專利名稱：一種檢測動物肌肉組織中替米考星的前處理試劑盒及方法
技術領域：
本發明屬于食品安全分析技術領域，更具體涉及一種檢測動物肌肉組織中替米考星(tilmicisin，TLM)的前處理試劑盒，同時還涉及一種動物肌肉組織中替米考星殘留量檢測的方法，本試劑盒及檢測方法適用于鮮活動物(魚、蝦、豬、雞)肌肉組織中替米考星殘留量檢測的樣品前處理及檢測。
背景技術：
替米考星(Tilmicosin)是80年代由英國Elanco動物保健品公司研發成功的，主要用于牛、奶牛、山羊、綿羊、豬、雞、魚等動物由敏感菌引起的感染性疾病。替米考星是一種半合成的大環內酯類抗生素，是泰樂菌素(Tylosin)的衍生物，具有同泰樂菌素相似的抗菌譜，對革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌、霉形體、螺旋體等均有抑制作用。其主要通過抑制細菌的蛋白合成起到殺菌的作用。在畜禽上的研究表明，其對胸膜肺炎放線桿菌、溶血性巴氏桿菌、多殺性巴氏桿菌及畜禽霉形體具有比泰樂菌素更強的活性。隨著人們對大環內酯類藥物研究的深入，替米考星等大環內酯類藥物對人類的危害也逐漸被人們所認識， 如大環內酯可產生交叉耐藥性，高殘留會對人類造成至敏性和毒性反應，尤其是敏感個體等。歐盟和我國均對動物性食品中替米考星殘留量有嚴格的限止。為了保障我國人民的健康和避免由于動物性食品中替米考星殘留而引起的貿易壁壘，加強對動物性食品中替米考星殘留的檢測是非常必要的。目前，檢測動物肌肉組織中替米考星的前處理方法，提取過程復雜，消耗有機溶劑量大，凈化過程多采用固相萃取小柱(SPE柱)，不僅增加了工作量，而且增加了檢測的成本。在對前處理好的樣品進行替米考星檢測所用的流動相(液相)組分復雜，且配制過程繁瑣、耗時，所用添加劑對色譜柱有較大的損害。動物肌肉組織中替米考星用傳統的前處理及檢測方法費時、費錢且操作過程復雜不易掌握。為提高對動物肌肉組織中替米考星殘留檢測的效率，節約檢測成本，研制動物肌肉組織中TLM檢測的前處理試劑盒及檢測方法具有非常重要的經濟和社會意義。目前，國內外均未見有動物肌肉組織中替米考星檢測前處理試劑盒的報道。
發明內容
本發明目的是在于提供了一種檢測鮮活動物肌肉組織中替米考星(tilmicisin， TLM)的樣品前處理試劑盒，樣品前處理所用試劑價格便宜，容易獲得，且用量小，樣品處理無需用固相萃取小柱進行樣品凈化，從而大大節約了檢測成本；該試劑盒操作方便快捷，適于大量鮮活動物肌肉樣品的處理，從而大大提高了樣品前處理的效率；該試劑盒將所需試劑整合于一個前處理試劑盒內便于攜帶和儲存。本發明的另一個目的是在于提供了一種經本前處理試劑盒處理后的樣品中替米考星殘留量的檢測方法，該檢測方法流動相配制簡單，用量少，且所用試劑對色譜柱無損害；該檢測方法所用時間短，且在較短的時間內能將替米考星的2種同分異構體(順式異構體和反式異構體)分離，從而大大節約了檢測時間和檢測成本。從使用該前處理試劑盒和檢測方法的效果來看，樣品處理干凈，在色譜圖上無雜質峰干擾且能將替米考星的2種同分異構體較好分離。該方法是一種能夠快速、準確、靈敏地檢測利用本前處理試劑盒處理的樣品的超高效液相色譜法(UPLC)。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施一種動物肌肉組織中替米考星檢測的前處理試劑盒，本發明前處理試劑盒主要由盒體、試劑管A、試劑袋B、試劑管C、試劑瓶D、試劑瓶E、試劑袋F。盒體內分為a、b、c、d 4 個區，a和b區為適合試劑管A和試劑管C放置的孔區，c區放試劑袋B和試劑袋F的凹槽， d區放試劑瓶D和試劑瓶E的凹槽。優選的，所述的試劑管A中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試齊LU優選的，所述的試劑袋B中是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、 磷酸二氫銨、硫酸鈉或硫酸鎂中任一種試劑。優選的，所述試劑管C中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑。優選的，所述試劑瓶D中是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑的溶液。優選的，所述試劑瓶E中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑。優選的，所述試劑試劑袋F中是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑。試劑D的溶液的配制方法取試劑D 2_20g，溶于200mL的蒸餾水中溶解配制成濃度為-10%的試劑D的溶液。試劑F的溶液的配制方法為取試劑F 0.6_3g，溶于500mL蒸餾水中，配制成濃度為10mM-50mM的試劑F的溶液。優選的液體試劑E和試劑F的溶液的體積比E F=I 9-1 1。一種動物肌肉組織中替米考星檢測前處理試劑盒的使用方法，其步驟是A、取動物肌肉組織2. Og于50mL塑料離心管中，加入試劑A 5_10mL，振蕩30s ；所述試劑A可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑。B、再加入試劑試劑B 2-10g，振蕩30s，5000r/min離心5min，將上清液轉移至雞心瓶中，45°C旋轉蒸發至干；所述試劑B可以是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、硫酸鈉或硫酸鎂中任一種試劑。C、向雞心瓶中加入試劑C 2-10mL，將其轉移至15mL離心管中；所述試劑C可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑。D、再向其中加入試劑溶液D l_5mL，振蕩30s，5000r/min離心5min，將上層液體取出置于15mL離心管中，置45°C氮吹儀吹至干；所述試劑溶液D可以是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑的溶液。E、剩余物用ImL液體試劑E和試劑F的溶液的混合溶液溶解，再加入^iiL正己烷， 漩渦振蕩30s，5000r/min離心5min，去除上層液正己烷層，下層液體經0. 22 μ m濾頭過濾，UPLC測定。所述的試劑E可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑； 所述的試劑F可以是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑。結果表明經本試劑盒處理后的樣品經本檢測方法檢測，色譜基線平穩，在目標物附近無雜質峰干擾，并能將替米考星的2種同分異構體分開。發明提供了一種動物肌肉組織中替米考星前處理方法，該方法包括可以提取動物肌肉組織中替米考星的液體試劑A，用于動物肌肉組織樣品凈化的試劑B，用于溶解濃縮樣品殘渣的液體試劑C，用于凈化溶解殘渣樣品的試劑溶液D，用于溶解經凈化處理的樣品濃縮物的液體試劑E和試劑F的溶液的混合物。一種用于檢測經本前處理試劑盒處理的動物肌肉組織樣品的方法，本檢測方法包括流動相組成液體試劑E和試劑F的溶液；色譜條件及梯度洗脫程序。優選的液體試劑E是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑。優選的，所述試劑F是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑。試劑F的溶液的配制方法為試劑F 0.6_3g，溶于 500mL蒸餾水中，配制成濃度為10mM-50mM的試劑F的溶液。優選的液體試劑E和試劑F的溶液的體積比E F = 1 9-1 1。優化的色譜條件及梯度洗脫程序是色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18 (2. 1 X 100mm, 1. 7 μ m)反相色譜柱；柱溫:30-40 °C ；流速 0. 1-0. 4mL/min ；進樣量 2. 0-7. OyL0梯度洗脫條件:A相為液體試劑E，B相為試劑F的溶液，0 1. 5min, 10% E ； 1. 5 6min，10 % E 30 % E，6_8min 30%E 10%E，8 12min，10 % E，檢測波長 287nm。本發明還提供了一種測定動物性食品肌肉組織的超高效液相色譜法，該方法包括流動相組成E和F ；梯度洗脫程序等。優選的，所述的液體試劑E是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試齊LU優選的，所述的試劑F的溶液是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑的溶液。試劑F的溶液的配制方法為取一定量的試劑F，溶于適量的蒸餾水中，配制成濃度為10mM-50mM的試劑F的溶液，液體試劑 E和試劑F的溶液；兩者的體積比E F=I 9-1 1。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果(1)操作過程簡單、快速、所用試劑量少。(2)無需用固相萃取小柱進行樣品凈化，節約檢測成本，節約樣品前處理時間。(3)優選的試劑處理鮮活動物肌肉組織效果好，價格低廉。(4)流動相配制簡單，所用試劑對色譜柱無損害。(5)檢測方法消耗試劑少，分析時間短，目標物附件無干擾峰，且能將替米考星2 種同分異構體分離開。
圖1前處理試劑盒的直觀示意圖其中盒體1、A試劑管A2、B試劑袋B3、C試劑管C4、D試劑瓶D5、試劑瓶Eedl1^lJ 袋F7。試劑盒可常溫(15-35°C )儲存，有效期6個月。
圖2為一種經本試劑盒處理后的樣品，經本檢測方法檢測后得出的動物肌肉組織樣品中中替米考星的色譜圖。 經本試劑盒處理后的樣品，經本檢測方法檢測后得出的動物肌肉組織樣品中中替米考星的色譜圖，基線平穩，目標物附近無干擾峰，2種替米考星同分異構體能較好分離。
具體實施例方式實施例1 下面結合附圖對本發明做進一步說明。一種動物肌肉組織中替米考星檢測的前處理試劑盒，本發明前處理試劑盒主要由盒體1、試劑管A2、試劑袋B3、試劑管C4、試劑瓶D5、試劑瓶E6、試劑袋F7。盒體內分為a、 b、c、d 4個區，a和b區為適合試劑管A2和試劑管C4放置的孔區，c區放試劑袋B3和試劑袋F7的凹槽，d區放試劑瓶D5和試劑瓶E6的凹槽。優選的，所述的試劑管A2中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑。所述試劑A可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑，加入試劑A的量為5-10mL。優選的，所述的試劑袋B3中是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、 磷酸二氫銨、硫酸鈉或硫酸鎂中任一種試劑。所述試劑B可以是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、 磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、硫酸鈉或硫酸鎂中任一種試劑，加入試劑B的量為 2-10g。優選的，所述試劑管C4中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑。所述試劑C可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑，加入試劑 C2-10mL。優選的，所述試劑瓶D5中是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑的溶液。試劑D的溶液的配制方法取試劑D 2_20g，溶于200mL的蒸餾水中溶解配制成濃度為-10%的試劑D的溶液。優選的，所述試劑瓶E6中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試齊LU優選的，所述試劑袋F7中是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、 磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑。試劑F的溶液的配制方法為取試劑F 0. 6-3g，溶于500mL蒸餾水中，配制成濃度為10mM-50mM的試劑F的溶液，液體試劑E和試劑F的溶液兩者的體積比E F=I 9-1 1。實施例2:一種動物肌肉組織中替米考星檢測的前處理試劑盒的樣品處理方法，其步驟是A、取動物肌肉組織2. Og于50mL塑料離心管中，加入試劑A 5_10mL，振蕩30s ；所述試劑A可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑。B、再加入試劑B 2-10g，振蕩30s，5000r/min離心5min，將上清液轉移至雞心瓶中，45°C旋轉蒸發至干；所述試劑B可以是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、硫酸鈉或硫酸鎂中任一種試劑。C、向雞心瓶中加入試劑C 2-10mL，將其轉移至15mL離心管中；所述試劑C可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑。D、再向其中加入試劑D溶液l-5mL，振蕩30s，5000r/min離心5min，將上層液體取出置于15mL離心管中，置45°C氮吹儀吹至干；所述試劑D溶液可以是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑的溶液。E、剩余物用ImL液體試劑E和試劑F的溶液的混合溶液溶解，再2mL正己烷，漩渦振蕩30s，5000r/min離心5min，去除上層液正己烷層，下層液體經0. 22 μ m濾頭過濾，UPLC 測定。所述試劑E可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑；所述試劑F的溶液可以是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑的溶液。結果表明，經本試劑盒處理后的樣品經本檢測方法檢測， 色譜基線平穩，在目標物附近無雜質峰干擾，并能將替米考星的2種同分異構體分開。一種用于檢測經本前處理試劑盒處理的動物肌肉組織樣品的方法，本檢測方法包括流動相組成E和F ；色譜條件及梯度洗脫程序。優選的試劑E是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑。優選的，所述試劑試劑F是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑溶液，試劑F的溶液的配制方法為取試劑F 0. 6-3g，溶于500mL蒸餾水中，配制成濃度為10mM-50mM的試劑F的溶液。優化的色譜條件及梯度洗脫程序是色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18 (2. 1 X 100mm, 1. 7 μ m)反相色譜柱；柱溫:30-40 °C ；流速 0. 1-0. 4mL/min ；進樣量 2. 0-7. 0 μ L0 梯度洗脫條件Α 相為 Ε，Β 相為 F，0 1. 5min,10% E ；1. 5 6min，10% E 30% E，6-8min 30% E 10% E，8 12min，10% E，檢測波長 287nm。
權利要求
1.一種動物肌肉組織中替米考星檢測的前處理試劑盒，試劑盒由盒體、試劑管A、試劑袋B、試劑管C、試劑瓶D、試劑瓶E、試劑袋F組成，其特征在于盒體內分為a、b、c、d 4個區，a和b區為試劑管A和試劑管C放置的孔區，c區放試劑袋B和試劑袋F的凹槽，d區放試劑瓶D和試劑瓶E的凹槽；所述的試劑管A中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑；所述的試劑袋B中是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、 硫酸鈉或硫酸鎂中任一種試劑；所述的試劑管C中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑；所述的試劑瓶D中是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、 硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑的溶液；所述的試劑瓶E中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑；所述的試劑試劑袋F中是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑。
2.根據權利要求1所述一種動物肌肉組織中替米考星檢測的前處理試劑盒，其特征在于所述的試劑瓶D中的試劑溶液D的配制方法取試劑D 2-20 g，溶于200 mL的蒸餾水中溶解配制成濃度為1%_10%的試劑D的溶液。
3.根據權利要求1所述一種動物肌肉組織中替米考星檢測的前處理試劑盒，其特征在于所述的試劑F的溶液的配制方法為取試劑F 0.6-3 g，溶于500 mL的蒸餾水中， 配制成濃度為10 mM-50mM的試劑F的溶液，液體試劑E和試劑F的溶液，兩者的體積比 E:F=1:9-1:1。
4.權利要求1所述的一種動物肌肉組織中替米考星檢測前處理試劑盒的方法，其步驟是A、取動物肌肉組織2.0g于50 mL塑料離心管中，加入試劑A 5-10 mL，振蕩30 s ；所述試劑A是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑；B、再加入試劑B2-10 g，振蕩30 s，5000 r/min離心5 min，將上清液轉移至雞心瓶中， 45 °C旋轉蒸發至干；所述試劑B是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、硫酸鈉或硫酸鎂中任一種試劑；C、向雞心瓶中加入試劑C2-10 mL，將其轉移至15 mL離心管中；所述試劑C是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑；D、再向其中加入試劑D的溶液1-5mL，振蕩30 s，5000 r/min離心5 min，將上層液體取出置于15 mL離心管中，置45 °C氮吹儀吹至干；所述試劑D的溶液是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑的溶液；E、剩余物用1mL液體試劑E和試劑F的溶液的混合溶液溶解，再加入2 mL正己烷， 漩渦振蕩30 8,5000 r/min離心5 min，去除上層液正己烷層，下層液體經0. 22 Mm濾頭過濾，UPLC (超高效液相色譜)測定；所述的試劑E是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一種液體試劑；所述的試劑F是氯化鈉、碳酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、硫酸鈉鉀或硫酸鎂中任一種試劑。
全文摘要
本發明公開了一種檢測動物肌肉組織中替米考星的前處理試劑盒及方法，試劑盒由盒體、試劑管A、試劑袋B、試劑管C、試劑瓶D、試劑瓶E、試劑袋F組成，盒體內分為a、b、c、d，a和b區為試劑管A和試劑管C放置的孔區，c區放試劑袋B和試劑袋F的凹槽，d區放試劑瓶D和試劑瓶E的凹槽；其步驟A、取動物肌肉組織于離心管中，加入試劑，振蕩；B、加入試劑，旋轉蒸發至干；C、向雞心瓶中加入試劑，將其轉移至離心管中；D、再加入試劑溶液，振蕩，置氮吹儀吹至干。E、剩余物用液體試劑混合溶液溶解，再加入正己烷，漩渦振蕩，去除上層液體，下層液體經濾頭過濾，UPLC測定。操作簡單、快速，價格低廉，所用試劑對色譜柱無損害。
文檔編號G01N30/14GK102393430SQ20111038483
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月28日 優先權日2011年11月28日
發明者何力, 劉永濤, 喻亞麗, 楊紅, 艾曉輝, 鄒世平 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所