克隆抗體，可以根據傳統方法制備。
重要的是，如本領域熟知的，只有抗體的一小部分，抗原決定簇，與抗體與其表位 W^n MW^Clark,W. R. (1986)The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York ；Roitt, I. (1991)Essential Immunology,7th Ed.，Blackwell Scientific Publications, Oxford)。pFc，和 Fc 區域，例如，是補體級聯系統的效應物，但不涉及抗原結合。其Pfc'區域被酶切了的，或者不含有PFc'區域的抗體稱為F(ab’)2片段，保留有完整抗體的抗原結合位點。類似地，其Fc區域被酶切了的， 或者不含有Fc區域的抗體稱為Fab片段，保留有完整抗體分子的一個抗原結合位點。進一步，Fab片段由共價結合的抗體輕鏈和抗體重鏈的Fd部分組成。Fd片段是抗體特異性的主要決定因素(一個單獨的Fd片段可以和多達十個不同的輕鏈結合而不會改變其抗體特異性)，Fd片段在分離過程中保持了表位結合能力。
在抗體的抗原結合部分中，如所屬領域所熟知的，具有可以和抗原的表位直接相互作用的互補決定區(CDR)，以及維持抗原決定簇的三級結構的框架區(FR)(參見，一般的，Clark，1986 ；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重鏈Fd片段和輕鏈中，具有四個框架區域(FRl到FR4)，分別被三個互補決定區(⑶Rl至⑶R3)分隔開。⑶R，特別是⑶R3區域， 更特別的是重鏈CDR3，主要負責抗體的特異性。
所屬領域已知哺乳動物抗體的非CDR區域可以被同種或異種抗體的類似區域取代，而還保持原始抗體的表位特異性。這清楚地由“人化的”抗體的研究和使用所證明，其中非人的CDR與人FR和/或Fc/pFc’區域共價結合，產生功能性抗體。參見，例如，美國專利序列號 4，816，567 ；5，225，539 ；5，585，089 ；5，693，762 和 5，859，205。因此，例如，PCT 國際公開號WO 92/04381教導了人化的鼠RSV抗體的生產和使用，其中鼠FR的至少一部分被來源于人的FR區域取代。這種抗體，包括完整抗體的具有抗原結合能力的片段，通常被稱為“嵌合”抗體。
因此，如所屬領域普通技術人員顯然可知的，本發明還提供了 F(ab' )2，Fab，Fv和 Fd片段；其中!^c和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區域被同源的人或非人的序列取代的嵌合抗體；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區域被同源的人或非人的序列取代的嵌合F(ab’)2抗體；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈 CDR3區域被同源的人或非人的序列取代的嵌合Fab抗體；以及其中FR和/或CDRl和/或 CDR2區域被同源的人或非人的序列取代的嵌合Fd抗體。本發明還包括所謂的單鏈抗體。
因此，本發明涉及多種大小和類型的能特異地與本發明的多肽(例如SEQ ID NO 2，或4-其胞外部分)結合的多肽，以及多肽和其結合配偶體的復合體。這些多肽可以來自于抗體技術以外的來源。例如，可以由可方便地在溶液中，以固定化形式，作為細菌鞭毛肽展示文庫或作為噬菌體展示文庫制備的變性肽文庫提供這種多肽結合試劑。也可以合成含有一個或多個氨基酸的肽的組合文庫。進一步可以合成肽和非肽合成分子的文庫。
本發明進一步提供了識別在細胞功能決定的多肽或多肽片段水平活化的試劑或可使試劑活化的前導化合物的有效方法。特別的，這種功能包括與其它多肽或片段的相互作用。通常，篩選方法包括檢測干擾本發明的多肽的活性的化合物，雖然用此篩選方法也可以檢測能增強活性的化合物。這種方法適于進行自動化的，高通量的化合物篩選。目標的指示包括由這些多肽調節的細胞過程，例如在發生機械應變的細胞中的過表達。
提供了多種候選(藥學)試劑的檢測方法，包括，體外標記蛋白配體結合檢測，電泳遷移率改變檢測，免疫檢測，基于細胞的檢測例如雙雜交和三雜交篩選，表達檢測等。轉染的核酸可以編碼，例如組合肽文庫或者cDNA文庫。這些檢測所用的試劑，例如GAL4融合蛋白，是所屬領域已知的。一種基于細胞的檢測的實例包括用編碼與GAL4DNA結合域融合的本發明的多肽的核酸和編碼可操作地與基因表達調控區域，例如一種或多種GAL4結合位點連接的報道子基因的核酸轉染細胞。當報道子融合蛋白與試劑結合時激活報道子基因的轉錄，由此使得報道子基因轉錄。然后通過報道子基因表達的變化檢測能調節多肽介導的細胞功能的試劑。確定報道子基因表達的變化的方法是所屬領域公知的。
該方法中所用的多肽片段，如果不是由轉染的核酸產生的，則作為分離的多肽加入到檢測混合物中。多肽優選是通過重組產生的，雖然也可以從生物提取物中分離這種多肽。重組產生的多肽包括含有本發明的蛋白質和另一種多肽的融合體的嵌合蛋白，所述多肽是例如能夠提供或增強蛋白-蛋白結合，序列特異性核酸結合(例如GAL4)的，能增強本發明的多肽在檢測條件下的穩定性的，或者能提供可檢測分子如綠色熒光蛋白或Flag表位的多肽。
所述檢測混合物由能與本發明的多肽相互作用的天然的胞內或胞外結合靶組成。 雖然可以使用天然的多肽結合靶，但是通常優選使用多肽結合靶的一部分(例如多肽或核酸片段)或類似物(即在檢測中可模仿天然結合靶的多肽結合性質的試劑)，只要所述部分或類似物在檢測中可以提供可測量的與所述多肽片段的結合親和力。17
檢測混合物還含有候選試劑，通常使多種檢測混合物同時以不同的試劑濃度進行檢測，以得到對各種濃度的不同反應。通常，其中一種濃度作為負對照，即試劑濃度為零或者試劑濃度在可檢測到的限度以下。候選試劑包括多種化學類別，雖然通常都是有機化合物。優選地，候選試劑是小的有機化合物，即分子量高于大約50但低于大約2500，優選小于大約1000，更優選小于大約500。候選試劑含有與多肽和/或核酸的結構相互作用必需的功能性化學基團，包括至少一個胺，羰基，羥基或羧基，優選包括至少兩個功能性化學基團，更優選包括三個功能性化學基團。候選試劑可以含有被一個或多個上述功能性基團取代的碳環或者雜環結構和/或芳香環或多環芳香結構。候選試劑還可以是生物分子例如肽，多糖， 脂肪酸，留醇，類異戊二烯，嘌呤，嘧啶，上述物質的衍生物或結構類似物，及其組合等。如果所述試劑是核酸，那么該試劑典型地是DNA或RNA分子，雖然這里也包括修飾的核酸。
候選試劑可以來自于多種來源，包括合成或天然化合物文庫。例如，可以用多種方法隨機合成和定向合成多種有機化合物和生物分子，包括隨機寡核苷酸表達，合成有機組合文庫，隨機肽的噬菌體展示文庫等。可選擇地，細菌，真菌，植物和動物提取物形式的天然化合物文庫是可獲得的或者是容易生成的。除此之外，天然的和合成的文庫和化合物可以通過傳統的化學，物理和生物化學方法進行修飾。進一步，可以使用已知的(藥學的)試劑進行定向的或隨機的化學修飾，例如酰化，烷基化，酯化，酰胺化等，以產生所述試劑的結構類似物。
混合物中可以含有其它試劑。這些試劑包括鹽，中性蛋白(例如清蛋白)，去垢劑等，這些物質有利于最優化蛋白質-蛋白質和/或蛋白質-核酸結合。這種試劑也可以減少反應組分之間的非特異性或背景相互作用。也可以使用其它可以提高檢測效率的試劑例如蛋白酶抑制劑，核酸酶抑制劑，抗微生物試劑等。
上述檢測物質的混合物在下述條件下培育在所述條件下如果不存在候選試劑， 所選擇的本發明的多肽特異地與細胞結合靶，其部分或其類似物結合。各組分加入的順序， 培育的溫度，培育的時間，和檢測的其它參數都是很容易確定的。試驗僅僅涉及最優化檢測參數，而不涉及檢測的基本組分。培育溫度典型地在4°C和40°C之間。培育時間優選盡量短，以便于進行快速的，高通量的篩選，典型地是在0. 1到10小時之間。
在培育以后，可以使用任何使用者可用的方法檢測在所述多肽和一個或多個結合靶之間是否存在特異性結合。對于不含細胞的結合類型的檢測，經常用分離步驟將結合的組分與未結合的組分分離開。可以用各種方法進行分離。至少有一種組分在固體底物上固定化，未結合的組分可以很容易從其上分離。固體底物可以是各種不同的材料以及各種不同的形狀，例如微量滴定盤，微球，檢測條，樹脂粒子等。底物優選使信噪比達到最大，并減少背景結合，同時易于分離并降低成本。
分離可以通過從容器中移去微球或檢測條來進行，傾空或稀釋容器如微量滴定盤的孔，清洗微球，粒子，用洗脫溶液或溶劑進行柱層析或過濾。分離步驟優選包括多次漂洗或清洗。例如，當固體底物是微量滴定盤的時候，其上的孔可以用洗脫溶液洗脫多次，洗脫溶液一般包括培育混合物中那些不參與特異性結合的組分，例如鹽，緩沖液，去垢劑，非特異性蛋白等等。如果固體底物是磁珠，這些磁珠可以用洗脫液洗脫一次或多次，然后用磁鐵分離。
可以用任意適宜的方法進行基于細胞的檢測，例如雙雜交或三雜交篩選。由多肽與靶分子相互作用的報道子基因轉錄檢測得到的轉錄物通常直接或間接地編碼可檢測產物，例如半乳糖苷酶活性，熒光素酶活性等。對于不合細胞的結合檢測，其中一種組分通常是可檢測的標記，或與可檢測的標記偶聯。可以使用多種標記，例如那些可以直接檢測的標記(例如放射性，熒光，光密度或電子密度等)或者間接檢測的標記(例如表位標簽如FLAG 表位，酶標簽如辣根過氧化物酶等。所述標記可以與多肽的結合配偶體結合，或者包含在結合配偶體的結構中。
可以使用多種方法檢測標記，這取決于標記的性質和其它檢測組分。例如，可以在標記連接在固相底物的時候或者從固相底物上分離以后對其進行檢測。可以通過光密度或電子密度，放射性射線，非放射性能量轉移等直接檢測標記，或者通過抗體結合物，抗生物素蛋白鏈菌素-生物素等間接檢測標記。檢測標記的方法是本領域熟知的。
本發明提供了多肽特異性結合試劑，識別和制備這些試劑的方法，以及它們在診斷、治療和藥物開發中的用途。例如，多肽特異性的藥學試劑可用于多種診斷和治療應用中，特別是在疾病或疾病預后與多肽結合特性的改變有關的時候。新的多肽特異性結合試劑包括多肽特異性抗體，細胞表面受體，以及如雙雜交篩選的檢測所識別的其它天然胞內和胞外結合試劑，以及在對化學文庫的篩選中識別的非天然的胞內和胞外的結合試劑。
通常，多肽與特定分子結合的特異性是由結合平衡常數決定的。能夠選擇性結合多肽的靶優選具有至少大約KrtT1的結合平衡常數，更優選至少大約IO8M^最優選至少大約109ΜΛ多種基于細胞的和不含細胞的檢測都可以用于證明多肽的特異性結合。基于細胞的檢測包括單雜交，雙雜交和三雜交篩選，檢測，其中多肽介導的轉錄受到抑制或增強。 不含細胞的檢測包括蛋白質結合檢測，免疫檢測等。其它可用于篩選與本發明的多肽結合的試劑的檢測包括熒光能量共振轉移(FRET)，和電泳遷移率變動分析(EMSA)。
根據本發明的另一個方面，提供了一種診斷由核酸分子表達的異常，其表達產物的異常，或者表達產物的片段的異常表征的疾病的方法。所述方法包括使分離自患者的生物樣品與能特異地與核酸分子，其表達產物，或其表達產物的片段結合的試劑接觸，確定試劑與核酸分子或其表達產物之間的相互作用以確定該疾病，其中所述核酸分子是ILlRL-I 核酸(SEQ ID NO :1)。在一些實施方案中，所述疾病是選自下組的心血管疾病心肌梗塞， 中風，動脈硬化，和心力衰竭。在一個實施方案中，所述疾病是心臟肥大。在另一個實施方案中，所述疾病是心肌梗塞。在一個實施方案中，所述疾病是心力衰竭。
如果所述分子是核酸分子，這種確定可以通過任何標準的核酸確定性檢測進行， 包括聚合酶鏈式反應，或者本文所例示的標記雜交探針檢測。如果所述分子是核酸分子的表達產物，或者核酸分子表達產物的片段，可以使用，例如能與任何多肽表達產物結合的抗體通過任何標準免疫檢測進行這種確定。
“表達異常”指任意上述ILlRL-I分子(核酸和/或多肽)與對照(即健康的或 “正常的”患者中同一個分子的表達)相比表達減少(過少表達)或表達增加(過表達)。 這里所說的“健康的患者”是指不具有將來發生心血管疾病的危險的患者(參見前面的討論禾口 Harrison' s Principles of Experimental Medicine, 13thEdition, McGraw-Hill, he.，N. Y.-這里稱為“Harrison' s”)。健康的患者另外也沒有疾病的癥狀。換句話說， 這種患者如果由醫生檢查，會被認為是健康的并且沒有心血管疾病的癥狀，也沒有發生心血管疾病的危險。
當所述疾病是選自下組的心血管疾病的時候心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭，任何上述分子與對照(例如健康的患者)相比表達的減少表示存在疾病， 或者表示具有將來發生這種疾病的危險。
本發明還提供了可用于測量本發明的核酸，或者本發明的表達產物水平的新的試劑盒。
在一個實施方案中，試劑盒包括一個容器，其中含有一種可以選擇性地與分離的 ILlRL-I核酸，或其表達產物結合的試劑，以及一個對照，用于與所述試劑和任意上述分離核酸或其表達產物的結合的測量值比較。試劑盒通常包括下述主要成分外殼，一種本發明的試劑，一種對照試劑，以及說明書。外殼可以是一種盒子樣的結構，其中放有一個裝有本發明的試劑的小瓶(或多個小瓶)，一個裝有對照試劑的小瓶(或多個小瓶)，以及說明書。 所屬領域技術人員可以很容易地改變外殼以適應個人需要。在一些實施方案中，對照是一個預定值，用以與測量值比較。在特定的實施方案中，對照包括任意上述分離的核酸的表達產物的表位。
在核酸的檢測中，可以包括用于擴增本發明的核酸分子的引物對。優選的試劑盒包括已知數量的核酸探針，表位(例如ILlRL-I表達產物)或抗表位的抗體，以及說明書或其它印刷材料。在特定的實施方案中，所述印刷材料可以表明發生基于檢測結果的心血管疾病的危險性。試劑可以包裝在容器中和/或以預定量涂覆在孔中，所述試劑盒可以包括標準物質例如標記的免疫試劑(例如標記的抗IgG抗體)等。一種試劑盒是組裝好的聚苯乙烯微量滴定盤，其上涂覆有任意上述的本發明的蛋白，和一個含有標記的抗人IgG抗體的容器。滴定盤的孔與例如生物流體接觸，洗滌，然后與抗IgG抗體接觸。然后檢測標記。 本發明的試劑盒特征由數字11表示，如圖7所示。試劑盒11由下述主要成分組成外殼 15，本發明的試劑17，對照試劑19，以及說明書21。外殼15是盒子樣的結構，其中放有一個含有本發明的試劑17的小瓶(或多個小瓶)，一個裝有對照試劑19的小瓶(或多個小瓶)，以及說明書21。所屬領域技術人員可以很容易地改變外殼15以適應個人需要。
在優選的實施方案中，本發明提供了新的試劑盒或者對在本發明的基礎上選擇的預定值特異的并具有合適的靈敏度的檢測試劑。因此優選的試劑盒與商業可獲得的試劑盒不同，包括例如不同的臨界值，在特定的臨界值具有不同的靈敏度，以及說明書或印刷材料上標明檢測結果的危險性。
本發明還包括評價患者用減少心血管疾病危險的試劑進行治療時獲益的可能性。 在一些實施方案中，所述試劑選自下組抗炎試劑，抗血栓形成試劑，抗血小板試劑，溶解血纖維蛋白的試劑，降脂試劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑，能與細胞粘附分子結合并能抑制白細胞與此分子粘附的能力，鈣通道阻斷劑，腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2抑制劑，以及血管緊張素系統抑制劑。所述方法包括獲得患者中ILlRL-I 分子的水平，將ILlRL-I分子的水平與心血管疾病診斷特異的預定值相比較。ILlRL-I分子的水平與預定值的比較表示患者是否從所述試劑的治療中獲益。在特定的實施方案中，心血管疾病診斷特異的預定值是多個預定標記物水平范圍，所述比較步驟包括確定所述患者的水平是否落在所述預定標記物水平范圍內。所述心血管疾病可以是選自下組的疾病心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
預定值可以是多種形式。它可以是單個的臨界值，例如中值或平均值。該值可以是基于比較組得到的，例如一個規定組的危險是另一個規定組的危險的兩倍。它也可以是一個范圍，例如，將檢測人群平均(或者不平均地)分為各組，例如低危險組，中等危險組和高危險組，或者分為四組，最低組是具有最低危險性的患者，最高組是具有最高危險性的組。
預定值可以是基于所選定的特定人群的。例如，顯然是健康的人群(沒有可檢測到的疾病，并且沒有心血管疾病的歷史)與吸煙的人群與曾經患過心血管疾病的人群相比，其系統炎癥標記物具有不同的“正常”范圍。相應的，所選的預定值可以考慮患者所屬的類別。所屬領域普通技術人員只需要常規試驗就可以選擇合適的范圍和類別。
如上所述的，本發明提供了評價患者用減少將來患心血管疾病的危險的試劑進行治療時獲益的可能性。此方法對于患者的治療以及新的治療方法的臨床開發具有重要的啟發。醫師為患者的治療選擇治療方法是基于所期望的對患者的凈益處。凈益處來自于危險對益處的比率。本發明使得可以選擇更有可能通過干擾方法獲益的患者，從而幫助醫師選擇治療方案。這可以包括使用具有較高危險性的藥物，但提高了獲得所期望的益處的可能性。同樣地，臨床研究希望能為臨床試驗選擇獲得凈益處的可能性較高的人群。本發明可以幫助臨床研究者選擇這樣的患者。臨床研究者現在也可以使用本發明確定臨床試驗的選擇標準。
本發明還包括治療心血管疾病的方法。在一些實施方案中，所述方法包括給需要治療的患者施用有效量的可治療心血管疾病的ILlRL-I分子。在特定的實施方案中，所述方法包括給需要治療的患者施用一種能調節任意上述ILlRL-I分子表達的試劑。“能調節表達的試劑”包括有效量的可治療心血管疾病的這里所說的任何ILlRL-I分子，能增加這些分子的表達的試劑，以及能減少任何上述ILlRL-I分子表達的試劑。
這里所說的對于核酸或多肽來說“能減少表達的試劑”是所屬領域所公知的，指反義核酸，能結合由所述核酸編碼的多肽的抗體，以及其它能降低這種分子表達的試劑。根據本發明，任何可以減少分子表達的試劑(如本文所述的，降低其活性)都可以使用。
在特定的實施方案中，所述分子是核酸(反義)。在一些實施方案中，所述核酸可操作地與能指導所述核酸分子在心肌細胞中表達的基因表達序列連接。“基因表達序列”是任何調控核苷酸序列，例如啟動子序列或啟動子和增強子的組合，可以促進與之可操作相連的核酸有效地轉錄和翻譯。基因表達序列可以是，例如哺乳動物或病毒啟動子，例如組成型或可誘導的啟動子。組成型哺乳動物啟動子包括但不限于下述基因的啟動子次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPTR)，腺苷脫氨酶，丙酮酸激酶，-肌動蛋白啟動子和其它組成型啟動子。能在真核細胞中起作用的病毒啟動子包括，例如猿病毒，乳頭瘤病毒，腺病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，勞氏肉瘤病毒，巨細胞病毒的啟動子，莫洛尼氏白血病毒和其它逆轉錄病毒的長末端重復序列(LTR)，以及單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子。其它組成型啟動子是所屬領域普通技術人員公知的。可用于本發明的基因表達序列的啟動子還包括可誘導的啟動子。可誘導的啟動子在存在誘導試劑的條件下被激活。例如，親金屬蛋白啟動子在存在某些金屬離子的條件下可被激活并提高轉錄和翻譯。其它可誘導的啟動子是所屬領域普通技術人員所公知的。
通常，基因表達序列必須包括分別與轉錄和翻譯起始相關的5’端非轉錄和5’端非翻譯序列，例如TATA盒，帽子序列，CAAT序列等等。特別地，5，端非轉錄序列應包括啟動子區域，該啟動子區域包括對與其可操作連接的抗原核酸進行轉錄調控的啟動子序列。根據需要，基因表達序列任選地包括增強子序列或者上游活化子序列。優選地，任何本發明的ILlRL-I核酸分子與能使核酸分子在細胞如心肌細胞和/ 或血管內皮細胞(包括平滑肌細胞)中表達的基因表達序列相連。更優選地，基因表達序列使得所述核酸分子可在心肌細胞中表達，而使所述分子不會在選自神經細胞，成纖維細胞， 以及造血細胞的細胞中表達。能使得所述核酸分子在心肌細胞中表達的序列能夠在這種細胞類型中選擇性地被激活，從而導致所述核酸分子在此細胞中表達。心臟肌球蛋白重鏈基因啟動子，例如，可以用于在心肌細胞中表達本發明的任何上述核酸分子。所屬領域普通技術人員可以容易地識別能在心肌細胞中表達核酸分子的備選啟動子。當核酸序列和基因表達序列共價連接以使所述核酸編碼序列的轉錄和/或反義受到所述基因表達序列的影響或控制的時候，被稱為是“可操作地連接”。如果需要，所述核酸序列可以翻譯成功能性蛋白質，如果5’端基因表達序列的啟動子的誘導能導致所述核酸序列的轉錄，如果兩個DNA序列之間的連接的性質沒有(1)導致出現移碼突變，(2)妨礙啟動子區域指導抗原序列轉錄的能力，和/或⑶妨礙相應的RNA轉錄以翻譯成為蛋白質的能力，那么這兩個DNA序列被認為是可操作地連接。因此，如果基因表達序列可以使所述核酸序列轉錄，并使轉錄產物可以翻譯成所需的蛋白質或多肽，那么基因表達序列就是可操作地與核酸序列相連。本發明的抗原核酸可以單獨或者與載體一起遞送到本發明的優選細胞類型中。從廣義來說，“載體”可以是任何媒介物，它能夠促進(1)分子遞送到靶細胞和/或( 靶細胞吸收所述分子。優選地，使用載體將所述分子運輸到靶細胞中會比不使用載體的降解程度更低。可選擇地，“靶配體”可以與載體相連接以選擇性地將載體遞送到在其表面表達靶配體的同源受體的細胞上。以這種方式，所述載體(含有核酸或蛋白質)可以被選擇性地遞送到例如心肌中的心肌細胞中。靶定的方法包括結合體，例如美國專利5，391，723to Iciest所述的。另一個公知的靶定載體的例子是脂質體。脂質體可以從Gibco BRL(Life Technologies Inc. , Rockville,MD)獲得。有數種已公開的方法可以用于制備靶定脂質體。 優選地，本發明的分子被靶定遞送到心肌細胞，和/或血管內皮細胞中。通常，可用于本發明的載體包括但不限于質粒，噬菌粒，病毒，其它來源于病毒或細菌并且能夠插入或結合本發明的核酸序列的載體，以及其它能與本發明的核酸序列相連的核酸片段(例如增強子，啟動子)。病毒載體是優選的載體形式，包括但不限于來自下列病毒的核酸序列腺病毒；腺病毒相關病毒；逆轉錄病毒，例如莫洛尼氏鼠白血病毒； Harvey小鼠肉瘤病毒，鼠乳房腫瘤病毒；勞式肉瘤病毒；SV40類型病毒；多瘤病毒；愛波斯坦-巴爾病毒；乳頭瘤病毒；皰疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰質炎病毒；和RNA病毒如逆轉錄病毒。還可以使用本文未指出但是所屬領域公知的其它載體。用于某些應用的特別優選的病毒是腺相關病毒，一種雙鏈DNA病毒。腺相關病毒可以感染許多類型和種屬的細胞，可以改造成復制缺陷型的，即能指導合成所需蛋白質，但不能制造感染顆粒。它進一步還具有其它優點例如熱穩定性和脂溶劑穩定性；在不同譜系的細胞，包括造血細胞中具有較高的轉導率；并且沒有重復感染抑制因而能夠進行多重轉導。據說腺相關病毒可以以位點特異的方式整合到人細胞DNA中，因而可以減少插入突變的可能性和插入基因表達的可變性。除此之外，野生型腺相關病毒感染在組織培養基中在沒有選擇壓力的條件下可傳代超過100代，表明腺相關病毒的基因組整合是一種相對穩定的事件。腺相關病毒還可以在染色體外發揮作用。通常，其它優選的病毒載體是基于不引起細胞病變的真核細胞病毒，其中非必需的基因被感興趣的基因取代。不引起細胞病變的病毒包括逆轉錄病毒，其生命周期包括基因組病毒RNA逆轉錄為DNA，然后前病毒整合到宿主細胞DNA中。腺病毒和逆轉錄病毒已證明可用于人基因療法。通常，逆轉錄病毒是復制缺陷型的。這樣經過基因改造的逆轉錄表達載體可以用于基因在體內的高效轉導。產生復制缺陷型逆轉錄病毒的標準操作方法(包括在質粒中引入外源遺傳物質，用質粒對包裝細胞系進行轉染，用包裝細胞系產生重組逆轉錄病毒，從組織培養基中收集病毒顆粒，用病毒顆粒感染靶細胞)在Kriegler，M. ,"Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,"W. H. Freeman C. 0. ,New York(1990)禾口 Murry,Ε. J. Ed. "Methods in Molecular Biology,"vol. 7,Humana Press,Inc.,Cliffton, New Jersey(1991)中有描述。另一種優選的逆轉錄病毒載體是來自莫洛尼氏鼠白血病毒的載體，如Nabel， E.G.，et al.，Science, 1990, 249 =1285-1288中所述。據報道這些載體可有效將基因遞送到所有三層動脈血管壁中，包括中膜。其它優選的載體在Flugelman，et al.，Circulation, 1992,85 :1110-1117中公開。其它可用于遞送本發明的分子的載體在美國專利序列號 5，674，722，申請人為Mulligan等中有描述。除了上述載體，可以用其它遞送方法將本發明的分子遞送到細胞例如心肌細胞和 /或血管內皮細胞中，并能夠促進其吸收。本發明的一種優選的遞送方法是膠體分散系。膠體分散系包括基于脂類的系統， 包括水包油的乳劑，膠粒，混合膠粒，和脂質體。本發明的一種優選的膠體系統是脂質體。脂質體是人造膜載體，可用于在體內或體外作為遞送載體。它表現為大的單層囊泡(LUV)，尺寸為0. 2-4. 0pm,能夠包裹大的大分子。RNA，DNA和完整的病毒顆粒可以包入水相內部，以生物活性形式遞送到細胞中(Fraley，et al. ,Trends Biochem. Sci.，1981，6 :77)。脂質體要成為有效的基因轉移載體，應當具有下述一個或多個特征(1)能高效封裝所感興趣的基因，同時保持其生物活性；( 與非靶細胞相比優選和主要結合靶細胞；C3)將載體的水相成分高效遞送到靶細胞的細胞質中；以及(4)準確而有效地表達遺傳信息。脂質體可以通過與特定的配體，例如單克隆抗體，糖，糖脂類，或蛋白偶聯，從而靶定特定的組織。可用于將脂質體靶定到血管壁的配體包括但不限于日本血凝病毒的病毒外殼蛋白。除此之外，所述載體可以與核靶定多肽偶連，可將所述核酸定向到宿主細胞的核。脂質體是商業可獲得的，可從Gibco BRL獲得，例如LIP0FECTIN 和 LIP0FECTACE ，是由陽離子酸例如N_[l_(2，3 二油酰基氧)_丙基]_N，N, N-三甲基氯化銨 (DOTMA)和二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)形成的。制備脂質體的方法是所屬領域所熟知的，在許多出版物中都有描述。^Gregoriadis, G. in Trends in Biotechnology, V. 3， p. 235-241 (1985)中對脂質體也有綜述。用于大分子，包括核酸的細胞內遞送的新的脂質體在PCT國際申請號PCT/US96/07572(公開號W096/40060，發明名稱為Intracellular Delivery of Macromo 1 ecules，，)也進行了描述。在一個優選的實施方案中，優選的載體是適合于對哺乳動物受體進行植入的生物相容的微粒或者植入物。可用于本方法的生物溶蝕的植入物在PCT國際申請號CT/ US/03307(公開號 W095/M929，發明名稱為"Polymeric Gene Delivery System”，優先權為1994年3月15日申請的美國專利申請序列號213，668)中有描述。PCT/US95/03307描述了一種包含由適當的啟動子控制的外源基因的生物相容的，優選是生物可降解的聚合體基質。聚合體基質可用于在患者中持續釋放外源基因。根據本發明，這里所述的核酸被封裝并分散在PCT/US95/03307公開的生物相容的，優選生物可降解的聚合物基質中。聚合物基質優選是微粒的形式，例如微球(其中核酸分散在固體聚合物基質中)或者微膠囊(其中核酸儲存在聚合物外殼的中心)。用于包含本發明的核酸的其它形式的聚合體基質包括薄膜，涂層，凝膠，植入物，和支架。聚合體基質裝置的尺寸和組成應使得基質在其所植入的組織中可方便地釋放。聚合體基質裝置的尺寸是根據要使用的遞送方法進一步選擇的，典型地是注射到組織中，或者通過噴霧劑將懸浮顆粒送入鼻腔和/或肺部。聚合體基質的組分的選擇應使之具有良好的降解速度，并且由具有生物附著性的物質組成，當此裝置施用到血管表面的時候進一步增加了其轉移效率。還應選擇基質的組成使其不被降解，而是在較長的一段時間內通過擴散釋放。非生物降解的和生物降解的聚合物基質都可以用于向患者遞送本發明的核酸。優選使用生物可降解的基質。這種聚合物可以是天然的或是合成的聚合物。優選使用合成的聚合物。聚合物的選擇取決于所希望的釋放時間，通常是數小時至一年或更長。典型地，一段時間內的釋放可以是在幾個小時之間，三至十二個月是最希望的。聚合物可選擇地是水凝膠的形式，可以吸收達其自身90%重量的水，而且，進一步可選擇地與多價離子或其它化合物交聯。通常，本發明的核酸可以用生物溶蝕的植入物通過擴散的方式，或者更優選地，通過聚合物基質的降解而被遞送。可以用于形成生物可降解的遞送系統的合成聚合物包括 聚酰胺，聚碳酸酯，聚亞烷，聚亞烷二醇，聚亞烷氧，聚亞烷對苯二甲酸酯，聚乙烯醇，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚商乙烯，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯及其共聚物，烷基纖維素，羥烷基纖維素，纖維素醚，纖維素酯，硝化纖維素，丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物，甲基纖維素，乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥基-丙基甲基纖維素，羥丁基甲基纖維素，醋酸纖維素，丙酸纖維素，醋酸丁酯纖維素，醋酸鄰苯二甲酯纖維素，羧乙基纖維素，三醋酸纖維素，硫酸鈉鹽纖維素，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸異丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸異癸酯)，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚 (甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸異丙酯)，聚(丙烯酸異丁酯)，聚(丙烯酸十八酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚(乙二醇)，聚(氧化乙烯)，聚(對苯二甲酸乙烯酯)，聚 (乙烯醇)，聚乙酸乙烯酯，聚氯乙稀，聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。非生物可降解的聚合物包括乙烯基醋酸乙烯酯，聚(甲基)丙烯酸，聚酰胺，及其共聚物和混合物。生物可降解的聚合物包括合成聚合物例如乳酸和羥基乙酸的聚合物，聚酐，聚 (鄰位)酯，聚氨酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)，和聚(丙交酯-共己內酯)，和天然聚合物例如藻酸鹽和其它多糖包括右旋糖苷和纖維素，膠原，其化學衍生物(化學基團的取代，插入，例如烷基，烯基，羥基化作用，氧化作用，和其它所屬領域技術人員按常規進行的修飾)， 清蛋白和其它親水蛋白，玉米蛋白和其它醇溶谷蛋白和疏水蛋白，及其共聚物和混合物。通常，這些物質可以通過酶水解或在體內暴露于水中通過表面侵蝕或主體侵蝕降解。所特別感興趣的生物附著性的聚合物包括生物溶蝕的水凝膠，如H. S. Sawhney,C. P. Pathak and J. A. Hubell in Macromolecules，1993，洸，581-587所述，在此也包括此文獻中給出的教導，聚透明質酸，酪蛋白，明膠，明膠蛋白，聚酐，聚丙烯酸，藻酸鹽，殼聚糖，聚 (甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸異丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸異癸酯)，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸異丙酯)，聚(丙烯酸異丁酯)，和聚(丙烯酸十八烷酯)。因此本發明提供了一種作為藥物使用的本發明的上述分子的組合物，制備所述藥物的方法和使所述藥物在體內持續釋放的方法。壓縮試劑也可以與本發明的載體組合使用。這里所說的“壓縮試劑”是指能中和核酸的負電荷因而能夠使核酸壓縮成微粒的試劑，例如組蛋白。核酸的壓縮使靶細胞更容易吸收核酸。壓縮劑可以單獨使用，例如以一種更有效被細胞吸收的方式遞送本發明的分離核酸，或者更優選地，與一種或多種上述載體一起使用。其它可促進靶細胞吸收本發明的核酸的組分包括磷酸鈣和其它胞內運輸的化學調節劑，顯微注射組分，電穿孔和同源重組組分(例如用于將核酸整合到靶細胞染色體的預先選定的部位)。根據本發明，術語細胞對核酸的“吸收的促進”根據所述分子的性質具有下述含義。對于分離的核酸，它的含義是描述核酸穿過細胞膜進入到細胞核中，其中基于“核酸轉基因”可以利用細胞體系產生所述核酸編碼的功能性多肽。根據“核酸轉基因”它的含義是描述本發明的所有含有或不含相關載體的核酸。對于多肽，它的含義是描述多肽穿過細胞膜進入到細胞質中，如果需要，使用細胞質體系在功能上修飾所述多肽(例如使之成為活性形式)。可以使用各種技術將本發明的核酸引入到細胞中，這取決于所述核酸是在體外還是體內引入到宿主中。這種技術包括核酸-CaPO4沉淀轉染，與DEAE相關的核酸轉染，用含有所感興趣的核酸的逆轉錄病毒轉染，脂質體介導的轉染等。為特定的用途，優選將所述核酸靶定到特定細胞。在這些情況中，用于將本發明的核酸遞送到細胞中去的載體(例如脂質體，逆轉錄病毒，或其它病毒)可以具有與之相連的靶定分子。例如，可將一種分子例如靶細胞表面膜蛋白特異性的抗體或靶細胞上的受體的配體與所述核酸遞送載體相連或包含在其中。例如，當使用脂質體遞送本發明的核酸的時候，和有關胞吞作用的表面膜蛋白相連的蛋白可以包含在脂質體中，以進行靶定和/或促進吸收。這種蛋白包括特定細胞類型的衣殼蛋白或其片段，在細胞循環中行使內在化作用的蛋白的抗體，靶定細胞內位點并能延長細胞半衰期的蛋白等。聚合物遞送系統也可成功用于將核酸遞送到細胞中，如所屬領域技術人員所述。這種系統甚至可以口服遞送核酸。本發明還提供了血管和心血管疾病的診斷和治療方法。所述疾病包括心肌梗塞， 中風，動脈硬化，心力衰竭，和心臟肥大。本發明的方法可用于任何上述疾病的急性和預防性治療。這里所說的急性治療是指對具有特定疾病的患者的治療。預防性治療是指對于具有患所述疾病的危險，但是目前并沒有患病也沒有經歷過所述疾病的癥狀的患者。從最廣義來講，術語“治療”同時指急性和預防性治療。如果需要治療的患者曾經患過某種疾病(或者正患有某種特定的疾病)，那么疾病的治療指改善，減少或消除所述疾病或由此疾病引起的一個或多個癥狀。在一些優選的實施方案中，疾病的治療指改善，減少或消除某種具體的癥狀或與所述疾病相關的具體癥狀。如果需要治療的患者具有患某種疾病的危險，那么患者的治療指減小患者患所述疾病的危險性。中風(這里也指缺血性中風和/或腦血管缺血)通常被認為是工業世界中第三大死亡原因，排在缺血性心臟病和癌癥之后。中風在美國每年引起300，000人死亡，是入院治療和長期殘疾的主要原因。相應地，中風的社會經濟影響和它給社會所帶來的負擔實際上是不可估量的。“中風”被世界衛生組織定義為癥狀持續至少M小時的腦部功能的病灶處或全部的紊亂所表現出來的快速發展的癥狀。中風還包括除了血管問題以外的沒有明顯原因的死亡。中風典型地是由通往腦部的或大腦內部的血管的阻塞引起的。全部阻塞的時候， 腦循環的滯留在數秒內引起神經電活動的停止。在能量狀態衰退和離子達到動態平衡后幾分鐘內，即發生高能量磷酸鹽的消耗，膜離子泵失效，釋放細胞鉀，釋放氯化鈉和水，膜去極化。如果阻塞持續超過五到十分鐘，會導致不可逆的損傷。如果是不完全的局部缺血，則結果很難估計，很大程度上取決于殘留的灌注和可以獲得的氧。在腦血管形成血栓后很少發生完全的缺血。通常在缺血部位都有一些殘留的灌注，這取決于旁系血流和局部灌注壓力。腦血管可以通過自動調整補償平均動脈血壓，使之維持在90到60mmHg。這種現象涉及下游抗性血管的擴張。在自動調整的較低水平(大約60mmHg)之下的時候，血管擴張不充分，腦血管血流下降。然而大腦具有灌注儲備可以補償腦血管血流量的下落。存在這種儲備是因為在正常條件下血液輸運的氧中只有35%被取用。因此，氧取用量增加導致血氧量和血二氧化碳量正常。當末梢血壓下降到大約30mmHg以下，這兩種補償機制(自動調整和灌注儲備)也不足以防止氧氣輸送的不足。當血流下降到缺血極限23ml/100g/分鐘的時候，會發生組織缺氧癥狀。嚴重的缺氧可能是致命的。中等程度的缺血會導致“半陰影”。在神經學上，半陰影指腦組織的一個區域具有中等程度的缺血，神經功能癱瘓，而這種現象通過恢復足夠的灌注可以逆轉。半陰影形成的區域具有旁系灌注組織，圍繞著一個嚴重缺血的內核，其中該內核發生梗塞。換句話說，半陰影是是能夠挽救的組織區域，基本處于生和死之間。雖然缺血事件可以發生在血管系統的任何部位，頸動脈分枝和頸動脈是最經常發生腦血管血栓性阻塞的部位，由此導致腦部缺血。由于血管狹窄或者血栓造成的血流減少癥狀與中等腦動脈疾病引起的癥狀類似。流過眼部的動脈血管經常受到影響形成一時性黑蒙或暫時性單眼失明。嚴重的兩邊頸動脈狹窄會導致腦半球灌注不足。這表現為在嚴重缺血的半球同側發生劇烈頭痛。血流阻塞或減少會導致前交通動脈末梢的一個大腦前動脈缺血，這會造成另一側的腿具有運動或大腦皮層感覺癥狀，偶爾在近側的胳膊上也具有這些癥狀。其它大腦前動脈的阻塞或低灌注的表現包括步態失調，有時由于中線兩旁的額葉的損傷造成小便失禁。語言障礙表現為自發性語言減少，伴隨產生精神活動衰退。大多數缺血性中風都包括中部腦動脈的部分或所有區域，這大多數是由于心臟或顱外頸動脈栓塞造成的。栓塞可能使中部腦動脈的主干發生堵塞，但是更常見的是使上支或下支發生末梢堵塞。上支的堵塞能引起臉部和胳膊上最大程度的無力和感覺喪失。后部腦動脈穿透部分末梢的堵塞能引起對側視力完全喪失。主要的后部腦動脈的缺血可能導致閱讀上的(閱讀障礙)和計算上的(計算障礙)困難。后部腦動脈附近的堵塞可能引起滲入到calamic結構和邊緣結構的分支血管的阻塞。臨床的癥狀就是半球感覺失調，可能會慢慢變成有缺陷的一邊的難以控制的疼痛(腦丘疼痛)。患有中風的患者是通過癥狀和/或物理檢查診斷的，所述物理檢查包括介入性或非介入性的診斷工具例如CT和MR成像。本發明的方法可用于治療中風患者的各種臨床癥狀。患有中風的患者可能具有一種或多種下述癥狀麻痹，虛弱，感覺和/或視覺下降，無感覺，麻刺感，失語癥(例如不能說話或發音含糊，不能閱讀說書寫)，失認癥(即不能識別或確定感覺刺激)，失去記憶，協調困難，嗜睡，困倦或無意識，不能控制膀胱和腸，以及認知下降(例如癡呆，注意廣度有限，不能集中精力)。使用醫學成像技術能夠識別出患有中風的患者，以及患有腦梗塞或腦溢血的患者。本發明的一個重要的實施方案就是治療患有異常嚴重危險的缺血性中風的患者。 如本文所述的，患有異常嚴重危險的缺血性中風的患者是根據傳統的醫學實踐確定的(見先前的描述)；這樣的患者在傳統的醫學實踐中也可以認為是具有中風的危險因素，或者更大的發生腦血管事件的危險。這種患者包括，例如進行任選的血管手術的患者。典型地， 和心臟病相關的危險因素與和中風相關的危險因素相同。主要的危險因素包括高血壓，高膽固醇血，和吸煙。心房纖維性顫動或心肌梗塞也是重要的危險因素。除此之外，根據本發明，ILlRL-I核酸分子，或其表達產物的表達水平的改變，也是重要的危險因素。這里所說的，患有異常嚴重危險的缺血性中風的患者還包括進行具有栓塞危險的，降低血壓的或者減少通往腦部血流的手術或診斷程序，例如頸動脈內膜切除術，腦血管造影術，神經外科手術，其中血管被壓縮或被封閉，心導管插入術，血管成形術，包括氣球血管成形術，冠狀旁路手術，或者類似的程序。患有異常嚴重危險的缺血性中風的患者還包括具有任何一種能導致腦部血流減少的心臟疾病，例如心房纖維性顫動，心室心動過速，擴張性心肌病以及其它需要進行抗凝血治療的心臟疾病。患有異常嚴重危險的缺血性中風的患者包括具有下述疾病的患者，包括動脈病或腦脈管炎，例如由狼瘡，血管的先天性疾病引起的疾病，例如CADASIL綜合癥，或者偏頭痛，特別是持續時間較長的事件。中風的治療可以是針對患過中風的患者，也可以是一種預防性治療。短期預防性治療是針對受到具有栓塞危險的，降低血壓的或者減少通往腦部血流的手術或診斷程序的患者的，以減少這些程序引起的缺血性事件造成的傷害。長期或持續性的預防性治療是針對具有能導致流向腦部的血流減少的心臟疾病，或者能直接影響腦部脈管系統的疾病的患者。如果進行的是預防性治療，那么治療是針對上述的具有異常嚴重危險的缺血性中風的患者。如果患者患過中風，那么治療可以包括急性治療。中風患者的急性治療意味著在疾病的癥狀發作之時，或者在發作之時的48小時之內，優選在M小時之內，更優選地是在12 小時之內，更優選地是在6小時之內，更優選地是在疾病癥狀發作之時的3小時之內。高膽固醇血和/或高甘油三酯患者定義的標準是所屬領域公知的(參見，例如 "Harrison' s”)。高膽固醇血患者和高甘油三酯患者與過早的冠狀心臟病升高的發生率有關。高膽固醇血患者的LDL水平> 160mg/dL或者> 130mg/dL，具有選自下組的至少兩個危險因素男性性別，家族過早冠狀心臟病史，吸煙(每天超過10支)，高血壓，低 HDL (< 35mg/dL)，糖尿病，高胰島素血癥，腹部肥胖，高脂蛋白，以及個人的腦血管疾病史或閉合性外周血管疾病。高甘油三酯患者的甘油三酯(TG)水平> 250mg/dL。因此，高血脂患者定義為其膽固醇和甘油三酯水平等于或超過同時為高膽固醇血和高甘油三酯患者設定的上述極限。“心肌梗塞”是由于心臟組織的不充分的灌注造成的壞死。心肌梗塞通常是由于曾經因動脈硬化癥變得狹窄的冠狀動脈的血栓性閉塞造成的冠狀血流突然減少引起的。通常，當動脈粥樣硬化斑裂開，斷裂，或潰爛時則發生梗塞，形成附壁血栓，導致冠狀動脈閉塞。患者心肌梗塞的診斷決定了是否需要用本發明的方法治療患者。許多種本領域公知的實驗室試驗在例如Harrison' s中有描述。通常，這些試驗被分為四類(1)組織壞死和炎癥的非特異性指標，(2)心電圖，( 血清酶變化(例如肌氨酸磷酸激酶水平)，和
心臟成像。所屬領域普通技術人員可以很容易使用上述檢測確定患者是否具有心肌梗塞危險，是否患有心肌梗塞，或者是否曾經患過心肌梗塞。除此之外，根據本發明，ILlRL-I核酸分子，或其表達產物的表達水平的增加也是重要的危險因素。確定患病的患者因此能夠從本發明的治療方法中獲益。根據本發明，所述方法包括給患有心肌梗塞的患者施用有效量的能治療患者的心血管疾病的任何上述ILlRL-I分子。“患有心肌梗塞”是指患者具有發病的危險，正在患病， 或者曾經患過心肌梗塞。用所述分子立即進行治療可以通過在梗塞發生之前或之后抑制心肌細胞(受到梗塞影響最大的細胞)的細胞凋亡性細胞死亡而使患者受益。“立即”是指給藥發生在心肌梗塞之前(如果診斷的及時)，或48小時之內，雖然在發作之后14天進行給藥對患者也是有用的。本發明的另一個重要的實施方案是動脈硬化導致的缺血性損傷的治療。動脈硬化是一個用于描述動脈壁變厚變硬的術語。它被認為在美國和大部分西方化社會中是大部分死亡的原因。動脈粥樣硬化是動脈硬化的一種類型，是大部分冠狀動脈疾病，主動脈瘤和下肢動脈疾病(包括外周血管動脈病)的原因，也可以導致腦血管疾病。動脈粥樣硬化在美國是死亡的最主要的原因。正常的動脈典型地在其內側具有線紋，只有一層內皮細胞，內膜。內膜覆蓋著中膜，其中只含有一種細胞類型，平滑肌細胞。動脈的最外層是外膜。隨著年齡變化，外膜厚度不斷增加，部分是由于中膜中的平滑肌細胞的遷移和增殖。各種外傷事件或介入也會導致內膜厚度類似地增加，例如當氣球擴張術引起血管壁的損傷的時候。本發明與治療動脈硬化病引起的缺血性損傷有關。這里所說的動脈硬化病是指傳統的動脈粥樣硬化，加重的動脈粥樣硬化，動脈粥樣硬化損傷，以及任何其它由不希望的內皮和/或血管平滑肌細胞的增殖表征的動脈硬化疾病，包括糖尿病的血管并發癥。本發明的另一個重要的實施方案是心力衰竭的治療。心力衰竭是具有共同的心臟泵送損傷特性的各種疾病的臨床癥狀，表征為心臟不能泵送出組織代謝所需要的血液，或者僅僅是由于充注壓力升高而造成的這種情況。本發明的另一個重要的實施方案是心臟肥大的治療。這種疾病典型地表征為左心室肥大，通常是非擴張的心室，并且沒有明顯的前述原因。目前診斷的方法包括心電圖和超聲心動圖。但是許多患者都是無癥狀的，可能是患有已知疾病的患者的親屬。不幸的是，這種疾病第一表現可能就是突然的死亡，通常是在兒童和青年中，通常是在身體活動之后。減少心血管疾病的危險或者治療心血管疾病的試劑包括選自下組的試劑抗炎性制劑，抗血栓形成制劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑，能結合細胞粘附分子并能抑制白細胞粘附到這些分子上的能力的試劑(例如抗細胞粘附分子抗體)，鈣通道阻斷劑，腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2 抑制劑，血管緊張素系統抑制劑，和/或其組合。一種優選的試劑是阿斯匹林。本發明的治療劑的給藥的方式和劑量隨要治療的疾病的特定階段，要治療的患者的年齡和身體狀況，治療的持續時間，同時所進行的治療的種類(如果有的話)，給藥的特定方式，以及健康從業人員知識和實踐范圍內的類似因素的不同而不同。這里所說的本發明的試劑是以能治療任何上述心血管疾病的有效量給藥的。通常，有效量是能在患者的所希望的組織中引起有益變化的任何量。優選地，有效量是指足以在特定疾病中引起有利的表型變化，例如減輕，緩和或消除癥狀或整個疾病的量。通常，有效量是藥物制劑單獨或與其它藥物一起能夠產生所需反應的量。這可能包括暫時性減緩所述疾病的發展，更優選的是，其包括永久性地使所述疾病停止發展，或者延遲所述疾病的發作或者預防所述疾病的發生。這可以通過常規方法進行監測。通常，活性化合物的劑量是從大約每天0. 01mg/kg至每天1000mg/kg。預期劑量范圍從50_500mg/ kg是適當的，優選口服并且每天一次或幾次服藥。當然，劑量應當取決于要治療的特定疾病，疾病的嚴重程度，患者參數包括年齡， 身體條件，體形大小和體重，治療的持續時間，同時進行的其它治療的種類(如果有的話)， 給藥的特定方式，以及健康從業人員知識和實踐范圍內的類似因素。特定形式的給藥可以使用較低的劑量，例如靜脈內給藥。在這種情況下，初始劑量的使用在患者中引起的反應是不夠的，可以使用達到患者耐受極限的更高的量(或者通過不同的更局部的遞送方式達到更高的劑量)。每天多倍劑量可以使化合物達到合適的全身水平。優選通常使用最大劑量， 也就是根據合理的醫學判斷確定的最高安全劑量。所屬領域技術人員應當了解，患者可以出于醫學原因，生理原因或任何其它原因持續使用較低劑量或者可耐受的劑量。任選地，本發明的試劑可以和藥學可接收的載體組合形成藥學制劑。這里所說的術語“藥學可接收的載體”是指適用于給人施用的一種或多種相容的固體或液體填充物，稀釋劑或膠囊封裝物質。術語“載體，，表示有機或無機成分，其是天然的或合成的，與活性成分相結合以幫助使用。藥物組合物中的組分也是能與本發明的分子共混和的，它們的互相混和不產生能破壞所需藥物療效的相互作用。在一些方面，所述藥物制劑含有有效量的可治療疾病的本發明的試劑。藥物制劑可以含有合適的緩沖溶液，包括乙酸鹽，檸檬酸鹽，硼酸鹽或磷酸鹽。所述藥物組合物還可以含有，可選擇地，合適的防腐劑，例如苯扎氯銨；氯代丁醇；對羥基苯甲酸酯和硫柳汞。可以使用各種給藥方式。特定方式的選擇取決于所選擇的特定藥物，要治療的疾病的嚴重程度以及治療有效所需要的劑量。一般來講，本發明的方法可以用任何醫學可接收方式進行，醫學可接收的方式是指任何能使活性化合物達到有效的水平而不引起臨床不可接受的副作用。這種給藥方式包括口服，直腸內，局部，鼻腔內，真皮內，穿過皮膚的或腸胃外方式。術語“腸胃外”包括皮下，靜脈內，肌肉內，或灌注。靜脈內或肌肉內方式不是特別適用于長期治療和預防。例如，對患有偏頭痛的患者的急性治療的藥物組合物可以以多種方式配制，并可使用多種給藥方式，包括片劑，膠囊，粉末，栓劑，注射和鼻腔噴霧。藥物制劑可以方便地以任何單位劑量形式使用，可以用制藥領域公知的任何方法制備。所有的方法都包括將活性試劑與一種或多種輔助成分構成的載體結合的步驟。通常，所述組合物是通過將活性化合物與液體載體，粒狀固體載體，或者兩者均勻緊密地結合在一起制備的，如果需要的話，可將產品加工成形。適合于口服給藥的組合物可以以不連續的方式使用，例如膠囊，片劑，錠劑，其中每種都含有預定劑量的活性化合物。其它組合物包括在水溶液中的懸液或非水溶液例如漿液，酏劑或乳劑。適合于腸胃外給藥的組合物可以包括本發明的試劑的無菌水性制劑，其優選是與受體的血液等滲的。這種水性制劑可以根據已知的方法用合適的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配制。無菌注射制劑也可以是無菌注射溶液或在無毒性的腸胃外可接收的稀釋劑或溶劑中的懸液，例如1，3_ 丁二醇溶液。可以使用的可接收的載體或溶劑是水，Ringer溶液，和等滲氯化鈉溶液。除此之外，也可以使用無菌的混和油作為溶劑或懸浮介質。為此目的可以使用任何溫和的混和油，包括合成的單或二甘油酯。除此之外，脂肪酸例如油酸也可以用于制備注射用藥劑。適合于口服，皮下，靜脈內，肌肉內等給藥方式的配制品在Remington' s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA 中有描述。其它遞送系統包括定時釋放，延時釋放或者持續釋放的遞送系統。這種系統可以避免本發明的試劑的重復給藥，為患者和醫師提供了方便。所屬領域普通技術人員公知并可獲得許多釋放遞送系統。其中包括基于聚合物的系統例如聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸鹽，聚己酸內酯，聚酰胺酯，聚原酸酯，聚羥基丁酸，和聚酐。含有藥物的上述聚合物的微膠囊在，例如美國專利序列號5，075，109中有描述。遞送系統還包括非聚合物系統，包括 含有留醇例如膽固醇，膽固醇酯和脂肪酸或中性脂例如單，雙和三甘油酯的脂類；水凝膠釋放系統；sylastic系統；基于肽的系統；蠟質外殼；用傳統粘合劑和賦形劑制備的壓縮片劑；部分融合的植入物等。特定的例子包括但不限于(a)腐蝕系統，其中本發明的試劑被置于如美國專利序列號4，452，775 ；4，675，189 ；和5，736，152所述的基質中；以及(b)擴散系統，其中活性成分以受控速度從如美國專利序列號3，854，480 ；5, 133，974 ；和5，407，686 所述的聚合物中滲透出來。除此之外，也可以使用基于泵的硬件遞送系統，其中一些適合于植入。使用長期持續釋放的植入物可能是合乎需要的。這里所說的長期釋放是指所構建和放置的植入物能夠釋放治療水平的活性成分達至少30天，優選的是60天。長期持續釋放的植入物是所屬領域普通技術人員所公知的，包括上述的一些釋放系統。特定的例子包括但不限于長期持續釋放的植入物，如美國專利序列號4，748，024，和加拿大專利序列號 1330939中所述。本發明還包括本發明的ILlRL-I分子(核酸和多肽，和/或其片段)之外的其它試劑的給藥，在一些實施方案中是共同給藥，這些試劑在以有效量給藥的時候可以與本發明的分子協作，具有附加作用和/或發生協同作用，以(i)調節心臟細胞的抗凋亡活性，以及 ( )治療其中涉及本發明的分子的心臟細胞抗凋亡活性的任何疾病。除本發明的分子之外的試劑包括抗炎性制劑，抗血栓形成制劑，抗凝血劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑，降脂齊U，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑，能與細胞粘附分子結合并能抑制白細胞的與此分子粘附能力的試劑，鈣通道阻斷劑，β -腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2抑制劑，血管緊張素系統抑制劑，抗-高血壓藥，和/或其組合。
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“抗炎性”制劑包括烯氯苯乙酸；阿氯米松二丙酸鹽；丙縮阿爾孕酮；α淀粉酶； 戊縮去炎松；安西非特；氨基苯酰基苯乙酸鈉；鹽酸氨普立糖；阿那白滯素；阿尼羅酸；阿尼扎芬；炎爽痛；巴柳氮二鈉；苯吲酸；苯惡洛芬；鹽酸芐達明；菠蘿蛋白酶；溴哌莫；布地縮松；卡洛芬；芴丙酸；噌戊唑酮；克利洛芬；丙酸氯氟美松；丁酸氯氟美松酮；氯吡酸；丙酸氯硫卡松；Cormethasone Acetate ；去氧可的松；地夫可特；地奈德；去羥米松；地塞米松二丙酸鹽；環氟拉嗪；二氯苯胺苯乙酸鈉；雙醋酸二氟松；二氟米酮鈉；二氟苯水楊酸； 醋丁二氟龍；地弗他酮；二甲亞砜；羥西縮松；恩甲羥松；恩莫單抗；依諾利康鈉；甲嘧啶唑；依托度酸；依托非那酯；聯苯乙酸；非那莫；聯苯丁酮酸；芬氯酸；苯克洛酸；芬多沙； Fenpipalone ；雙苯噻酸；夫拉扎酮；氟惡米松；氟滅酸；Flumizole ；醋酸去氟膚輕松；氟胺煙酸；氟胺煙酸甲葡胺；氟考丁酯；醋酸氟甲龍；氟喹宗；氟聯苯丙酸；氟瑞托芬；氟替卡松丙酸酯；呋喃洛芬；制吐劑；氯氟松；丙酯烏倍他索；醋酸鹵潑尼松；對異丁基苯乙酸；布洛芬；布洛芬鋁；Ibuprofen Piconol ；伊洛達普；茚甲新；茚甲新鈉；噴哚洛芬；雙甲氧苯吲哚；吲四唑；醋酸異氟潑尼松；異肟；伊索昔康；酮丙酸；鹽酸洛非咪唑；氯諾昔康；氯替潑諾；甲氯芬那酸鈉；甲氯滅酸；甲氯松二丁酸鹽；甲滅酸；美沙拉嗪；美西拉宗；甲基去氫氫化可的松；莫尼氟酯；萘丁美酮；甲氧萘丙酸；甲氧萘丙酸鈉；萘普索；尼馬宗；奧沙拉嗪鈉；肝蛋白；奧帕諾辛；惡丙嗪；羥保泰松；鹽酸瑞尼托林；戊聚糖聚硫酸鈉；Phenbutaz0ne SodiumGlycerate ；吡非尼酮；吡氧噻嗪；吡氧噻嗪肉桂酸鹽；吡氧噻嗪；環吡酮胺；吡丙芬；潑那扎特；普立非酮；普羅度酸；普羅喹宗；普羅沙唑；普羅沙唑檸檬酸鹽；利美索龍； 氯馬扎利；柳膽來司；沙那西定；雙水楊酯；Salycilates ；血根氯銨；司克拉宗；絲美辛；舒多昔康；舒林酸；舒洛芬；他美辛；他尼氟酯；他洛沙酯；特丁非隆；替尼達普；替尼達普鈉； 替諾昔康；替昔康；Tesimide ；Tetrydamine ；硫平酸；氫可的松特戊酸鹽；甲苯酰吡酸；甲苯酰吡酸鈉；三氯氟松；三氟米酯；齊多美辛；糖皮質激素；和佐美酸鈉。一種優選的抗炎性制劑是阿斯匹林。“抗血栓形成”和/或“溶解血纖維蛋白”制劑包括血纖維蛋白溶酶原(通過與前激肽釋放酶，激肽原，因子XII，XIIIa，血纖維蛋白溶酶原激活劑前體，以及組織血纖維蛋白溶酶原激活劑[TPA]的相互作用作用于血纖維蛋白溶酶)，鏈激酶；尿激酶；甲氧苯基化纖維蛋白溶酶-鏈激酶激活劑復合物；前尿激酶；O^ro-UK) ；rTPA (阿替普酶或溶栓活性酶；“r” 表示重組)；rPro-UK ；Abbokinase ；阿尼普酶；Sreptase Anagrelide Hydrochloride ；比伐盧定；達肝素鈉；達那肝素鈉；鹽酸達唑氧苯；硫酸依非加群；依諾肝素鈉；伊非曲班；伊非曲班鈉；亭扎肝素鈉；瑞替普酶；三苯格雷；丙酮芐羥香豆素；和右旋糖苷。“抗血小板”制劑包括Clopridogrel ；苯磺唑酮；阿斯匹林；雙嘧哌胺醇；安妥明； 氨基甲酸吡啶；PGE ；胰高血糖素；抗血清素藥物；咖啡因；茶堿己酮可可堿；噻氯匹定；和阿那格雷。“降脂”劑包括吉非羅齊；cholystyramine ；考來替潑；煙酸，普羅布考洛伐他汀， 氟伐他汀，辛伐他汀，阿伐他汀，普伐他汀，和cirivastatin。“直接凝血酶抑制劑”包括水蛭素，水蛭原，水蛭肽，agatroban, PPACK,以及凝血酶類似物。“糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑”同時包括抗體和非抗體，包括但不限于ReoPro (阿昔單抗)，拉米非班，和替羅非班。
“鈣通道阻斷劑”是在化學性質不同類的化合物，在對各種疾病包括幾種心血管疾病的控制中具有重要的治療價值，所述的心血管疾病例如高血壓，絞痛，和心律不齊 (Fleckenstein, Cir. Res. v. 52, (suppl. 1), p.13-16(1983) ；Fleckenstein, Experimental Factsand Therapeutic Prospects,John Wiley,New York(1983) ；McCal1,D. ,Curr Pract Cardiol, v. 10，p. 1-11(1985))。鈣通道阻斷劑是一種不同種類的藥物組，可以通過調節細 IfilifflitK^^MffIiiiAifflIfi (Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Edition, Mack Publishing Company, Eaton, PA, p. 963(1995))。*艮據本發明得可用得大多數目前可獲得得鈣通道阻斷劑屬于藥物的三種主要類別，二氫吡啶，例如硝苯吡啶，苯基烷基胺，例如戊脈安，以及苯并噻吖庚因，例如硫氮酮。根據本發明其它可用的鈣通道阻斷劑包括但不限于，氨利酮，阿姆羅赫，芐環烷，非洛地平，苯乙二苯丙胺，氟苯桂嗪，伊拉地平，硝苯芐胺啶，印楝素酸，perhexilene，戈洛帕米，噻帕米和噻帕米類似物(例如1993R0-1H933)，苯妥英，巴比妥酸鹽，和肽強啡肽，-蝸牛毒素，和-蜘蛛毒素，及其類似物和/或其藥學可接收的鹽。“ β -腎上腺素受體阻斷試劑”是一類能對抗心絞痛，高血壓，和心律不齊中兒茶酚胺的心血管作用的藥物。腎上腺素受體阻斷劑包括但不限于，氨酰心安，醋丁酰心安，烯丙心安，百部堿，倍他索洛爾，丁下腈心安，山羊豆苷，噻利洛爾，hedroxalol, 茚諾洛爾，柳胺芐心定，左布諾洛爾，甲吲哚心安，methypranol, metindol,甲氧乙心安， metrizoranolol，烯丙氧心安，吲哚洛爾，普萘洛爾，醋氨心安，醋氨心安，sotalolnadolol， 甲硫心安，tomalolol，噻嗎心安，氯甲苯心安，噴布洛爾，三甲苯心安，2-(3-(1,1-二甲基乙基)-氨基-2-羥基丙氧基)-3-pyridenecarbonitrilHCI，1- 丁基氨基-3- (2，5- 二氯苯氧基)-2-丙醇，1-異丙胺基-3- (4- (2-環丙基甲氧基乙基)苯氧基)-2-丙醇，3-異丙胺基-1- (7-甲基茚滿-4-基氧)-2- 丁醇，2- (3-t- 丁胺基-2-羥基-丙基硫)-4- (5-氨甲酰基-2-噻吩基)噻唑，7-(2-羥基-3-t-丁胺基丙氧基)苯酞。上述化合物可以使用其同分異構體混合物，或者分別使用其左旋形式或右旋形式。環氧合酶-2 (C0X-2)是環氧合酶的一種近來才被識別的形式。“環氧合酶”是存在于大部分能從花生四烯酸產生各種前列腺素和凝血惡烷的組織中的酶復合物。非留族，抗炎性藥物發揮其大部分抗炎性，止痛和退熱活性，并通過抑制環氧合酶(也稱作前列腺素 G/H合酶和/或前列腺素-內過氧化物合酶)。最初，只知道一種形式的環氧合酶，“組成型酶”或環氧合酶-1 (C0X-1)。它最初是在牛精囊中被發現的。環氧合酶-2(C0X1)最初是從小雞，鼠和人中被克隆，測序和鑒定的(參見，例如美國專利序列號5，543，297，1996年8月6日由Cromlish等發明，由Merck Frosst Canada, Inc. , Kirkland, CA ^ "Human cyclooxygenase-2cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2activity，，)。這種酶與 C0X-1 不同。C0X-2 可快速和容易地被多種試劑誘導，所述試劑包括有絲分裂素，內毒素，激素，細胞因子和生長因子。由于前列腺素同時具有生理學和病理學功能，組成型酶，C0X-1在很大程度上負責前列腺素的內源基底釋放，因此具有重要的生理學功能例如維持胃腸的完整性和腎臟的血液流動。相反，誘導形式的C0X-2主要負責前列腺素的病理性效果，作為對如炎性試劑，激素，生長因子和細胞因子的試劑的反應，可快速誘導該酶。因此，C0X-2的選擇性抑制劑對于傳統的非留族抗炎性藥物具有類似的抗炎性，退熱和止痛性質，除此之外還抑制激素誘導的子宮收縮，還具有潛在的抗癌效果，但副作用有所減輕。特別是，這種C0X-2抑制劑可能具有降低的胃腸毒性，降低的對腎臟的副作用，減短的流血時間，在阿斯匹林過敏的哮喘患者中具有降低的誘發哮喘的可能性，因此根據本發明是有用的。有多種選擇性“C0X-2抑制劑”都是所屬領域已知的。包括但不限于美國專利序列號 5，474，995 “Phenyl heterocycles as C0X_2inhibitors，，；美國專利序列號 5,521,213 "Diaryl bicyclic heterocycles as inhibitors of cyclooxygenase-2，，；美國專利序列號 5，536，752 "Phenyl heterocycles as C0X_2inhibitors，，;美國專利序列號 5，550，142“Phenyl heterocycles as C0X_2inhibitors”;美國專利序列號 5，552，422“Aryl substituted 5,5fused aromatic nitrogen compounds as anti-inflammatory agents"； 美國專利序列號 5，604，253 "N-Benzylindol-3-yl propanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors，，;美國專利序列號 5, 604, 260“5-Methanesulfonamido-l_ind anones as an inhibitor of cyclooxygenase-2，，;美國專利序列號 5，639，780 "N-Benzyl indol-3-yl butanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors，，；美 15專禾 ^iJ^j 5, 677, 318 "Diphenyl-1, 2-3-thiadiazoles as anti~inf lammatory agents" 專利序列號 5，691, 374"Diaryl-5-oxygenated-2-(5H)-furanones as C0X-2inhibitors"； 美國專禾丨J序歹丨J 號 5，698，584 "3,4-Diaryl-2-hydroxy-2, 5-dihydrofurans as prodrugs to C0X-2inhibitors，，；美國專利序列號 5，710，140 ‘‘Phenyl heterocycles as C0X-2inhibitors，，；美國專利序列號 5，733，909 "Diphenyl stilbenes as prodrugs to C0X-2inhibitors，，；美國專利序列號 5，789，413 "Alkylated styrenes as prodrugs to C0X-2inhibitors，，;美國專利序列號 5，817，700 "Bisaryl cyclobutenes derivatives as cyclooxygenase inhibitors，，;美國專利序列號5，849，943"Stilbene derivatives useful as cyclooxygenase_2inhibitors，，;美國專利序列號 5，861，419 “Substituted pyridines as selective cyclooxygenase_2inhibitors，，；美國專利序列號 5，922，742 "Pyridinyl-2-cyclopenten-l-ones as selective cyclooxygenase_2inhibitors，，；美國專利序列號 5, 925, 631"Alkylated styrenes as prodrugs to C0X_2inhibitors，，中所述的 C0X-2抑制劑；所有專利的專利權人均為Merck Frosst Canada, Inc. (Kirkland，CA or Merck & Co.， Inc. (Rahway, NJ) 美國專利序列號 5，643，933，專利權人為 G. D. karle & Co. (Skokie, IL)，發明名禾爾為 -"Substituted sulfonylphenylheterocycIes as cyclooxygenase-2and 5-lipoxygenase inhibitors. ”的專利也描述了其它的C0X-2抑制劑。許多上述的C0X-2抑制劑都是選擇性C0X-2抑制劑的前體藥物，通過在體內轉化為活性的和選擇性的C0X-2抑制劑來發揮作用。由上述C0X-2抑制劑前體藥物形成的活性的和選擇性的C0X-2抑制劑在1995年1月5日公開的WO 95/00501，1995年7月13 日公開的WO 95/18799和1995年12月12日公開的美國專利序列號5，474，995中有詳 MWi^Eo “Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase^activity"的美國專利序列號5，543, 297的教導，所屬領域普通技術人員應當能夠確定一種試劑是否是選擇性C0X-2抑制劑或C0X-2抑制劑的前體，因此也是本發明的一部分。“血管緊張素系統抑制劑”是一種能干擾血管緊張素II的功能，合成或分解代謝的試劑。這類試劑包括但不限于血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑，血管緊張素II拮抗劑，血管緊張素II受體拮抗劑，能激活血管緊張素II的分解代謝的試劑，以及可以防止血管緊張素I的合成從而最終防止血管緊張素II的合成。腎素-血管緊張素系統涉及血液動力學和水和電解質平衡的調節。能降低血液容積，腎灌注壓力，或血漿中Na+濃度的因素可以激活該系統，而能增加這些參數的因素則能夠抑制其功能。血管緊張素I和血管緊張素II是通過酶促的腎素-血管緊張素途徑合成的。當酶腎素作用于血管緊張素原，一種血漿中的假球蛋白，以產生十肽血管緊張素I的時候則啟動了合成過程。血管緊張素I被血管緊張素轉換酶(ACE)轉換為血管緊張素II (血管緊張素-[1-8]八肽)。后者是一種活性升壓劑，是在各種哺乳動物例如人中引起幾種形式的高血壓的試劑。血管緊張素(腎素-血管緊張素)系統是能干擾血管緊張素原或血管緊張素I到血管緊張素II的產生，或能干擾血管緊張素II的活性的化合物。這些化合物是所屬領域普通技術人員公知的，包括能抑制血管緊張素II的最終產生過程中涉及的酶的化合物，包括腎素和ACE。還包括能干擾血管緊張素在產生之后的活性的化合物。這類化合物的例子包括抗體(例如腎素抗體)，氨基酸及其類似物(包括與大分子結合的氨基酸)，肽(包括血管緊張素和血管緊張素I的肽類似物)。前腎素相關類似物等。那些最有效的和有益的腎素-血管緊張素系統抑制劑是腎素抑制劑，ACE抑制劑，和血管緊張素II拮抗劑。在本發明的一個優選的實施方案中，腎素-血管緊張素系統抑制劑是腎素抑制劑，ACE抑制劑， 和血管緊張素II拮抗劑。“血管緊張素II拮抗劑”是能夠通過與血管緊張素II的受體結合來干擾血管緊張素II的活性的化合物。血管緊張素II拮抗劑是公知的，包括肽化合物和非肽化合物。大部分血管緊張素II拮抗劑都是經過輕微修飾的同源物，其中通過將第8位的苯基丙氨酸替換為其它氨基酸減弱其激動劑活性；通過其它能減緩體內退化的取代增強穩定性。血管緊張素II拮抗劑的實例包括肽類化合物(例如肌丙抗增壓素，[(San1) (Val5) (Ala8)]血管緊張素_(1_8)八肽以及相關的類似物)；N-取代的咪唑-2-酮(美國專利序列號5，087, 634)；醋酸咪唑衍生物包括2-N- 丁基-4-氯-1-(2-chlorobenzile)， 咪唑-5-醋酸(參見 Long et al.，J. Pharmacol. Exp. Ther. 247 (1), 1-7 (1988)) ；4， 5，6，7_四氫-IH-咪唑并W，5-c]吡啶-6-羧酸及其類似的衍生物(美國專利序列號 4，816，463) ；N2-四唑-葡糖苷酸類似物(美國專利序列號5，085，992)；取代的吡咯，吡唑， 和tryazoles (美國專利序列號5，081，127)；苯酚和雜環衍生物例如1,3-咪唑(美國專利序列號5，073，566)；咪唑并融合的7元雜環(美國專利序列號5，064，825)；肽(例如美國專利序列號4，772，684)；血管緊張素II的抗體(例如美國專利序列號4，302，386)；和芳烷基咪唑化合物例如二苯基-甲基取代的咪唑(例如EP號253，310，1988年1月20日)； ES8891 (N-嗎啉代乙酰基-(-1-萘基)-L-丙氨酰-(4，噻唑基)-L-丙氨酰(35，45) -4-氨 ■ -3- 15 -5-環-hexapentanoyl-N-hexylamide, Sankyo Company, Ltd.，Tokyo, Japan)； SKF 108566 (E-2-[2-丁基-1-(羧苯基)甲基]IH-咪唑-5-基[methylane]-2-噻吩丙 W., Smith Kline Beecham Pharmaceuticals, PA) -MtMK (DUP753/MK954, DuPont Merck Pharmaceutical Company) ；Remikirin(R042-5892, F. Hoffman LaRoche AG) ；A2 M ^O (Marion Merrill Dow)和特定的非肽雜環(G. D. karle and Company)。“血管緊張素轉換酶”(ACE)是一種能催化血管緊張素I轉化為血管緊張素II的酶。ACE抑制劑包括能通過抑制ACE活性干擾腎素-血管緊張素系統從而減少或消除升壓物質血管緊張素II的形成的氨基酸及其衍生物，肽，包括二肽和三肽，以及ACE抗體。ACE 抑制劑在醫學上已經被用于治療高血壓，充血性心力衰竭，心肌梗塞和腎病。已知可用作 ACE抑制劑的化合物包括酰基巰基和巰基烷酰基脯氨酸例如卡托普利(美國專利序列號 4，105，776)和佐芬普利(美國專利序列號4，316，906)，羧烷基二肽例如依那普利(美國專利序列號4，374，829)，賴諾普利(美國專利序列號4，374，829)，喹那普利(美國專利序列號4，344，949)，雷米普利(美國專利序列號4，587，258)，和培哚普利(美國專利序列號 4，508，729)，羧烷基二肽類似物例如硅氨(美國專利序列號4，512，924)和貝那普利(美國專利序列號4，410，520)，磷酰基烷酰基脯氨酸例如福辛普利(美國專利序列號4，337，201) 禾口 trandolopril。“腎素抑制劑”是能夠干擾腎素活性的化合物。腎素抑制劑包括氨基酸及其衍生物，肽及其衍生物，以及腎素的抗體。美國專利中所給出的腎素抑制劑的實例如下肽的脲衍生物(美國專利序列號5，116，835)；通過非肽鍵相連的氨基酸(美國專利序列號 5，114，937) ；二肽和三肽衍生物(美國專利序列號5，106, 835)；氨基酸及其衍生物(美國專利序列號5，104，869和5，095，119) ；二醇磺胺和亞磺酰(美國專利序列號5，098，924)； 修飾的肽(美國專利序列號5，095，006)；肽酰-氨酰基氨基二醇氨基甲酸酯(美國專利序列號5，089，471) ；pyrolimidazolones (美國專利序列號5，075，451)；含有氟和氯施德丁或 statone的肽(美國專利序列號5，066，643)；肽酰氨基二醇(美國專利序列號5，063，208 和4，845，079) ；N-嗎啉代衍生物(美國專利序列號5，055，466)；抑胃肽衍生物(美國專利序列號4，980，觀3) ；N-雜環醇(美國專利序列號4，885，四2)；腎素的單克隆抗體(美國專利序列號4，780，401)；和多種其它肽及其類似物(美國專利序列號5，071，837，5，064，965， 5，063，207，5，036，054，5，036，053，5，034，512，和 4，894，437)。能與細胞粘附分子結合并能抑制白細胞與這種分子結合能力的試劑包括多肽試齊U。這種多肽試劑包括根據傳統方法制備的多克隆和單克隆抗體。這種抗體是所屬領域已知的，包括抗-ICAM 1抗體和其它上述抗體。抗凝血劑包括但不限于蛇毒去纖維酶；抗凝血劑檸檬酸鹽右旋葡萄糖溶液；抗凝血劑檸檬酸鹽磷酸鹽右旋葡萄糖腺嘌呤溶液；抗凝血劑檸檬酸鹽磷酸鹽優選葡萄糖溶液； 抗凝血劑肝素溶液；抗凝血劑檸檬酸鈉溶液；阿地肝素鈉；比伐盧定；溴茚二酮；達肝素鈉； 地西盧定；雙香豆素；肝素鈣；肝素鈉；阿樸酸鈉；甲磺酸萘夫西林；苯丙羥基香豆素；亭扎肝素鈉；和丙酮芐羥香豆素內。肝素可以在中風發展的過程中穩定癥狀，但是由于其增加了腦或其它組織出血的可能性，抗凝血劑對于急性完全中風沒有用(而且可能具有危險性)，并且對于高血壓是禁忌的。雖然時間的選擇還存在爭議，但是抗凝血劑可用于預防復發性的心臟栓塞。凝血塊溶解試劑，包括組織血纖維蛋白溶酶原激活劑和鏈激酶正在被評定是否可以作為急性中風的最早期治療。最近發現尼莫地平可以提高缺血性中風的存活率和臨床效果。除了阿司匹林以外，噻氯匹定是另一種可有效用于中風治療的抗血小板試劑。 70%到99%的頸內動脈狹窄患者需要進行動脈內膜切除術。但是，大多數權威人士認為基底脊椎系統TIA的患者，因曾患過中風而具有明顯缺陷的患者，或者正患有中風的患者不需要進行頸動脈內膜切除術。
HMG-CoA(3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶Α)還原酶是一種能催化膽固醇生物合成過程中的限速反應(HMG-CoA6M甲羥戊酸)的微粒體酶。HMG-CoA還原酶抑制劑可抑制 HMG-CoA還原酶，最終能抑制膽固醇的合成。許多HMG-CoA還原酶抑制劑已被用于治療高膽固醇血癥患者。最近發現HMG-CoA還原酶抑制劑可有效治療中風(Endres M, et al. ,Proc Natl Acad Sci US A,1998,95 :8880-5)。可用于與本發明的試劑一同給藥的HMG-CoA還原酶抑制劑包括但不限于辛伐他汀(美國專利序列號4，444，784)；洛伐他汀(美國專利序列號4，231，938)；普伐他汀鈉 (美國專利序列號4，346，227)；氟伐他汀(美國專利序列號4，739，073)；阿伐他汀(美國專利序列號5，273，995)；西立伐他汀，和如美國專利序列號5，622，985 ；美國專利序列號5，135，935 ；美國專利序列號5，356，896 ；美國專利序列號4，920，109 ；美國專利序列號5，286，895;美國專利序列號5，262，435 ；美國專利序列號5，260, 332;美國專利序列號5，317，031 ；美國專利序列號5，283, 256 ；美國專利序列號5，256，689 ；美國專利序列號5，182，298 ；美國專利序列號5，369，125 ；美國專利序列號5，302，604 ；美國專利序列號5，166，171 ；美國專利序列號5，202，327 ；美國專利序列號5，276，021 ；美國專利序列號5，196，440;美國專利序列號5，091，386;美國專利序列號5，091，378;美國專利序列號4，904，646 ；美國專利序列號5，385，932 ；美國專利序列號5，250，435 ；美國專利序列號5，132，312 ；美國專利序列號5，130，306 ；美國專利序列號5，116，870 ；美國專利序列號5，112，857 ；美國專利序列號5，102,911 ；美國專利序列號5，098，931 ；美國專利序列號5，081，136;美國專利序列號5，025，000;美國專利序列號5，021，453;美國專利序列號5，017，716 ；美國專利序列號5，001, 144 ；美國專利序列號5，001, 128 ；美國專利序列號4，997,837 ；美國專利序列號4，996，234 ；美國專利序列號4，994，494 ；美國專利序列號4，992，429 ；美國專利序列號4，970，231 ；美國專利序列號4，968，693 ；美國專利序列號4，963，538 ；美國專利序列號4，957，940 ；美國專利序列號4，950，675 ；美國專利序列號4，946，864 ；美國專利序列號4，946，860 ；美國專利序列號4，940，800 ；美國專利序列號4，940，727 ；美國專利序列號4，939，143 ；美國專利序列號4，929，620 ；美國專利序列號 4，923，861 ；美國專利序列號4，906，657 ；美國專利序列號4，906，624 ；和美國專利序列號 4，897，402中所述的其它試劑，在此引入這些專利所公開的內容作為參考。一氧化氮(NO)是一種在心血管，神經和免疫系統具有多種生理學功能的信使分子(Griffith, TM et al.，JAm Coll Cardiol, 1988,12 :797-806)。它可以調節血管松弛， 神經傳遞和病原體的抑制。NO是通過NO合酶由L-精氨酸的胍基氮產生的(Moncada，S and Higgs，EA，Eur J Clin Invest, 1991, 21 =361-374) 能正調控內皮細胞一氧化氮合酶的試劑包括但不限于L-精氨酸，rho GTP酶功能抑制劑(參見國際申請WO 99/47153， 在此引入其內容作為參考)，以及能破壞肌動蛋白細胞骨骼結構的試劑(參見國際申請WO 00/03746，在此引入其內容作為參考)。這里所說的“一同給藥”是指同時給予兩種或更多種本發明的化合物(例如 ILlRL-I核酸和/或多肽，以及一種已知對治療例如心血管疾病有益的試劑，例如一種抗凝血劑)，在單一的組合物中作為混合物存在，或者是時間緊密地順序加入以使得所述化合物可以起到附加作用或者協同作用，即在心血管疾病中減少心肌細胞死亡。本發明還包括固相核酸分子陣列。所述陣列基本由一組核苷酸分子，其表達產物或其片段(核酸或多肽分子的片段)組成，所述組包括固定于固相上的一種ILlRL-I核酸分子和至少一種對照核酸。在優選的實施方案中，所述核苷酸組分子包括最大數目為100 種的不同的核酸分子。在重要的實施方案中，所述核苷酸組包括最大數目為10種的不同的核酸分子。根據本發明，可使用微陣列技術的標準雜交方法確定核酸表達的模式，并識別核酸表達。已知微陣列技術還可以稱為DNA芯片技術，基因芯片技術，以及固相核酸陣列技術，這都是所屬領域普通技術人員熟知的，它是基于但不限于獲得所識別的核酸探針(例如本發明中所描述的分子例如IL1RL-1)在固定底物上的陣列，用報道分子(例如放射性， 化學發光，或熒光標記例如熒光素，Cye3-dUTP或Cye5-dUTP)標記靶分子，使靶核酸與探針雜交，測定靶-探針的雜交。具有完全能與靶序列匹配的核酸序列的探針通常比不完全匹配的探針能檢測到更強的報道分子信號。核酸微陣列技術中用到的許多組分和技術在 Nature Genetics, Vol. 21, Jan 1999中有描述，在此引入其全文作為參考。根據本發明，微陣列底物包括但不限于玻璃，二氧化硅，硅酸鋁，硼硅酸鹽，金屬氧化物例如氧化鋁和氧化鎳，各種粘土，硝化纖維，或尼龍。在所有的實施方案中優選使用玻璃底物。根據本發明探針選自核酸，所述核酸包括但不限于DNA，基因組DNA，cDNA，和寡核苷酸；可以是天然的或是合成的。寡核苷酸探針優選為20到25聚體的寡核苷酸，DNA/cDNA 探針優選為500-5000堿基長，但是也可以用其它長度。合適的探針長度應當由所屬領域技術人員根據本領域已知的程序來確定。在一個實施方案中，優選的探針是兩個或多個如SEQ ID NO :1和/或3所示的核苷酸分子組。探針可以用所屬領域普通技術人員已知的方法例如凝膠過濾或沉淀以除去雜質。在一個實施方案中，微陣列底物可以被一種化合物包裹以促進探針在底物上的合成。這種化合物包括但不限于寡乙二醇。在另一個實施方案中，可在底物上使用偶聯劑或偶聯基團，以使第一個核苷酸或寡核苷酸共價連接到底物上。這種試劑或基團包括但不限于氨基，羥基，溴基和羧基。這些反應性基團優選通過烴基與底物連接，所述烴基例如亞烴基或亞苯基二價基，其中一價的位置由鏈連接占據而另一價與反應基團相連。這些烴基可以含有達十個碳原子，優選達六個碳原子。亞烴基通常優選在主鏈上含有兩個到四個碳原子。這些過程以及其它的細節在例如美國專利序列號4，458，066中公開，在此引入其全文作為參考。在一個實施方案中，探針是用如光控的化學合成，光化學去保護，或將核酸前體遞送到底物上并最終生成探針的方法在底物上以預定的柵格模式直接合成的。在另一個實施方案中，所述底物可以被一種化合物包裹以增強探針與底物的結合。這種化合物包括但不限于聚賴氨酸，氨基硅烷，氨基反應性硅烷(Nature Genetics, Vol.21, Jan 1999)或鉻。在這個實施方案中，預合成的探針以精確的，預定的體積和柵格模式點樣于底物上，使用計算機控制的機器人以接觸印刷方式或非接觸方式例如噴墨或壓電方式將探針點樣在底物。探針可共價連接在底物上，所使用的方法包括但不限于UV-射線和加熱。靶是選自下組的核酸，包括但不限于DNA，基因組DNA，cDNA, RNA, mRNA，可以是天然的或是合成的。在所有實施方案中，來自懷疑患有或正患有心血管疾病的患者的核酸分子是優選的。在本發明的特定實施方案中，可在底物上連接一種或多種對照核酸分子。優選地，對照核酸分子應可以判斷下述因素，包括但不限于核酸質量和結合特性；試劑質量和效率；雜交的成功，分析的閾值和成功。對照核酸可以包括但不限于基因例如持家基因的表達產物或其片段。要選擇一組心血管疾病標記，優選對例如由基因表達的微陣列分析產生的表達數據進行分析以確定不同類別的患者(每個類別的患者都患有不同的心血管疾病)中的哪個基因是顯著差異表達的。基因表達的有效性可以用Permax計算機軟件確定，也可以使用任何能區別表達的顯著性差異的標準統計軟件包。Permax對大量數據陣列進行置換2_樣品 t-檢驗。對于所觀測的高維向量，Permax軟件對每一個特征進行t-統計，用最大和最小總特征的置換分布評估其顯著性。其主要用途是用于確定所述特征(基因)在兩組(例如對照的健康患者和具有特定心血管疾病的患者)之間是否具有最大差異，用t-統計的值測量 “最大差異”，以及它們的顯著性程度。心血管疾病核酸分子的表達也可以用蛋白檢測方法判斷，以例如通過分別判斷 SEQ ID NO :1和/或3編碼的多肽的表達確定SEQ ID NO :2和/或4的表達。優選的特定的和定量的檢測蛋白質的方法包括但不限于基于質譜的方法例如表面增強激光解吸電離 (SELDI ；例如Ciphergen ProteinChip系統)，基于非質譜的方法，和基于免疫組織化學的方法例如二維凝膠電泳。SELDI方法可以用所屬領域普通技術人員公知的步驟進行，使微量的腫瘤蛋白質蒸發產生單個蛋白的“指紋”，從而可以在一個樣品中同時檢測多個蛋白質的豐度。優選基于SELDI的檢測可以用于表征心血管疾病以及該疾病的各個階段。這種檢測優選包括但不限于下述實例。由RNA微陣列發現的基因產物可以通過SELDI蛋白質盤的特異性捕獲進行選擇性地檢測(例如選擇性SELDI)。由蛋白質篩選(例如二維凝膠電泳)發現的基因產物可以通過“全蛋白SELDI”解析，并將其最優化以可以見到SEQ ID N0:1和/或3中的所感興趣的特定標記。由SELDI對SEQID NO :1和/或3中的多個標記進行檢測得到的腫瘤分類預測模型可以用于SELDI策略。用任何上述微陣列方法確定心血管疾病核酸的表達可以用所屬領域普通技術人員公知的常規方法實施，由蛋白質檢測方法確定的表達可能與用作為心血管疾病患者選擇治療策略的預測方法的標記物的預定水平相關。通過下述實施例本發明應當可以被更充分地理解。但是這些實施例僅僅是舉例說明本發明的實施方案，而并非限制本發明的范圍。
實施例實施例1實驗方法材料與方法機械力裝置在心肌細胞上加載機械負載的實驗通常是在沒有心動周期對照的情況下拉伸細胞，這種方法不能區分收縮相對于松弛的機械負載的差別。在本研究中，我們設計并構建了一種獨特的實驗系統，可以精確地控制培養的心肌細胞中的機械應變和電步進，以特別研究心動周期是如何調節心肌細胞的機械轉導的，并識別這種調節中涉及到的基因。步進應變裝置。使用一種具有多個臺板的儀器實施機械刺激，所述臺板與硅酮彈性體膜的底部接觸，向所述膜施加一個空間上各項同性的雙軸應變(Schaffer JL, et al., J Orthop Res，1993，12 :709-719 ；以及1999年7月16日申請的美國臨時專利申請，發明名稱為 AN APPARATUS FOR STUDYING MYOCARDIAL MECHANICAL OVERLOAD HYPERTROPHY AND USES THREFOR,申請人為Richard Τ. Lee，承接律師備案記錄號為100038. 130，快遞郵件號為EL110243781US)。六個單獨的78mm的膜可以同時拉伸，并通過用步進電機控制每一個臺板的替換實現不同程度的應變。測量的格林應變在1-14%之間，并應精確到 士0. 25% (Cheng GC, et al. , Circ Res, 1997,80 :28-36 ；Brown TD, J Biomechanics, 2000, 33 3-14)。在此研究中，使用8%的雙軸應變。要控制機械應變相對于細胞周期的定時，計算機用電步進每個皿盤，并控制機械應變和電脈沖之間的相位，電脈沖的持續時間，電脈沖的電壓。除此之外，電脈沖具有交替的極性，以將電化學效應例如電極的PH梯度減至最小。每個皿盤上的兩個輸出每一個都連接到一組單獨的電極上。所述皿盤步進的同時具有大約每皿盤500ohm的阻力。正的和負的電源電壓是由兩個電源提供的(6545A，Hewlett Packard Company, Palo Alto，CA)。控制電路被分為兩部分高電壓電路和低電壓或數字信號電路。高電壓電路是一個基于輸入信號轉換輸出的門電路。低電壓電路接收兩個來自計算機的控制信號， 接收來自可變電阻器的脈沖寬度，這可以一起控制正的和負的電壓門。低電壓電路允許電壓脈沖在0-120V DC振幅之間，持續2-37ms。用光連續檢測脈沖，電路的定時和校準通過示波器進行。每個皿盤的電極都是在皿盤內表面底部的兩個弧形的AgCl2線電極，正好在可變形的膜上方。電極是預先制備的，用乙醇滅菌，在每次實驗之前放置到皿盤中，以將銀可能具有的毒性減至最小。用這種方法在M小時的實驗中沒有觀察到細胞死亡或脫離。每個弧形都是120度；我們用二維有限元分析以評估這種結構的勢場的均一性。這些計算評測的{均方根}的勢場的空間變化=四％。因此，此系統可提供高度均一的雙軸機械應變，并且電壓場相對變化較小。機械刺激方法。我們只是分別在第三個心動周期通過電刺激以在“心臟收縮階段” 施加應變，在松弛階段的三分之一心動周期施加應變以在“心臟舒張階段”施加應變。此研究中所使用的條件是(1)對照；( 應變，沒有步進；C3)步進，沒有應變；(4)在心臟收縮階段施加應變；以及( 在心臟舒張階段施加應變。來自1日齡的Sprague-Dawley鼠的新生鼠心肌細胞(NRVM)根據前述方法分離 (Springhorn JP, and Claycomb WC. ， Biochem J, 1989 ；258 73-78 ；Arstall MA, et al.， JMol Cell Cardiol, 1998,30 :1019-25)。NRVM置于具有薄膜涂層的皿中，密度為 2，000，000 個細胞/皿，細胞是在含有7% FCS的DMEM中，培育M小時。細胞匯合大約為85-90%。然后用 10ml Hank 平衡鹽溶液(HBSS，138mM NaCl, 5. 3mM KCl，4· OmM NaHCO3,1. 3mM Cal2,0. 5mM MgCl2,0. 4mM MgSO4,0. 4mM KH2PO4,0. 3mM Na2HPO4, 5. 6mM葡萄糖；Life Technologies, Inc.， Rockville, MD)洗滌兩次使NRVM靜止，并且與^ml含有0. 2% FCS的DMEM培育48-72小時。在這些細胞培養條件中，細胞拍打為40-60次/分鐘。以這個速度，當以70次/分鐘步進的時候我們觀察到微乎其微的競爭。我們進行試捕獲實驗；每個皿上在九個部位進行點樣。所有位點的捕獲效率都是類似的，60V或更高時達到最大捕獲，脈沖寬度為10ms。
39因此選擇電壓為70V，脈沖為10ms，速度為1. 2Hz (70次/分鐘)。在此條件下我們沒有觀察到部分細胞的脫離。轉錄模式。DNA微陣列實驗用鼠的初生心肌細胞進行，在纖連蛋白覆蓋的膜上用不含血清的培養基培養48小時。僅僅在細胞收縮的30分鐘時間內有8%的細胞變形，繼續在沒有應變也沒有步進的條件下培養6小時后制備RNA。這個時間點的選擇是基于從前的研究證明了在這個時間段內可以誘導基因肌腱蛋白(心肌細胞的正對照)。用Affymatrix GeneChip RGU34A(Affymetrix, Inc. ,Santa Clara, CA)進行DNA微陣列雜交實驗。用Affymatrix軟件分析數據。Northern分析。差異表達的基因的cDNA克隆根據GenBank序列用PCR獲得。每個克隆均分別從5’端和3’端測序，保證序列完全等同。DNA微陣列中的正組分通過至少三個獨立實驗，使用三個不同的NRVM來源進行Northern blot雜交分析以證實。總RNA用硫氰酸胍和苯酚氯仿方法提取(Chomcyznski，et al.，Anal. Biochem.，1987，162 :156-159)。 Northern blotting 是將 15gRNA加樣到1. 0%瓊脂糖-甲醛凝膠(2. 0mol/l)上，轉移到尼龍膜(Amersham Pharmacia B iotech AB, Piscataway, NJ),用 UVStratalinker(Stratagene, Inc., La Jolla, CA)進行 UV 交聯。每個探針都與 ExpressHyb 溶液(Clontech Labs.，Inc.，Palo Alto,CA)在68°C雜交1小時。膜用h SSC,0. 05% SDS溶液在室溫洗脫30到40分鐘，洗脫三次，用0. Ix SSC,0. 1%SDS溶液在50°C持續振蕩40分鐘。將膜在-80°C暴露于膠片上， 掃描射線照片，用 Optimas 5. 0 軟件(Optimas Co. /Media Cybernetics, Silver Springs, MD)進行分析。根據膜上的溴化乙啶染色的28S核糖體亞基對密度進行歸一化。結果。圖1顯示了在培養基中的新生心肌細胞中8%周期性機械應變誘導 ILlRL-ImRNA表達的過程(早期，左，晚期，右)。最大誘導量是在3小時，并且持續15小時。圖2顯示了 8%機械應變，血管緊張素受體阻塞(ARB，CP_19116，IOOnM)，血管緊張素 II (Ang II，50nM)，白介素-1β (IL-1 β，lOng/ml)，和佛波酯(PMA, 200nM)在培養的新生鼠心肌細胞中誘導ILlRL-ImRNA表達3小時的效果。應變對ILlRL-ImRNA表達的誘導沒有被血管緊張素受體阻塞阻斷；進一步，用血管緊張素II進行處理沒有誘導ILlRL-ImRNA表達。當不存在機械應變時，IL-I β和PMA處理與ILlRL-ImRNA表達的誘導有關。圖3顯示了 8%機械應變，過氧化氫(H2O2，100 μ Μ)和抗氧化劑，IlRON(IOmM)誘導 ILlRL-ImRNA表達的效果。與機械誘導的肌腱蛋白-C基因的mRNA表達不同，其中肌腱蛋白-C基因在沒有機械應變的條件下被H2A誘導并且被TIRON阻斷，而H2A在沒有應變的條件下不能誘導ILlRL-I并且阻斷應變對ILlRL-I的誘導。在沒有應變的條件下，TIRON輕微減少了 ILlRL-I的mRNA表達。圖4顯示了放線菌素D (5 μ g/ml，左)和環己亞胺(10 μ g/ml，右)對于8%機械應變誘導ILlRL-ImRNA表達的影響。放線菌素D和環己亞胺是在機械應變發生期間加入的。放線菌素D在2小時和4小時的時候阻斷ILlRL-ImRNA表達的誘導，這表示應變對ILlRL-I的誘導是導致ILlRL-I轉錄的增加。蛋白質合成抑制劑，環己亞胺阻斷了應變對ILlRL-ImRNA 表達的誘導，表示ILlRL-ImRNA表達的誘導需要新的蛋白質合成。圖5顯示了 8%機械應變單獨或與白介素-1 β (IL-Ιβ，10ng/ml)，以及佛波酯 (PMA, 100ng/ml) 一起，在沒有應變的條件下對培養的新生心肌細胞中ILlRL-ImRNA表達的作用。Both IL-I β和機械應變單獨均能誘導ILlRL-ImRNA表達，但是在存在IL-I β的條件下機械應變對ILlRL-I的誘導并沒有進一步增加，這表明機械應變和IL-I β在對ILlRL-I 的誘導上并沒有協同作用或附加作用。最強烈誘導ILlRL-I表達的是ΡΜΑ。對ILlRL-ImRNA 表達的誘導能力按次序排列是PMA >應變> IL-I β。圖6顯示了暴露于8%應變下0，1，3，6，9小時的新生鼠心肌細胞。用foieasy試劑盒提取總RNA。將5yg總RNA在瓊脂糖-甲醛凝膠上分離并轉移至尼龍膜上。用UV 光交聯以后，使膜與V-ATP酶B亞基特異的32P-標記的探針雜交。然后在_80°C用增光屏將膜暴露于χ射線膠片下3小時。實施例2介紹細胞因子和心臟損傷。應力激活的細胞因子參與多種形式的心臟損傷和病理生理狀況，最具代表性的是腫瘤壞死因子-α，白介素-1和白介素-6。這些分子在正常的心臟中并不表達，但是在缺血和多次灌注或者血液動力超負荷的時候可以迅速地被誘導，這表明它們在心肌對應力，損傷或生長刺激的初始反應中具有重要作用(Marm DL, Cytokine and Growth Factor Reviews.1996 ；7 :341-354 ；St. John SuttonMG,et al. Circulation.2000 ； 101 :2981-2988)。但是，細胞因子也在病理性心肌狀況包括預后不良的缺血性心臟病和心力衰竭下穩定表達(Pulkki KJ, et al. .Annals of Medicine. 1997 ；29 :339-343 ；Kubota T, et al Proc Natl Acad Sci. 1998 ；95 :6930-6935 ；Aukrust P, et al. Am J Cardiol 1999 ；83 :376-382 ；MacGowan GA, et al. Am J Cardiol 1997 ；79 :1128-1132 ；Roig E, et al. Am J Cardiol 1998 ；688-690 ；Tsutamoto T, et al. JAmColl Cardiol 1998 ；31 391-398 ；Prabhu SD,et al. Circulation. 2000 ；101 :2103-2109；Murray DR,et al. . Annu Rev Immunol. 2000 ；18 :451-494)。在多種不同系統中，白介素-1通過白介素-1受體進行信號傳導，是炎性細胞因子信號傳導的早期事件。(Trehu EG.，ClinCancer Res. 1996 ；8 :1341-51) 在心臟損傷中，在受到白介素-1，腫瘤壞死因子-α，或脂多糖刺激以后心肌細胞產生白介素-6， 在缺血心肌的多次灌注期間在缺血后淋巴腺中也發現白介素-6(Gwechenberger Μ, et al. Circulation 1999 ；99 :546-551)。最近發現在心臟疾病中在白介素_1信號傳導以后表達抵抗抗炎性細胞因子。白介素-4和白介素-10可以抑制腫瘤壞死因子-α的合成， 并可增加可溶性腫瘤壞死因子受體的釋放，該受體是腫瘤壞死因子的配體(Joyce DA.， 1994 ；Eur. J. Immunol. 11 =2699-705)。白介素_10在心力衰竭的患者中有所增加(Yamaoka M，et al. Jpn Circ J. 1999 ;63 :951-956)，在患有擴張性心肌炎的患者中當腫瘤壞死因子-α的血清水平增加時白介素-10的血清水平也增加(Ohtsuka T，et al. J Am Coll Cardiol. 2001 ；37 :412-417)。T1/ST2 (ILlRL-I)一種新的機械誘導受體。我們發現了一種新的心臟中的應力激活的信號傳導途徑調控一種白介素-1家族成員基因，T1/ST2的誘導。目前對任何細胞類型中的T1/ST2的誘導，信號傳導和功能還幾乎一無所知，在研究的不同領域中T1/ST2似乎具有兩種不相關的功能。一種是生長調控，另一種是免疫調節。補償性的過度生長和免疫 /炎性調節均與心血管疾病的病理生理學有關。生長。首次發現T1/ST2基因是由于在血清刺激休眠的鼠3T3成纖維細胞之后它的誘導作用，這表明T1/ST2基因參與生長調控CTominaga S.，FEBSLetters 1989 ；258 301-304)。后來發現該基因具有較長的轉錄物，由與全長白介素-1受體同源的跨膜區域和胞質區域組成(Yanagisawa K, et al. FEBS Letters. 1993 ；318 83-87)。免疫。T1/ST2在適應性免疫系統中在T輔助細胞_2上表達，而不在T輔助細胞-1上表達，所述系統可產生白介素-4，白介素-5和白介素-10 (Yanagisawa KI, et al. J Biochem. 1997 ；121 :95-103 ；Coyle AJ, et al. J Exp Med. 1999 ； 190 :895-902)。T 輔助細胞-2介導對感染的有益反應，但是對變態反應和哮喘的發展是有害的。在T輔助細胞-2上 T1/ST2的表達和白介素-4的產生之間具有強相關性(Coyle AJ, et al. J Exp Med. 1999 ； 190 =895-902)。T1/ST2在分化以及T輔助細胞_2而不是T輔助細胞_1的激活中具有重要作用(0' Neill LAJ, et al. Immunology Today. 2000 ；21 :206-209)。T1/ST2信號傳導的抑制減弱了肺中T輔助細胞2_介導的嗜曙紅細胞炎性反應的誘導，抑制T輔助細胞-2分泌細胞因子，而不改變T輔助細胞-1分泌干擾素γ (Coyle AJ, et al. J Exp Med. 1999 ； 190 =895-902)。這些研究表明T1/ST2的表達可以改變細胞因子的組成，以利于白介素_4，白介素-5和白介素-10的表達。進來發現白介素-10在一些心臟損傷中具有抗炎性效果(Ohtsuka T，et al. J Am Coll Cardiol. 2001 ；37 :412-417)。同樣地，T1/ST2不表達會導致偏向干擾素的表達，這對于心肌損傷是有害的。生長反應和免疫功能中均涉及到T1/ST2，這兩者都與細胞因子在針對缺血/多次灌注的炎性反應中的功能的臨床識別有關，說明T1/ST2的激活是一種生長-或是應力-激活的信號傳導途徑，有助于心肌生長和重建。無T1/ST2 小鼠的表型。(Townsend MJ, et al. J Exp Med. 2000 ；191 :1069-1075)。 無T1/ST2小鼠中T 1/ST2的缺乏在沒有免疫問題的時候并不損害其基本的免疫功能。但是，無T1/ST2的小鼠產生IL-4，IL-5，和IL-10的能力受到破壞，但是產生IFN- y (一種Hil 細胞因子)的能力沒有被破壞，同時在肺中在嗜曙紅細胞滲透期間產生T輔助細胞-2炎性反應(一種Th2反應)的能力也受到破壞。我們已經開始研究心肌細胞中T1/ST2的誘導，以及它在肌細胞信號傳導途徑中存活/死亡信號傳導中的作用。下面所述的初步研究表明T1/ST2在心肌細胞中在對白介素-1和機械應變的反應中受到誘導，白介素-1對T1/ST2的誘導依賴于NF- κ B的激活。 Tl/ST2mRNA在成人血管平滑肌細胞中在對白介素-1的反應中也受到誘導。T1/ST2蛋白在體內在小鼠心臟中在心肌缺血早期即表達，在具有不穩定斑點的人患者的大動脈組織中也是這樣。結果體外研究。下述研究表明機械應變和白介素-1對T1/ST2的誘導可能是通過NF-B 的激活實現的。T1/ST2的兩種轉錄產物(也就是ILlRL-IS-可溶的-和ILlRL-IM-膜結合的)在心肌細胞中都能被應變誘導，雖然可溶形式的異構體的轉錄產物更多一些。Tl/ ST2mRNA在培養的新生心肌細胞中可被機械應變誘導(圖8)。Tl/ST2mRNA在培養的新生心肌細胞中可被機械應變誘導。新生的鼠心肌細胞通過膠原蛋白酶消化提取，放置在覆蓋著纖連蛋白的硅酮薄膜容器上，密度為3，500, 000個細胞，13ml 培養液 / 個容器，如文獻所述(Yamamoto K，et al. J Biol Chem. 1999 ；274 21840-21846)。這種方法產生> 95 %的肌細胞培養物。用能提供均一的雙軸周期性應變的裝置實施機械變形，方法如文獻所述(Yamamoto K，et al. J Biol Chem. 1999 ；274 21840-21846)。提取RNA^liagen)，并用鼠T1/ST2特異性的標記的600bp的PCR片段作為探針進行Northern blotting。最大誘導量是在3小時并且持續9小時，經15小時衰減。白介素-1 β和機械應變每個都能在心肌細胞中誘導T1/ST2RNA(圖9)。圖9顯示的是白介素-1和應變對T1/ST2的誘導。我們還發現當存在白介素-1 β的時候機械應變對T1/ST2的誘導沒有進一步增加，說明白介素-1 β不會使肌細胞對機械應變對T1/ST2 的誘導作用(或者反之亦然)更為敏感。該研究中包含了 1小時的時間點，應變的誘導在3 小時達到飽和，因此掩蓋了白介素1的附加作用。右邊的兩條線是佛波酯(PMA)在1小時和3小時的效果。對Tl/ST2mRNA表達的誘導的次序是PMA >應變> 白介素1 β。由于白介素1β是通過NF-κ B進行信號轉導，PMA是通過PKC進行信號轉導，這些結果說明NF-κ B 和PKC活化均參與T1/ST2的誘導。T1/ST2在心肌細胞中可以通過白介素-1/白介素_1受體信號傳導成為NF-κ B 的靶基因(圖10)。根據我們以前所報道的(Yamamoto K，et al. J Biol Chem. 1999 ；274 21840-21846)，心肌細胞的機械應變能夠激活NF-B。為了研究NF-κ B在白介素-1 β和應變對T1/ST2RNA的誘導中的作用，我們過表達了 I κ Ba，它可以降低NF-K B DNA的結合活性。 培養的心肌細胞被過表達I κ Ba的腺病毒載體或具有半乳糖苷酶的對照載體轉染，然后用8%周期性機械應變或白介素-1 (10ng/ml)處理4小時。用標記的ILlRL-lcDNA 探針進行Northern blotting分析RNA。與用β -半乳糖苷酶對照載體處理的細胞中的Tl/ ST2誘導相比，I κ Ba的異常表達阻斷了白介素-1 β對Tl/ST2_lmRNA的誘導，部分阻斷了應變對Tl/ST2mRNA表達的誘導。這些結果表明T1/ST2通過白介素-1/白介素_1受體信號傳導成為早期的NF- κ B靶基因。相反的，除了 NF-kB活化以外的途徑也可能與機械應變對T 1/ST2RNA的誘導有關。Tl/ST2mRNA在成人血管平滑肌細胞中也可以被白介素_1誘導，但是不被PMA或腫瘤壞死因子(TNF)誘導。除了上述結果以外，我們還發現T1/ST2是在NF-K B被白介素_1激活之后被誘導，NF-kB與心肌細胞的存活有關。進一步的體外實驗證實T1/ST2激活與細胞生長和存活有關。體內研究。材料與方法小鼠的實驗性心肌梗塞。小鼠的實驗程序得到了哈佛醫學院常設動物委員會的支持。如前所述，通過對小鼠進行冠狀動脈結扎產生實驗型心肌梗塞(1 。收集進行冠狀動脈結扎后1天和2天的心臟，將心臟用Z-Fix(Anatech LTD)灌流固定。然后將心臟在4°C 固定浸在Z-Fix中過夜。在分級乙醇溶液中脫水后，將心臟放置在Histo-Clear (National Diagnostics)中并用石蠟包埋。將5 μ m的組織段去石蠟，再水化，用3 %過氧化氫培育， 用水漂洗然后再用磷酸鹽緩沖液漂洗。將組織段封閉，在1 50抗小鼠ST2初級抗體 (Morwell Diagnostics)禾口 1 100 抗-大鼠 HRP 結合刺激抗體(Vector Laboratories) 中培育。玻片用蘇木精和伊紅進行對比染色。ST2的患者研究和ELISAHEART研究。康復和早期后負荷減少療法(HEART)研究是一種隨機的，雙盲的，用安慰劑做對照的實驗，共對來自美國和加拿大的36個中心的352名具有急性心肌梗塞(MI)的患者進行了實驗。在21歲以上并且在M小時內經歷過MI的男性和女性都是合乎實驗條件的。實驗包含和不包含的標準以及細節如文獻所述(Pfeffer Μ. A. , et al. , Circulation,1997,95 :2643-2651 ；Greaves S. C. , et al. , Am. J. Cardiol,1997,80 442-448 ；Solomon S. D. , et al. , Ann. Intern. Med. ,2001,134 :451-458 ；Aikawa Y. , et al.，Am. Heart J, 2001,141 =234-242)。在HEART實驗中需要從69名隨機選取的患者中依次采集發生心肌梗塞后1，14和90天的血液樣品。用如文獻所述的雙層單克隆抗體夾心 ELISA (Kuroiwa K.，et al.，Hybridoma，2000，19 151-159)檢測可溶性 T1/ST2。這種檢測是商業可獲得的(MBL International, Watertown，MA)。PRAISE研究。預期隨機Amlodipine存活實驗(PRAISE)研究是在具有冠狀動脈疾病造成的心力衰竭的患者中進行的一種預期性的對Amlodipine的大規模研究。實驗的結果是Amlodipine對于嚴重的心力衰竭沒有有益效果。在治療之前研究開始的時候采集血液樣品，然后在研究過程中采集兩次或更多。用上述方法檢測可溶性T1/ST2。目前對于心力衰竭的血液檢測的關鍵因素之一是腦利尿鈉肽(BNP)。我們檢查心力衰竭的患者中Tl/ ST2水平是否發生改變，并且檢查在這些患者中T1ST2水平是否與BNP水平相關。統計學分析。每個體外實驗最少進行三次。其值為平均值士SEM。用單因素ANOVA 或重復測量的AN0VA，以及合適的post hoc Bonferroni多重比較分析方法分析數據。由于非正常的數據分布，對血清值的對數轉換值進行線性回歸分析。P值< 0. 05被認為是具有統計學意義。結果小鼠心肌梗塞期間的T1/ST2體內表達。為了評價損傷心肌中的T1/ST2表達，通過進行冠狀動脈結扎使小鼠發生實驗性心肌梗塞。圖11顯示了用心肌梗塞后1和3天小鼠心臟的免疫組織化學分析得到的T1/ST2的蛋白表達。觀察心肌梗塞后(MI后)1天在左心室的所有區域，正常區域，梗塞區域和邊緣區域的正染色結果，但是不觀察心肌梗塞后3天的染色結果。在1天和3天的假手術對照中沒有觀察到T1/ST2著色。這些結果表明T1/ST2 蛋白在梗塞后的重建過程的早期階段中，在第3天所觀察到的巨噬細胞轉移到梗塞和邊緣區域之前，在對急性損傷的反應的時候表達。用于這些研究的單克隆抗體不區分T1/ST2的可溶形式和膜結合形式。在心肌梗塞后一天，在患者的系統循環中發現可溶性T1/ST2增加。由于可溶性 T1/ST2在心肌細胞中被高度誘導，T1/ST2蛋白在發生實驗性心肌梗塞之后在小鼠心肌中高度表達，我們猜測在心肌梗塞之后在患者的系統循環中可溶性T1/ST2有所增加。方法和結果用雙層單克隆抗體夾心ELISA檢測，我們對HEART研究中的69個參與者在心肌梗塞當天(1天)，梗塞后14天和90天檢測了其血樣。如圖1 所示，與14 天(平均值士SEM，0. 98士0. 06ng/ml ；范圍，0. 25 到 3. 42ng/ml)和 90 天(平均值士SEM， 0. 79 士0. 07ng/ml ；范圍，0. 02 到 3. 53ng/ml ； 14 天與 90 天相比，P = NS)相比，系統 T1/ST2 蛋白在心肌梗塞后一天(平均值士SEM，3. 8士0. 4ng/ml，p < 0. 001 ；范圍，0. 32到17. 42ng/ ml)顯著增加。90天的平均值與公開的健康對照的平均值相似(Kuroiwa K. , et al., Hybridoma, 2000,19 =151-159)。系統T 1/ST2蛋白水平與肌酸激酶水平的峰值正相關(r =0.41，ρ < 0.001)，如圖1 所示。高的系統ST2蛋白水平還與心肌梗塞后一天時的低射血分數有關，如圖12c中四分位值分析所示(p = 0. 03)。結論這些結果表明在心肌梗塞的臨床表現中，心肌損傷程度與可溶性T1/ST2的合成和其向系統循環中的分泌之間存在律動調節。可溶性T1/ST2在患有嚴重慢性心力衰竭的患者的系統循環中有所增加。此研究檢驗了關于在患有嚴重慢性心力衰竭的患者血清中可溶性T1/ST2與在心力衰竭中有所增加的BNP，ProANP和降腎上腺素，神經激素有關的猜想。方法和結果使用預期隨機Amlodipine存活評估2研究(PRAISE-2)心力衰竭試驗的神經激素亞組研究(紐約心臟協會功能分類III或IV，終點死亡率或移植)中的血清樣品，臨床變量和神經激素水平。PRAISE-2研究是一種多中心的，隨機的，雙盲的，平行組的，用安慰劑做對照的研究，可以評價amlodipinelOmg/天對于具有非缺血性原因的充血性心力衰竭患者存活的效果。該試驗由來自美國和加拿大的240個場所的患者組成。神經激素亞組研究由來自參與主要研究的沈個中心的181名患者組成。主要的PRAISE-2和神經激素亞組研究得到了參與機構的機構審查委員會的支持。如果患者年齡至少為18歲， 具有非缺血性原因的心力衰竭，并且癥狀是發生在休息的時候或最平緩的運動時(紐約心臟協會功能分類III或IV)，并且左心室射血分數低于30%，那么該患者合乎條件。所有的患者都使用ACE抑制劑和地高辛治療至少3個月。具有近期或遠期絞痛史的患者被排除在外。T1/ST2，神經激素的檢測，氧化性脅迫的測量。測量基準血樣和2周時的血樣 (表1)。用雙層單克隆抗體夾心ELISA方法檢測可溶性T1/ST2 (Medical & Biological Laboratories Co.，Ltd.，Nagoya，Japan)，根據制造商的手冊進行操作。簡單地說，血樣或標準樣品在涂覆有抗人T1/ST2抗體的微孔中培育。進行洗脫后，向微孔中加入結合過氧化物酶的抗人T1/ST2抗體并培育。再次洗脫后，加入過氧化物酶底物，測量450nm處的光密度。循環的兒茶酚胺(降腎上腺素，腎上腺素，多巴胺)，血管緊張素II，利尿鈉肽(前-心房利尿鈉肽(Pro-ANP)，腦利尿鈉肽(BNP))和氧化性脅迫的指標(丙醛，腎上腺黃素)的測量如文獻所述(Dhalla KS, et al.，Mol Cell Biochem, 1989 ；87 :85-92 ；Moe Gff, et al.， Am Heart J，2000 ;139 :587-卯)。對在實驗登記時獲取的162名患者的樣品以及在實驗登記后2周獲取的相同患者中的135名患者的樣品進行T1/ST2血清檢測。基準T1/ST2水平與基準 BNP 水平(r = 0. 3511，ρ < 0. 0001)，基準 ftx)ANP 水平(r = 0. 3598，ρ < 0. 0001) 和基準降腎上腺素水平(r = 0. 3854,ρ < 0. 0001)相關(表2)。T1/ST2的變化(2周時的 T1/ST2水平減去實驗登記時的T1/ST2水平)是重要的死亡率或移植的單變量預測因素(ρ =0. 048)，基準 BNP (ρ < 0. 0001)和基準 ProANP (ρ < 0. 0001)也是一樣(表 3)。在包括 BNP和ftx)ANP的多變量模型中，T1/ST2的變化獨立于BNP和ProANP，也是死亡率或移植的重要的獨立預測因素(表4)。表1基準特征
權利要求
1.一種診斷由核酸分子的異常表達或其表達產物的異常表征的心血管疾病的方法，所述方法包括a)使來自患者的生物樣品與一種試劑接觸，其中所述試劑特異性地與所述核酸分子， 其表達產物，或其表達產物的片段結合；并且b)測定所結合試劑的量并由此確定所述核酸分子或其表達產物的表達是否異常，異常的表達即診斷所述疾病；其中所述核酸分子是至少一種選自SEQ ID NO :1和SEQID N0:3的核酸分子。
2.權利要求1的方法，其中所述疾病是選自下組的心血管疾病心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
3.權利要求1的方法，其中所述疾病是心臟肥大。
4.權利要求1的方法，其中所述試劑是可以在高度嚴謹條件下與SEQID NO 1或SEQ ID NO :3雜交的核酸分子。
5.權利要求1的方法，其中所述試劑是可以與SEQID NO :1或SEQ ID NO 3的核酸分子的表達產物結合的分子。
6.權利要求5的方法，其中所述試劑是抗體或其抗原結合片段。
7.一種確定患者的心血管疾病的階段的方法，其中所述心血管疾病由核酸分子的異常表達或其表達產物的異常表征，包括監控得自患者的樣品的選自下組的參數(i) ILlRL-I核酸分子，( )由ILlRL-I核酸編碼的多肽，(iii)由所述多肽衍生的肽，(iv)可以選擇性地與所述多肽或肽結合的抗體，確定所述患者的所述心血管疾病的階段。
8.權利要求7的方法，其中所述樣品是生物流體或組織。
9.權利要求7的方法，其中監控的步驟包括使所述樣品與選自下組的可檢測到的試劑接觸(a)能在嚴謹條件下與(i)的核酸分子選擇性雜交的分離的核酸分子，(b)能選擇性地與(ii)的多肽，或與(iii)的肽結合的抗體，(c)能選擇性地與(iv)的抗體結合的多肽或肽。
10.權利要求9的方法，其中所述抗體，所述多肽，所述肽或所述核酸用可檢測到的標記進行標記O
11.權利要求9的方法，包括監控樣品中的肽。
12.—種試劑盒，包括容器，其中含有可選擇性地與分離的ILlRL-I核酸分子，或其表達產物結合的試劑，以及用于與所述試劑與所述分離的核酸或其表達產物的結合的檢測值比較的對照。
13.權利要求12的試劑盒，其中所述對照具有與檢測值相比較的預定值。
14.權利要求12的試劑盒，其中所述對照含有分離的ILlRL-I核酸分子的表達產物的表位。
15.權利要求12的試劑盒，其中所述試劑含有至少一個用于擴增分離的ILlRL-I核酸分子的引物對，其中所述分離的ILlRL-I核酸分子具有如SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3所示的序列。
16.權利要求12的試劑盒，其中所述試劑含有至少一個能結合所述分離的ILlRL-I核酸分子的表達產物的抗體，其中所述分離的ILlRL-I核酸分子具有如SEQ ID NO 1或SEQ IDNO 3所示的序列。
17.一種治療心血管疾病的方法，包括給需要這種治療的患者施用有效量的可治療心血管疾病的能調節ILlRL-I分子表達的試劑。
18.權利要求17的方法，進一步包括同時給予選自下組的試劑抗炎性制劑，抗血栓形成制劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑，能結合細胞粘附分子并能抑制白細胞粘附到這些分子上的能力的試劑，鈣通道阻斷劑，β -腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2抑制劑，和血管緊張素系統抑制劑。
19.權利要求17的方法，其中所述心血管疾病選自下組心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
20.權利要求17的方法，其中所述調節表達的試劑是一種ILlRL-I分子。
21.一種治療患者以減少患者發生心血管疾病的危險性的方法，包括給表達升高水平的ILlRL-I分子的患者施用有效量的能降低患者將來發生心血管疾病的試劑以減少心血管疾病的危險性。其中所述試劑是抗炎性制劑，抗血栓形成制劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑，能結合細胞粘附分子并能抑制白細胞粘附到這些分子上的能力的試劑，鈣通道阻斷劑，β -腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2 抑制劑，或血管緊張素系統抑制劑，或者一種能調節ILlRL-I分子表達的試劑。
22.—種識別可用于治療心血管疾病的候選試劑的方法，包括在不存在候選試劑的條件下測定心臟細胞或組織中ILlRL-I分子的表達，其中所述心臟細胞或組織中ILlRL-I分子為第一種表達量，使所述心臟細胞或組織與候選試劑接觸，測定所述ILlRL-I分子表達的檢測量，其中在存在候選試劑的條件下表達的檢測量與第一種表達量相比降低或升高，表明該候選試劑可用于治療心血管疾病。
23.權利要求22的方法，其中所述心血管疾病選自下組心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
24.一種藥物組合物，包括試劑，含有一種藥學有效量的分離的ILlRL-I核酸分子，或其表達產物，以治療心血管疾病，以及藥學可接受的載體。
25.權利要求對的藥物組合物，其中所述試劑是分離的ILlRL-I核酸分子的表達產物。
26.權利要求M的藥物組合物，其中所述心血管疾病選自下組心臟肥大，心肌梗塞， 中風，動脈硬化，和心力衰竭。
27.一種評價患者在用能減少心血管疾病危險性的試劑進行的治療中獲益的可能性的方法，所述試劑選自抗炎制劑，抗血栓形成制劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑，能與細胞粘附分子結合并能抑制白細胞與這些分子接觸的能力的制劑，鈣通道阻斷劑，β -腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2抑制劑，和血管緊張素系統抑制劑，包括獲得患者的ILlRL-I分子水平，并且將所述ILlRL-I分子水平與心血管疾病診斷特異性的預定值相比較，其中所述 ILlRL-I分子水平與預定值的比較可以表明患者是否通過用所述試劑進行的治療而獲益。
28.權利要求27的方法，其中所示心血管疾病診斷特異性的預定值是多個預定標記物水平范圍，所述的比較步驟包括確定所述患者的水平落在哪個預定標記物水平范圍中。
29.權利要求27的方法，其中所述心血管疾病是選自下組心臟肥大，心肌梗塞，中風， 動脈硬化，和心力衰竭。
30.一種治療患者以減少心血管疾病危險的方法，包括選擇和給表達異常水平的 ILlRL-I分子的患者施用有效量的能降低患者發生心血管疾病危險性的試劑以減少心血管疾病的危險性，所述試劑選自抗炎制劑，抗血栓形成制劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑， 降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑，能與細胞粘附分子結合并能抑制白細胞與這些分子接觸的能力的制劑，鈣通道阻斷劑，腎上腺素受體阻斷劑，環氧合酶-2抑制劑，和血管緊張素系統抑制劑。
31.權利要求30的方法，其中所述患者不具有其它需要用所述試劑進行治療的癥狀。
32.—種預測心血管疾病結果的方法，包括獲得患者ILlRL-I分子的水平，將所述ILlRL-I分子水平與心血管疾病的預測結果特異性的預定值相比較，其中所述 ILlRL-I分子水平與預定值的比較可以表明心血管疾病的結果。
33.權利要求32的方法，其中所述心血管疾病選自下組心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
全文摘要
本發明涉及診斷和治療心血管疾病的方法和組合物。更特別地，本發明涉及可以用于診斷和/或治療心血管疾病的分離的分子，所述心血管疾病包括心臟肥大，心肌梗塞，中風，動脈硬化，和心力衰竭。
文檔編號G01N33/15GK102533972SQ20111038788
公開日2012年7月4日 申請日期2003年5月9日 優先權日2002年5月9日
發明者理查德·T·李 申請人:布賴漢姆婦女醫院