專利名稱：一種糖類過敏原的測定方法
一種糖類過敏原的測定方法技術領域
本發明屬于醫藥生物技術領域，具體的說，本發明描述了一種糖類過敏原的檢測方法。
背景技術：
食物過敏是人們對食物產生IgE介導的I型變態反應，臨床表現為蕁麻疹、哮喘、腹痛和腹瀉等多種癥狀，嚴重的可導致休克。一般來說，食物過敏原為分子量介于 10 70 kD之間的蛋白或糖蛋白。隨著社會發展，人們飲食結構的變化，過敏發病率日益增高，給人們健康造成巨大威脅。在過敏反應中，90%以上是由蛋類、花生、乳類等八類食物所引起。目前對一些食品中過敏原的檢測方法還很有限，主要有基于一些過敏原的免疫反應來檢測。但是這個方法存在成本高，此外對于一些過敏原來說，相應的抗體或抗原難以得到，因而也阻礙了免疫檢測技術在過敏原檢測中的應用。發明內容
技術問題本發明針對上述技術問題，提供一種氧化鋅量子點標記糖類過敏原的溶出伏安法檢測芯片，該方法利用氧化鋅標記糖類過敏原檢測低濃度糖類過敏原，對相應糖類過敏原的檢測限低、選擇性好、靈敏度高、穩定性好。
技術方案在本發明的糖類過敏原的測定方法，利用氧化鋅量子點標記糖類過敏原；同時在電解池中的芯片上固定化一層凝集素，在一系列已知濃度的待測糖類過敏原溶液中，使標記了氧化鋅量子點的糖類過敏原和芯片上的凝集素進行特異性結合，把標記在糖類過敏原上的氧化鋅量子點連接到芯片上；然后用酸性溶液把氧化鋅量子點溶解為鋅離子，用溶出伏安法測定溶出的鋅離子的濃度，建立鋅離子濃度與糖類過敏原濃度之間的關系，從而確定待測糖類過敏原濃度。
具體測定方法為a.將0.5 5毫克氧化鋅量子點分散到50 200微升1納克/毫升的糖類過敏原溶液中，在室溫下震蕩lOmin，離心，用pH值為6. 8^7. 5的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次。再加500 μ L Γ2% w/v牛血清蛋白，15 35°C下震蕩l(T30min，離心，用pH值為6. 8 7. 5的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次；最終分散于5(Γ150 μ L 0.05 0.1% ν/ν曲拉通Χ_100磷酸緩沖溶液，不用時保存于冰箱保溫層；b.將二氧化硅片或玻璃片分別在丙酮、乙醇和水中分別超聲5min，然后在6(Γ80° C 的ΝΗ40Η/Η202 /H2O 1:1:5 7，ν/ν和HC1/H202/H20 1 1 4 6，ν/ν分別浸泡 5 IOmin ；拿出后用清水洗干凈，晾干；然后放入5%ν/ν的3-胺丙基乙氧基硅烷的乙醇溶液中浸泡2飛h， 洗干凈、晾干，再放入l(Tl5mL含廣2°如八戊二醛？!1值為6.8 7.5的磷酸鹽緩沖溶液，于 4°C靜置纊12 h，隨后用去離子水清洗、晾干，待用；c.將修飾后的芯片安裝在一個孔徑小于芯片邊長的電解池中，將50μ L含1 2 mg/ HiL凝集素PH值為6.纊7. 5的磷酸鹽緩沖溶液滴在上述處理好的芯片上，并于4°C靜置纊12 h,隨后用去離子水清洗；然后將上述芯片用含0.5 1% w/v牛血清蛋白和0.05 ^0. 1% ν/ν吐溫-20浸泡0. 5^1 h,隨后用去離子水清洗、待用；d.將處理好的待測樣品滴在制備好的芯片上，放置15飛Omin，用去離子水清洗芯片表面3次；e.向電解池中注入pH值為廣3的鹽酸溶液溶解芯片上的氧化鋅量子點，并用pH值為 Γ3鹽酸溶液洗三次，合并溶解液和洗液，加pH值為6. 8^7. 5的磷酸鹽緩沖溶液至廣3毫升；f.用鉬電極為對電極，銀/氯化銀電極為參比電極，汞膜電極為工作電極，-0.8^-1. 5伏富集9(Γ150秒，用方波伏安法測鋅的溶出峰，電位約在-1. 1伏；g.改變第1步糖類過敏原濃度，重復第e、f、g步，測定一系列糖類過敏原濃度相對應的鋅的溶出伏安峰的峰值電流，建立峰值電流與糖類過敏原濃度之間的對應關系。
所述芯片為二氧化硅片或玻璃片。
以上過程測得的鋅的溶出伏安峰值電流與糖類過敏原濃度之間的對應關系是本發明方法的重要的基礎數據，為用此發明方法進行實際臨床檢測提供濃度判定的理論依據，對利用本發明方法進行快速、準確的臨床檢測有著極其重要的意義。
上述凝集素與糖類過敏原為刀豆凝集素及其雞卵粘蛋白。
上述芯片為二氧化硅片或玻璃片。
有益效果與現有技術相比，本發明具有以下優點1，本發明氧化鋅量子點對糖類過敏原的標記過程與溶出過程，操作簡單，條件溫和，量子點與糖類過敏原的結合穩定牢固。非常有利于保持糖類過敏原的生物活性。
2，本發明運用溶出伏安法測鋅離子濃度，易于鋅在汞電極上的富集，鋅的溶出峰易測且峰值電流強，易于建立準確的峰值電流與糖類過敏原濃度之間的曲線關系。有利于降低糖類過敏原檢測的檢測限，提高檢測靈敏度。使快速準確檢測低濃度糖類過敏原成為可能。
下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。
圖1是過敏原檢測芯片組裝示意圖。
圖2是標準樣品的過敏原芯片檢測結果。
具體實施方式
(如圖1)1，將0. 5毫克氧化鋅量子點分散到50微升1納克/毫升的雞卵粘蛋白溶液中，在室溫下震蕩lOmin，離心，用pH值為7. O的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次。再加500 μ L 1% (w/v) 牛血清蛋白，室溫下震蕩lOmin，離心，用pH值為7. O的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次。最終分散于50 μ L 0. 1% (ν/ν)曲拉通X-IOO pH值為7. O的磷酸鹽緩沖溶液，不用時保存于冰箱保溫層。
2，芯片修飾，硅片(1x1x0. 2mm)分別在丙酮、乙醇和水中分別超聲5min，然后在80° C 的 NH40H/H202 /H2O (1 1 7，ν/ν)和 HC1/H202/H20 (1 1 6，ν/ν)分別浸泡 IOmin0 拿出后用清水洗干凈，晾干。然后放入5%(ν/ν)3-胺丙基乙氧基硅烷的乙醇溶液中浸泡5 h， 洗干凈、晾干，再放入含有洲(v/V)戊二醛PH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液，于4°C靜置12 h，隨后用去離子水清洗、晾干，待用。
3，檢測芯片制備，將修飾后的安裝在一個孔徑小于芯片邊長的電解池中，將50 yL含有1 mg/mL刀豆凝集素pH值為7. 0的磷酸鹽緩沖溶液滴在上述處理好的芯片上， 并于4°C靜置12 h,隨后用去離子水清洗。然后將上述芯片用含1% (w/v)牛血清蛋白和 0.05 % ( ν/ν)吐溫-20浸泡1 h，隨后用去離子水清洗、待用。
4，檢測方法，將處理好的雞卵粘蛋白樣品滴在制備好的刀豆凝集素芯片上，放置 15min,用去離子水清洗芯片表面3次。
5，向電解池中注入1800 μ L pH值為2的鹽酸溶液超聲IOmin以溶解芯片上的氧化鋅量子點，隨后上如溶液轉移到電解池并依次加入2000 μ L PH值為7. 01的磷酸鹽緩沖溶液，4uL 10 ppm硝酸汞(II)。50 μ L氫氧化鈉溶液(0.32 Μ)。然后用電化學檢測，6，用鉬電極為對電極，銀/氯化銀電極為參比電極，汞膜電極為工作電極，-1.3 V電富集2 min，用方波伏安法測鋅的溶出峰，電位約在-1. 1伏。
7，改變第1步雞卵粘蛋白濃度，重復第4、5、6步，測定一系列雞卵粘蛋白濃度相對應的鋅的溶出伏安峰的峰值電流，建立峰值電流與雞卵粘蛋白濃度之間的對應關系(圖2)。權利要求
1.一種糖類過敏原的測定方法，其特征在于利用氧化鋅量子點標記糖類過敏原；同時在電解池中的芯片上固定化一層凝集素，在一系列已知濃度的待測糖類過敏原溶液中，使標記了氧化鋅量子點的糖類過敏原和芯片上的凝集素進行特異性結合，把標記在糖類過敏原上的氧化鋅量子點連接到芯片上；然后用酸性溶液把氧化鋅量子點溶解為鋅離子，用溶出伏安法測定溶出的鋅離子的濃度，建立鋅離子濃度與糖類過敏原濃度之間的關系，從而確定待測糖類過敏原濃度。
2.根據權利要求1所述的糖類過敏原的測定方法，其特征在于具體測定方法為a.將0.5 5毫克氧化鋅量子點分散到50 200微升1納克/毫升的糖類過敏原溶液中，在室溫下震蕩lOmin，離心，用pH值為6. 8 7. 5的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次。再加 500 μ Ll 2% w/v牛血清蛋白，15 下震蕩10 30min，離心，用pH值為6. 8 7. 5 的磷酸鹽緩沖溶液清洗三次；最終分散于50 150 μ L 0. 05 0. (ν/ν)曲拉通Χ-100 磷酸緩沖溶液，不用時保存于冰箱保溫層；b.將二氧化硅片或玻璃片分別在丙酮、乙醇和水中分別超聲5min，然后在60 80°C的 ΝΗ40Η/Η202/Η20 1:1: 5 7，ν/ν 禾口 HC1/H202/H20 1:1: 4 6，ν/ν 分另Ij浸泡 5 IOmin ；拿出后用清水洗干凈，晾干；然后放入5% ν/ν的3-胺丙基乙氧基硅烷的乙醇溶液中浸泡2 5h，洗干凈、晾干，再放入10 15mL含1 2% ν/ν戊二醛pH值為6. 8 7. 5 的磷酸鹽緩沖溶液，于4°C靜置8 12h，隨后用去離子水清洗、晾干，待用；c.將修飾后的芯片安裝在一個孔徑小于芯片邊長的電解池中，將50μ L含1 ang/mL 凝集素PH值為6. 8 7. 5的磷酸鹽緩沖溶液滴在上述處理好的芯片上，并于4°C靜置8 12h，隨后用去離子水清洗；然后將上述芯片用含0. 5 1 % w/v牛血清蛋白和0. 05 0. 1 % ν/ν吐溫-20浸泡0. 5 lh，隨后用去離子水清洗、待用；d.將處理好的待測樣品滴在制備好的芯片上，放置15 50min，用去離子水清洗芯片表面3次；e.向電解池中注入pH值為1 3的鹽酸溶液溶解芯片上的氧化鋅量子點，并用pH值為1 3鹽酸溶液洗三次，合并溶解液和洗液，加pH值為6. 8 7. 5的磷酸鹽緩沖溶液至 1 3毫升；f.用鉬電極為對電極，銀/氯化銀電極為參比電極，汞膜電極為工作電極，-0.8 -1.5 伏富集90 150秒，用方波伏安法測鋅的溶出峰，電位約在-1. 1伏；g.改變第1步糖類過敏原濃度，重復第e、f、g步，測定一系列糖類過敏原濃度相對應的鋅的溶出伏安峰的峰值電流，建立峰值電流與糖類過敏原濃度之間的對應關系。
3.根據權利要求2所述的氧化鋅量子點標記糖類過敏原的溶出伏安測定方法，其特征在于所述芯片為二氧化硅片或玻璃片。
全文摘要
本發明是一種糖類過敏原的測定方法，利用氧化鋅量子點標記糖類過敏原；同時在電解池中的芯片上固定化一層凝集素，在一系列已知濃度的待測糖類過敏原溶液中，使標記了氧化鋅量子點的糖類過敏原和芯片上的凝集素進行特異性結合，把標記在糖類過敏原上的氧化鋅量子點連接到芯片上；然后用酸性溶液把氧化鋅量子點溶解為鋅離子，用溶出伏安法測定溶出的鋅離子的濃度，建立鋅離子濃度與糖類過敏原濃度之間的關系，從而確定待測糖類過敏原濃度。
文檔編號G01N27/48GK102520163SQ20111036483
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者徐春祥, 楊池, 王明亮 申請人:東南大學