專利名稱：一種鯽魚中殘留結晶紫的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種鯽魚中殘留結晶紫的測定方法，特別涉及一種采用毛細管電泳-紫外可見檢測(CE—UV-VIS)法測定鯽魚中殘留結晶紫的方法。
背景技術：
結晶紫，又名龍膽紫，俗稱紫藥水，分子式C25H30C1N3，其結構和其代謝產物隱色結晶紫的結構如附圖1所示，屬三芳基甲烷化學物質，由于它既可以殺死某些表淺真菌，又可以殺死細菌，因此在飼料生產上常作為一種抗真菌添加劑，用來改善畜禽健康狀況，提高存活率。許多國家在較長一段時間里曾將其作為水產養殖業的常用殺菌劑，用于魚類高發的水霉病、原蟲病的控制，具有較好的效果。但是有些研究證實，當結晶紫進入人類或動物機體后，通過生物轉化后具有致癌、致畸、致突變等副作用。上世紀90年代以來許多國家都將其列為水產養殖的禁用藥物。特別是近期水產品的國際商貿中，結晶紫屬類藥物成為必檢并限制極嚴的一項指標，在我國水產品出入境檢驗檢疫中結晶紫也屬于必檢項目，但我國許多地方在水產品養殖、保鮮和運輸過程中仍在使用，在不同程度上存在禁而不止的現象，從而導致結晶紫可能廣泛存在于人們經常食用的水產品當中，所以建立對水產品中結晶紫的快速準確的測定方法刻不容緩。目前，國內外水產品中結晶紫殘留的檢測方法有HLPC、RRLC、LC-MS, LC-MS/MS、液相色譜-線性離子阱質譜法、UPLC-MS/MS、磷鉬酸共振瑞利散射法等，這些方法大多采用色譜級的乙腈作為流動相，由于其劇毒，對人體和環境危害較大，且成本較高。
發明內容
本發明的目的在于為了解決上述的技術問題而提供了一種低毒低污染、成本低廉、操作簡單、靈敏度和檢測限均能達到所需要求的毛細管電泳-紫外可見檢測(CE— UV-VIS)法測定鯽魚中結晶紫殘留的方法。本發明的技術方案
一種鯽魚中殘留結晶紫的測定的方法，即利用毛細管電泳-紫外可見檢測(CE— UV-VIS)法進行測定，毛細管電泳的流動相為pH4. 0、濃度為lOOmmol/L磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液、紫外檢測波長267nm，分離電壓為12kV，其具體包括下列步驟
(1)、試劑的配制
0. 03mol/L硼氫化鉀溶液，現配現用，用水溶解0. 405g硼氫化鉀并定溶至250ml ； 0. 2mol/L硼氫化鉀溶液，現配現用用水溶解1. 08g硼氫化鉀并定溶至IOOml ； 20%鹽酸羥胺溶液用水溶解25g鹽酸羥胺并定溶至IOOml ； 0. 05mol/L對甲苯磺酸溶液0. 95g對甲苯磺酸用水溶解并稀釋至IOOml ；
(2)、標準曲線的繪制
將結晶紫溶于甲醇，配制成 οομ g/ml的結晶紫標準甲醇溶液； 再上述制備好的濃度為100μ g/ml的結晶紫標準甲醇溶液，逐滴加入步驟(1)配制的 0. 03mol/L硼氫化鉀溶液直到溶液變為無色，然后用甲醇稀釋成濃度為1 μ g/ml的隱色結晶紫標準工作液；按上述方法再準確配制濃度分別為2、4、8、16、32μ g/ml的隱色結晶紫標準工作液； 進TriSepTM-2100加壓毛細管電色譜儀用CE模式測定，以結晶紫標準工作液的濃度對峰面積作標準曲線；(3)、待測鯽魚樣品的預處理稱取5. OOg待測鯽魚背脊肉組織于50ml離心管內，加入IOml乙腈，lOOOOr/min勻漿提取30s，加入5g酸性氧化鋁，震蕩2min，4000r/min離心lOmin，上清液A轉移至125ml分液漏斗中，在分液漏斗中加入2ml 二甘醇，3 mLO. 2 mol/L硼氫化鉀溶液，振搖^iiin ；取IOml乙腈，移入離心管的沉淀E中，再加入:3ml 0. 2mol/L硼氫化鉀溶液，用玻璃棒搗散離心管中的沉淀E并攪勻，旋渦混勻器上振蕩1 min，靜置20min，4000r/min離心 lOmin，得沉淀F，上清液B并入上述的含有上清液A的125ml分液漏斗中；在50ml離心管的沉淀F中繼續加入1. 5ml濃度為20%的鹽酸羥胺溶液、2. 5ml濃度為 0. 05mol/L的對甲苯磺酸溶液，震蕩2min，再加入IOml乙腈，繼續震蕩^iin，4000r/min離心lOmin，得沉淀G，上清液C并入上述的含有上清液A和B的125ml分液漏斗中；再次在50ml離心管的沉淀G中繼續加入1. 5ml濃度為20%的鹽酸羥胺溶液、2. 5ml濃度為0. 05mol/L的對甲苯磺酸溶液，震蕩2min，再加入IOml乙腈，繼續震蕩2min，4000r/ min離心lOmin，上清液D并入上述的含有上清液A、B及C的125ml分液漏斗中；在上述的含有上清液A、B、C及D的125ml分液漏斗中加入20ml 二氯甲烷，劇烈振搖 2min，靜置分層，將下層溶液轉移至IOOml茄形瓶，45°C旋轉蒸發至近干得殘渣H，用甲醇溶解殘渣H，過0. 22um微濾膜，甲醇定容至5ml，得待測樣液；(4)、待測樣品的分析將步驟(3)所得的樣液在流動相為pH4. O濃度為lOOmmol/L的磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液紫外檢測波長267nm和分離電壓為l(Tl4kV的實驗條件下，進行毛細管電泳檢測分析， 測得峰面積，然后通過步驟(2)所得的標準曲線即可求得待測鯽魚樣品中的殘留結晶紫濃度。
上述的鯽魚樣品中的殘留結晶紫濃度的測定方法，其最低檢1 μ g/kg，檢測精度指標為 RSD<6%.本發明在選擇流動相磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液時，在電壓12kV，檢測波不變的情況下，對同一加標樣品在不同PH值(2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5)的磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液條件下進樣測試，結果發現當緩沖液PH值為4. 0時峰形好，背景噪音低，出峰時間適當，因此，最終確定磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液的PH值為4. 0 ；在PH值為4. 0，檢測波長^7nm，電壓12kV不變的情況下，對同一加標樣品在不同濃度磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，40mmol/L，60mmol/L，80mmol/L，1 OOmmo 1/L, 120mmol/L)條件下進行測試，結果發現當緩沖液濃度為100 mmol/L時靈敏度最好，因此，最終確定磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液的最佳濃度為lOOmmol/L ；在PH值為4. 0，檢測波長沈了 ，lOOmmol/L磷酸-磷酸二氫鈉緩沖液不變的情況下，對同一加標樣品在不同分離電壓(10kV、12kV、14kV)進行測試，結果發現當分離電壓為12KV 時峰形好，背景噪音低，出峰時間適當，因此，最終確定分離電壓優選為12KV。
本發明的有益效果本發明的一種鯽魚中殘留結晶紫的測定方法，由于使用無毒無害、環境友好的磷酸-磷酸鹽緩沖液為流動相，對環境友好，且由于采用了毛細管電泳-紫外可見檢測法測定，當空白樣品結晶紫添加水平為5、10、20μ g/ml時平均回收率分別為83. 97%、109. 55%和 88. 45%，相對標準偏差分別為3. 22%,5. 05%和2. 09%。另外，本發明的一種鯽魚中殘留結晶紫的測定方法，測定成本低廉，操作簡單，標準溶液最低檢限為1 μ g/kg，檢測精度指標為RSD<6%，基本能達到國家規定的水產品中結晶紫殘留不高于2 μ g/kg的指標要求。
圖1是結晶紫和隱色結晶紫的結構示意圖； 圖2是繪制的標準曲線圖3是實施例1加標樣品的CE圖譜； 圖4是實施例2加標樣品的CE圖譜； 圖5是實施例3加標樣品的CE圖譜； 圖6是實施例4加標樣品的CE圖譜。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明進一步闡述，但并不限制本發明。本發明所用的儀器如下
TriSepTM-2100加壓毛細管電色譜儀、Trisep-2003化學工作站、毛細管， 60/35. 5cmX 50 μ m I. D. 375 μ m 0. D.(美國通威公司)； 高速勻漿機(德國IKA公司)； 離心機(上海安亭科學儀器廠)； 旋轉蒸發儀(RE52CS-2S上海亞榮生化儀器廠)； 旋渦振蕩器(上海精密儀器儀表有限公司)； PH計(上海佑科儀器儀表有限公司)；
分析天平(Mottletr Toledo, Mettler Instr. (Shanghai)Ltd.); 微孔過濾器(上海國藥集團化學試劑有限公司)； 微量移液器(上海求精玻璃儀器廠)。本發明所用的試劑如下
結晶紫標準品(色譜純)，甲醇(色譜純)，乙腈、二氯甲烷、硼氫化鉀、對甲苯磺酸、鹽酸羥胺、二甘醇、無水乙酸銨、冰乙酸、磷酸二氫鈉均為分析純，磷酸，層析用酸性氧化鋁 (100^200目)，以上試劑均購于上海國藥集團化學試劑有限公司。本發明中涉及的“回收測定值”是指加標回收試驗所測得的隱色結晶紫的含量。RSD，即相對標準偏差(Relative Standard Deviation)，其計算公式為其中，η表示一個重復實驗總共測定的次數； xi表示第i次測得的回收測定值；i表示η次測定的回收測定值的算術平均值。
實施例1一種鯽魚中殘留結晶紫的測定的方法，即利用毛細管電泳-紫外可見檢測(CE— UV-VIS)法進行測定，其具體包括下列步驟(1)、試劑的配制0. 03mol/L硼氫化鉀溶液，現配現用，用水溶解0. 405g硼氫化鉀并定溶至250ml ； 0. 2mol/L硼氫化鉀溶液，現配現用用水溶解1. 08g硼氫化鉀并定溶至IOOml ； 20%鹽酸羥胺溶液用水溶解25g鹽酸羥胺并定溶至IOOml ； 0. 05 mol/L對甲苯磺酸溶液0. 95g對甲苯磺酸用水溶解并稀釋至100ml.(2)、標準曲線的繪制先準確配制ΙΟΟμ g/ml的結晶紫標準溶液，再取適量上述制備好的結晶紫標準溶液， 逐滴加入上述現配的0. 03mol/L硼氫化鉀溶液直到溶液變為無色，然后用甲醇稀釋成濃度為1 μ g/ml的隱色結晶紫標準工作液；按上述方法再準確配制濃度分別為2、4、8、16、32μ g/ml的隱色結晶紫標準工作液； 進TriS印TM-2100加壓毛細管電色譜儀用CE模式測定，以結晶紫標準工作液的濃度對峰面積作標準曲線，所得的標準曲線圖見圖2，線性回歸方程為y=1535. lx_681. 7， R2=0. 9942，其中χ為隱色結晶紫的質量濃度，y為峰面積，由此可知標準樣品濃度在 Γ32 μ g/ml時，線性關系良好，故線性范圍為Γ32 μ g/ml ；(3)、待測鯽魚樣品的預處理稱取5. OOg待測鯽魚背脊肉組織于50ml離心管內，加入相當50 μ g的隱色結晶紫(即 2 μ g/ml的隱色結晶紫標準液25ml)，加入IOml乙腈，lOOOOr/min勻漿提取30s，加入5g酸性氧化鋁，震蕩anin，4000r/min離心lOmin，上清液A轉移至125ml分液漏斗中，在分液漏斗中加入2ml 二甘醇，3mL濃度為0. 2mol/L硼氫化鉀溶液，振搖^iiin ；取IOml乙腈，移入離心管的沉淀E中，再加入3ml濃度為0. 2mol/L硼氫化鉀溶液，用玻璃棒搗散離心管中的沉淀E并攪勻，旋渦混勻器上振蕩lmin，靜置20min，4000r/min離心 lOmin，得沉淀F，上清液B并入上述的含有上清液A的125ml分液漏斗中；在50ml離心管的沉淀F中繼續加入1. 5ml濃度為20%的鹽酸羥胺溶液、2. 5ml濃度為 0. 05mol/L的對甲苯磺酸溶液，震蕩2min，再加入IOml乙腈，繼續震蕩^iin，4000r/min離心lOmin，得沉淀G，上清液C并入上述的含有上清液A和B的125ml分液漏斗中；再次在50ml離心管的沉淀G中繼續加入1. 5ml濃度為20%的鹽酸羥胺溶液、2. 5ml濃度為0. 05mol/L的對甲苯磺酸溶液，震蕩2min，再加入IOml乙腈，繼續震蕩2min，4000r/ min離心lOmin，上清液D并入上述的含有上清液A、B及C的125ml分液漏斗中；在上述的含有上清液A、B、C及D的125ml分液漏斗中加入20ml 二氯甲烷，劇烈振搖 2min，靜置分層，將下層溶液轉移至100ml茄形瓶，45°C旋轉蒸發至近干得殘渣H，用甲醇溶解殘渣H，過0. 22um微濾膜，甲醇定容至5ml，得待測樣液；(4)、待測樣品的分析將步驟(3)所得的樣液在流動相為pH4. 0濃度為lOOmmol/L的磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液紫外檢測波長267nm和分離電壓為12kV的實驗條件下，進行毛細管電泳檢測分析，最終獲得的CE圖譜見圖3，從圖3中可以看出，下出峰時間為iaiiin左右，峰高1. 3mV,峰面積為16955，通過圖2中所得的標準曲線的線性回歸方程y=1535. lx-681. 7，R2=0. 9942，即可求得待測鯽魚樣品中的殘留結晶紫濃度為11. 49μ g/ml。將實施例1重復6次，得到回收測定值分別為10. 81，11. 92，10. 79，11. 42，10. 32， 10. 47 μ g/ml，求算術平均值得平均回收率為109. 55%,計算RSD為5. 05%。實施例2
一種鯽魚中殘留結晶紫的測定的方法，即利用毛細管電泳-紫外可見檢測(CE— UV-VIS)法進行測定，其具體包括下列步驟
實施例1步驟(3)中加入隱色結晶紫的量變為25 μ g，步驟(4)中毛細管電泳檢測的分離電壓為14kV，其他同實施例1，最終獲得的CE圖譜見圖4，從圖4中可以看出，下出峰時間為IOmin左右，峰高0. 65mV,峰面積為7013，通過圖2所得的標準曲線的線性回歸方程即可求得待測鯽魚樣品中的殘留結晶紫濃度為5. 01 μ g/ml。實施例3
一種鯽魚中殘留結晶紫的測定的方法，即利用毛細管電泳-紫外可見檢測(CE— UV-VIS)法進行測定，其具體包括下列步驟
步驟(4)中毛細管電泳檢測的分離電壓為10kV，其他同實施例2，最終獲得的CE圖譜見圖5，從圖5中可以看出，下出峰時間為18min左右，峰高0. 65mV，峰面積為8409，通過圖2 所得的標準曲線的線性回歸方程即可求得待測鯽魚樣品中的殘留結晶紫濃度為5. 92 μ g/ ml ο實施例4
一種鯽魚中殘留結晶紫的測定的方法，即利用毛細管電泳-紫外可見檢測(CE— UV-VIS)法進行測定，其具體包括下列步驟
步驟(4)中毛細管電泳檢測的分離電壓為12kV，其他同實施例2，最終獲得的CE圖譜見圖6，從圖6中可以看出，下出峰時間為Hmin左右，峰高0. 47mV，峰面積為5沈7，通過圖2 所得的標準曲線的線性回歸方程即可求得待測鯽魚樣品中的殘留結晶紫濃度為3. 94 μ g/ ml ο實施例5
一種鯽魚中殘留結晶紫的測定的方法，即利用毛細管電泳-紫外可見檢測(CE— UV-VIS)法進行測定，其具體包括下列步驟
將實施例1步驟(3)中加入隱色結晶紫的量變為25 μ g(即1 μ g/ml的隱色結晶紫標準液25ml)，其他同實施例1。重復6次，得到回收測定值分別為4. 02，4. 37，4. 15，4. 26，4. 05， 4. 34 μ g/ml，求算術平均值得平均回收率為83. 97%，RSD為3. 22%。實施例6
一種鯽魚中殘留結晶紫的測定的方法，即利用毛細管電泳-紫外可見檢測(CE— UV-VIS)法進行測定，其具體包括下列步驟
將實施例1步驟(3)中加入隱色結晶紫的量變為IOOyg (即4μ g/ml的隱色結晶紫標準液25ml)，其他同實施例1。重復6次，得到回收測定值分別為17. 60，17. 94，18. 17，16. 97，17. 73，17. 73 μ g/ml，求算術平均值得平均回收率為88. 45%, RSD為2. 09%。
以上所述內容僅為本發明構思下的基本說明，而依據本發明的技術方案所作的任何等效變換，均應屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種鯽魚中殘留結晶紫的測定的方法，其特征在于利用毛細管電泳-紫外可見檢測法進行測定，毛細管電泳的流動相為PH4. 0、濃度為lOOmmol/L磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液， 其具體包括下列步驟(1)、試劑的配制0. 03mol/L硼氫化鉀溶液，現配現用，用水溶解0. 405g硼氫化鉀并定溶至250ml ； 0. 2mol/L硼氫化鉀溶液，現配現用用水溶解1. 08g硼氫化鉀并定溶至IOOml ； 20%鹽酸羥胺溶液用水溶解25g鹽酸羥胺并定溶至IOOml ； 0. 05 mol/L對甲苯磺酸溶液0. 95g對甲苯磺酸用水溶解并稀釋至100ml.(2)、標準曲線的繪制將結晶紫溶于甲醇，配制成 οομ g/ml的結晶紫標準甲醇溶液； 再上述制備好的濃度為100yg/ml的結晶紫標準甲醇溶液，逐滴加入步驟(1)配制的 0. 03mol/L硼氫化鉀溶液直到溶液變為無色，然后用甲醇稀釋成濃度為1 μ g/ml的隱色結晶紫標準工作液；按上述方法再準確配制濃度分別為2、4、8、16、32μ g/ml的隱色結晶紫標準工作液； 進TriSepTM-2100加壓毛細管電色譜儀用CE模式測定，以結晶紫標準工作液的濃度對峰面積作標準曲線；(3)、待測鯽魚樣品的預處理稱取5. 00 g待測鯽魚背脊肉組織于50ml離心管內，加入IOml乙腈，10000r/min勻漿提取30s，加入5g酸性氧化鋁，震蕩2min，4000r/min離心lOmin，上清液A轉移至125ml分液漏斗中，在分液漏斗中加入2ml 二甘醇，3 mLO. 2 mol/L硼氫化鉀溶液，振搖^iin ；取IOml乙腈，移入離心管的沉淀E中，再加入:3ml 0. 2mol/L硼氫化鉀溶液，用玻璃棒搗散離心管中的沉淀E并攪勻，旋渦混勻器上振蕩1 min，靜置20min，4000r/min離心 lOmin，得沉淀F，上清液B并入上述的含有上清液A的125ml分液漏斗中；在50ml離心管的沉淀F中繼續加入1. 5ml鹽酸羥胺溶液、2. 5ml對甲苯磺酸溶液，震蕩 2min，再加入IOml乙腈，繼續震蕩2 min, 4000r/min離心lOmin，得沉淀G，上清液C并入上述的含有上清液A和B的125ml分液漏斗中；再次在50ml離心管的沉淀G中繼續加入1. 5ml鹽酸羥胺溶液、2. 5ml對甲苯磺酸溶液， 震蕩2min，再加入IOml乙腈，繼續震蕩2 min, 4000r/min離心lOmin，上清液D并入上述的含有上清液A、B及C的125ml分液漏斗中；在上述的含有上清液A、B、C及D的125ml分液漏斗中加入20ml 二氯甲烷，劇烈振搖 2min，靜置分層，將下層溶液轉移至100ml茄形瓶，45°C旋轉蒸發至近干得殘渣H，用甲醇溶解殘渣H，過0. 22um微濾膜，甲醇定容至5ml，得待測樣液；(4)、待測樣品的分析將步驟(3)所得的樣液在流動相為pH4. 0濃度為lOOmmol/L的磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液紫外檢測波長267nm和分離電壓為l(Tl4kV的實驗條件下，進行毛細管電泳檢測分析， 測得峰面積，然后通過步驟(2)所得的標準曲線求得待測鯽魚樣品中的殘留結晶紫濃度。
2.如權利要求1所述的一種鯽魚中殘留結晶紫的測定的方法，其特征在于步驟(4)所述的分離電壓優選為12V。
3.如如權利要求1所述的一種鯽魚中殘留結晶紫的測定的方法，其特征在于步驟(4)所述的毛細管電泳檢測分析所用的儀器為TriS印TM-2100加壓毛細管電色譜儀。
全文摘要
本發明公開了一種鯽魚中殘留結晶紫的測定方法，即采用毛細管電泳-紫外可見檢測法測定，其流動相為pH4.0、濃度為100mmol/L磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液，使用前經0.22um微濾膜過濾；檢測過程控制紫外檢測波長267nm，分離電壓為12kV。采用的流動相無毒，溶劑甲醇低毒，對環境友好，成本低廉，操作簡單，靈敏度和檢測限均能達到所需要求。本發明的檢測方法，測定成本低廉，操作簡單，標準溶液最低檢限為1μg/kg，檢測精度指標為RSD<6%，基本能達到國家規定的水產品中結晶紫殘留不高于2μg/kg的指標要求。
文檔編號G01N30/06GK102495149SQ20111037975
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者何忠義, 熊麗萍, 王宇紅, 肖虎鵬, 韓生 申請人:上海應用技術學院