專利名稱：赭曲霉毒素a核酸適體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及利用分子生物學技術----SELEX技術設計和制備一種與赭曲霉毒素A高特異性和高親和力結合的赭曲霉毒素A核酸適體及其應用。
背景技術：
赭曲霉毒素是由真菌產生的一組結構類似的有毒的次級代謝產物，有A、B、C、D四種化合物，其中毒性最大、分布最廣、產毒量最高、對農作物污染最嚴重、與人類健康關系最密切是赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)。OTA是由vender Merve于1965年首次從赭曲霉中分離的到的一種真菌毒素，其化學結構為苯甲酸異香豆素，主要由青霉屬某些菌株和赭曲霉及黑曲霉產生，廣泛存在于谷物、咖啡豆、豆類、葡萄干、啤酒、葡萄汁等各類食物和飼料中，谷物及其副產品是OTA的主要來源。OTA主要危害人和動物的腎臟，具有免疫抑制毒性、神經毒性和致畸性，并于1993年被國際癌癥研究機構列為可能的人類致癌物。OTA的定性分析方法有微柱法，因靈敏度較低已極少應用；定量分析方法有薄層色譜法(TLC)、高效薄層色譜法(HPTLC)、高效液相法(HPLC)、熒光比色法和酶聯免疫吸附法(ELISA)等，其中TLC法為我國檢測小麥、玉米和大豆中OTA的國家標準檢測方法，HPLC 法是谷物、寵物食品、咖啡、啤酒、葡萄汁/干、牛奶、腎臟及其它肉類食品、人和動物組織液中OTA的較靈敏檢測方法，而靈敏、高效、便捷的OTA檢測方法當屬ELISA、RIA等免疫學方法，特別是ELISA，由于簡單的樣品預處理過程而廣泛應用于谷物、飼料、動物組織和血清中 OTA的測定。在ELISA分析中，抗體與待測OTA反應的專一性是影響檢測結果準確與否的重要因素。研究結果顯示，抗OTA單克隆抗體與其同系物OTC的交叉反應率為15 20%， 商品化檢測OTA的RIDAscREEN ELISA試劑盒所用抗體與OTC和OTB的交叉反應率分別為44%和14%，這無疑會大大影響檢測結果的準確度，因此獲得高特異性抗OTA的抗體是建立其免疫學檢測法的基礎。核酸適體(aptamer)是一種比抗體具有更高特異性的配基， 甚至能識別單抗所不能區分的靶標分子單個取代基修飾的極細微差別，加之對于OTA這種毒性小分子，其體外篩選、體外制備的特點能夠有效克服抗體制備周期長、生產成本高、技術難度大、批間差異大、克隆株(細胞)難以有效保存的缺點，因此，核酸適體在OTA這種擁有復雜結構類似物的毒性小分子的快速檢測中具有良好的應用前景。
發明內容
本發明的目的在于提供一種采用新一代SELEX技術篩選得到的能夠與赭曲霉毒素A高特異性和高親和力結合的結構轉換信號適體，并提供赭曲霉毒素A核酸適體在赭曲霉毒素A檢測分析和樣品分離富集中的應用方法；具有簡便、快速、經濟等特點，與其他組合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適體具許多優勢。本發明的技術方案一種赭曲霉毒素A核酸適體，其特征在于為核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGCATCGAGCAGGAGACCAGAGGGCGCAGCTACTGAGTGGTATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互補的核苷酸序列所示的DNA分子。所述赭曲霉毒素A核酸適體的衍生物具有相同功能用途。所述赭曲霉毒素A核酸適體的衍生物為核苷酸序列進行氨基化或巰基化或同位素化修飾。所述赭曲霉毒素A核酸適體的衍生物為核苷酸序列結合生物素或酶或地高辛或熒光物質或納米發光材料。一種赭曲霉毒素A核酸適體的應用，其特征在于將赭曲霉毒素A核酸適體用于赭曲霉毒素A的檢測分析，包括以下步驟(1)競爭板準備50μ g/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷或多聚賴氨酸100μ 1 于4°C包被過夜，交聯劑次亞苯基二異硫氰酸鹽或戊二醛活化Mi，200-20(K)pmOl/ml NH2-引物100 μ 1偶聯，0. 2mol/L乙醇胺或甘氨酸封閉2h，硼氫化鈉還原，1 % BSA封閉，PBS洗滌后備用；(2)檢測步驟①赭曲霉毒素A核酸適體5-10pmol，94°C 3min、冰上5min變性；②與O-IOOpmol靶標混勻，總體積100 μ 1，加入板中，室溫孵育30min ；③吸取50 μ 1加入熒光板中，加入1 200 OliGreen 100 μ 1，作用5min ；④測定熒光值(Ex:485nm, Em :525nm)。標準曲線通過6次重復試驗，以熒光數值為縱坐標，以標準濃度為橫坐標，做標準曲線。靈敏度計算通過6次重復試驗，檢測的標靶含量為Ong/ml 士 3*STDV。重復性標樣重復測定5次，計算其測定離散度CV值。回收率以玉米甲醇提取物稀釋50倍為樣品，加入低、中、高濃度標準，重復測定3 次，計算其回收率。OTA檢測試劑盒檢測靈敏度1. 14ng/ml，重復性CV < 6%以玉米勻漿甲醇提取物為樣品1 50稀釋，回收率見表
加入量測定值(ng/ml)測定均值標準差回收率
(ng/inl)(ng/inl)(%)
2.02. 12 2.22 1.962. 100. 131 105.00
10.0 10.12 10.43 11.2110.590.562 105.87
50.0 48.60 49.04 48.43 48.690.315 97.38一種赭曲霉毒素A核酸適體的應用，其特征在于將赭曲霉毒素A核酸適體用于從樣品中分離、富集赭曲霉毒素A，包括以下步驟(1)將偶聯有赭曲霉毒素A核酸適體的磁顆粒與待分離的含赭曲霉毒素A的溶液
4充分混合；(2)用磁分離器富集磁顆粒，并清洗，然后將赭曲霉毒素A從偶聯有核酸適體的磁顆粒上解離，得到赭曲霉毒素A單組份。—種赭曲霉毒素A核酸適體的互補序列的應用，其特征在于應用于赭曲霉毒素A 檢測分析中，包括以下步驟①赭曲霉毒素A檢測層析試紙條，其基本結構組成包括支撐墊、膠體金結合墊、 硝酸纖維素膜、吸水墊等；②膠體金結合墊上含有核酸適體與其互補序列組裝的納米顆粒聚集體(經生物素標記)6 μ 1，硝酸纖維素膜上含有l-10mg/ml鏈霉親和素2 μ 1的檢測線；③檢測時，將試紙條吸收板端插入待測樣品的溶液中，約20s，液體完全濕潤連接板并進入膜，取出紙條，放在平臺上讓液體繼續流動，若待測液中無靶標，聚集體較大，不能隨液流進入硝酸纖維素膜，不顯色，若待測液中有靶標赭曲霉毒素A存在，可導致組裝的聚集體解離而形成分散的納米顆粒，分散的納米顆粒隨液流進入纖維素膜，納米顆粒上的生物素標記物與膜上鏈霉親和素結合，顯紅色，是為陽性結果，且顯色程度與靶標濃度呈正比關系。本發明一種赭曲霉毒素A核酸適體的特性評測1、熒光定量PCR法評價赭曲霉毒素A核酸適體的活性充分洗滌組裝(通過其互補序列實現)有赭曲霉毒素A核酸適體的磁顆粒，然后用終濃度1 μ M的赭曲霉毒素A進行競爭，室溫反應30min。以競爭反應產物為模板進行熒光定量PCR反應，采用 Invitrogen 公司的試劑盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix_UD6， 20 μ 1體系中含模板2 μ 1、引物PI、P2各20pmol，退火溫度65°C。同時設置以溶劑甲醇作為競爭物的對照組。結果
_Ct 均值(n=3)實驗組12. 1
甲醇對照組/可見赭曲霉毒素A核酸適體對赭曲霉毒素A具有特異性親和能力。2、染料法評價赭曲霉毒素A核酸適體的活性充分洗滌組裝(通過其互補序列實現)有赭曲霉毒素A核酸適體的磁顆粒，然后用終濃度ι μ M的赭曲霉毒素A進行競爭，室溫反應30min。Oligreen染料用結合緩沖液按 1 200稀釋后，等比例加入競爭反應液中，室溫避光反應2-5min，用480nm光激發，測定 520nm處的發射光。同時設置以甲醇作為競爭物的對照組和結合緩沖液本底對照組。結果本底對照組未檢測到發射光，實驗組熒光強度顯著高于甲醇對照組，可見赭曲霉毒素A核酸適體對赭曲霉毒素A具有特異性親和能力。3、經基團修飾的赭曲霉毒素A核酸適體的活性評價依熒光定量PCR法評價赭曲霉毒素A核酸適體的活性的方法，用熒光定量PCR法分別進行氨基化赭曲霉毒素A核酸適體、巰基化赭曲霉毒素A核酸適體、同位素化赭曲霉毒素A核酸適體、生物素標記的赭曲霉毒素A核酸適體、HRP標記的赭曲霉毒素A核酸適體、AP 標記的赭曲霉毒素A核酸適體、地高辛標記的赭曲霉毒素A核酸適體、TAMRA標記的赭曲霉毒素A核酸適體、以及納米發光材料ISiO5 = Eu標記的赭曲霉毒素A核酸適體的活性評價。結果
權利要求
1.一種赭曲霉毒素A核酸適體，其特征在于為核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGCATCGAGCAGGAGACCAGAGGGCGCAGCTACTGAGTGGTATCGTGTGAAGTGC TGTCCC或其互補的核苷酸序所示的DNA分子。
2.根據權利要求1所述一種赭曲霉毒素A核酸適體，其特征在于與所述赭曲霉毒素A 核酸適體具有相同功能用途的衍生物為核苷酸序列進行氨基化或巰基化或同位素化修飾。
3.根據權利要求1所述一種赭曲霉毒素A核酸適體，其特征在于與所述赭曲霉毒素A 核酸適體具有相同功能用途的衍生物為核苷酸序列結合生物素或酶或地高辛或熒光物質或納米發光材料。
4.一種權利要求1所述赭曲霉毒素A核酸適體的應用，其特征在于用于赭曲霉毒素A 的檢測分析。
5.一種權利要求1所述赭曲霉毒素A核酸適體的應用，其特征在于用于從樣品中分離、 富集赭曲霉毒素A
6.一種權利要求2或3所述赭曲霉毒素A核酸適體衍生物的應用，其特征在于應用于赭曲霉毒素A檢測分析和分離富集中。
全文摘要
本發明涉及一種與赭曲霉毒素A高特異性和高親和力結合的核酸適體及其應用，該核酸適體可以用于赭曲霉毒素A的檢測分析和分離富集，具有特異性好、親和力高、品質均一、穩定性好、開發周期短、生產成本低、使用方便的特點。本發明還涉及所述核酸適體序列的衍生序列，包括修飾后的序列。
文檔編號G01N21/64GK102517288SQ20111037764
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者劉海霞, 劉雅文, 吳淑慶 申請人:國家納米技術與工程研究院