專利名稱：雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品及制備方法
技術領域：
本發明涉及雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品及其制備方法，屬于標準物質技術和獸用生物制品技術領域。
背景技術：
雞新城疫(ND)又稱亞洲雞瘟，是由禽副流感病毒型新城疫病毒(NDV)引起的一種主要侵害雞、火雞、野禽及觀賞鳥類的高度接觸傳染性、致死性疾病，其感染呈全球趨勢， 給世界上很多國家和地區帶來了嚴重的經濟損失。世界動物衛生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。目前，紅細胞凝集抑制(HI)試驗是雞新城疫診斷的常用方法，為了促進雞新城疫診斷試驗的國際一體化和抗原標準化，英國衛橋 Veterinary Laboratories Agency (VLA)于 1966 年研制出國際標準血清(可從 National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC)獲得)，也稱之為基準標準品，各國實驗室用國際標準品溯源制備各自的國家標準品，用于標定雞新城疫HI試驗。目前，可從OTBSC獲得的雞新城疫血凝抑制試驗陽性血清國際標準品是通過雞新城疫嗜內臟型強毒Herts33株病毒免疫SPF雞后制備完成的(WHO International Standard :The 1st International Reference Preparation for anti-Newcastle disease serum. NIBSC code :NDS, Instructions for use (Version 3.0，Dated 18/03/2008))。本發明是通過雞新城疫弱毒La Sota株病毒和滅活疫苗免疫SPF雞后制備完成的，使得安全性更好。而且， 標準品的質量要求高，制備方法和檢驗或標定方法嚴格，有關的制備程序和標定方法至今未見報道。
發明內容
本發明的目的是以NIBSC獲得的雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國際標準品為溯源，建立一批國家級雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清標準品，用于標定我國的雞新城疫紅細胞凝集抑制試驗。本發明是通過以下技術路線來實現的(1)是通過雞La Sota株新城疫病毒和新城疫滅活疫苗免疫SPF雞制備高免血清當抗體水體滿足要求時采用無菌心臟采血法取血、分離血清、加入抗生素，備用；(2)陽性血清國家標準品候選物的選擇和制備用紅細胞凝集抑制試驗的方法，對被檢陽性血清分別進行測定，若連續重復測定3 次以上，試驗結果完全一致，且陽性血清的HI效價達1 5120倍以上則該陽性血清即可作為；以雞新城疫陰性血清將雞新城疫陽性血清國家標準品的候選物稀釋成與雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國際標準品的效價一致；候選物經0. 4 μ m和0. 22 μ m無菌濾膜過濾、精確分裝至ImL滅菌長安瓿，分裝精度為士0. OlmL，按常規方法凍干后抽真空、熔封；
(3)標準品的檢驗1)物理性狀、無菌檢驗、真空度測定、剩余水分測定按《中華人民共和國獸用生物制品規程》(中華人民共和國農業部.中華人民共和國獸用生物制品規程二〇〇〇年版.化學工業出版社，2001，本發明以下簡稱《規程》)和《中華人民共和國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典2005年版三部，中國農業出版社，2005，本發明以下簡稱《中國獸藥典》)規定方法進行，并符合其規定；2)效價測定隨機抽取規定數量的樣品用陽性血清國際標準品為參比進行HI試驗測定其效價；3)均一性檢驗隨機抽取規定數量的樣品，用陽性血清國際標準品作參比進行HI 試驗測定其效價，試驗結果應一致；4)穩定性試驗檢查在37°C下，樣品放置的時間，并以此數據作為依據，為下一批穩定性試驗作基礎；幻協作標定定值選擇3個以上具有對雞新城疫HI試驗富有經驗的實驗室，每個實驗室用3個樣品，每個樣品重復2次，同時用國際標準品做參比，各協作標定單位按照協作標定方案的要求進行標定；并將實驗結果交給組織單位進行整理后確定協作標定數值；通過協作標定結果，計算出ImL雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品的國際單位含量，以此作為國家標準品的確定值。本發明的詳細描述一、雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品候選物的制備選取雞新城疫HI抗體為陰性的SPF雞后，以La Sota株雞新城疫病毒和雞新城疫滅活疫苗作為免疫抗原對雞進行免疫，第一次用病毒抗原，第二次和第三次用滅活疫苗按照表1免疫程序進行免疫。每次免疫后每隔一天翅靜脈采血ImL監測免疫后抗體水平的變化情況。當抗體水體滿足要求時采用無菌心臟采血法取血，10000r/m離心分離血清。每ImL血清加入各1000 個單位的青霉素和鏈霉素。-20°C冷凍保存，備用。二、雞新城疫血凝抑制試驗(HI試驗)用陽性血清國家標準品候選物的鑒定1、無菌檢驗按《規程》規定方法進行。2、效價測定按《中國獸藥典》規定紅細胞凝集抑制(HI)試驗的方法對被檢陽性血清分別進行 HI試驗測定效價，在2次以上重復測定效價均相同的基礎上，根據效價測定試驗結果確定被檢陽性血清的HI效價。3、候選物的選擇若連續重復測定3次以上，試驗結果完全一致，且陽性血清的HI效價達1 5120 倍以上則該陽性血清即可作為雞新城疫陽性血清國家標準品的候選物。三、雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品的制備將檢驗后符合要求的標準血清候選物以雞新城疫陰性血清按照雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國際標準品的國際單位進行稀釋，即使稀釋后的血清與雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國際標準品的效價一致。候選物經0. 4 μ m和0. 22 μ m無菌濾膜過濾、精確分裝至ImL滅菌長安瓿，分裝精度為士0. OlmL，按常規方法凍干后抽真空、熔封制備成陽性血清國家標準品。四、雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品的檢驗1、物理性狀凍干陽性血清國家標準品為淡黃色疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。2、無菌檢驗按照《規程》規定的方法進行無菌檢驗或純粹檢驗，應無菌生長。3、真空度測定按照《規程》規定的方法進行真空度檢驗，應符合規定。4、剩余水分測定依據《中國獸藥典》規定，以真空烘干法進行測定，應不超過4%。5、效價測定隨機抽取規定數量的樣品按《中國獸藥典》規定雞新城疫血凝抑制試驗方法用陽性血清國際標準品為參比進行HI試驗測定其效價。6、均一性檢驗隨機抽取規定數量的樣品，用NIBSC雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國際標準品作參比進行HI試驗測定其效價，試驗結果應一致。7、穩定性試驗用熱加速穩定性試驗測定，檢查在高溫(37°C )條件下，樣品放置的時間，并以此數據作為依據，為下一批穩定性試驗作基礎。8、定值(協作標定)中國獸醫藥品監察所相關部門作為組織單位負責協作標定工作，制定方案后，選擇3個以上具有對雞新城疫HI試驗富有經驗的實驗室，每個實驗室用3 個樣品，每個樣品重復2次，同時用國際標準品做參比，各協作標定單位按照協作標定方案的要求進行標定，并將實驗結果交給組織單位。(1)組織單位將實驗結果進行整理后，確定協作標定數值。(2)國際單位確定通過協作標定結果，計算出ImL雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品的國際單位含量，以此作為國家標準品的確定值。本發明的積極意義本發明涉及一種雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品及其制備方法。本發明所涉及的雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品是利用La Sota株雞新城疫病毒(NDV)和雞新城疫滅活疫苗免疫SPF雞制備高免血清作為候選物，通過候選物檢驗、標準品制備和檢驗、分裝、凍干等工藝過程，并以NIBSC獲得的雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國際標準品為參比進行紅細胞凝集抑制試驗測定其效價，經過均一性檢驗、穩定性試驗、 協作標定，數據統計，保證效價定值準確而制備出雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品。本發明的方法按照標準品制備程序使標準品制備更加科學、嚴謹、完善。
實施例實施例1雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品的制備1候選物的制備從北京實驗動物中心采購12周齡的SPF雞(全部為公雞)20只，以HI試驗確定 20只雞確為陰性后，以雞新城疫La Sota株病毒(乾元浩生物股份有限公司2007年02月 05日制備的新城疫La Sota株生產用種毒(濕毒)病毒)和雞新城疫滅活疫苗(北京市獸醫生物藥品廠2007年06月05日制備的新城疫La sota株油劑滅活疫苗，批號為0704)表1進行免疫后試驗雞均未出現局部和全身不良反應t表1免疫程序
權利要求
1.一種雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品，其特征在于本發明所涉及的雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品是以NIBSC獲得的雞新城疫血凝抑制試驗用紅細胞凝集抑制效價為1 160，國際單位含量為320IU/mL的陽性血清國際標準品為溯源測定其紅細胞凝集抑制效價為1 160，根據國際標準，計算其國際單位含量為320IU/mL。
2.一種雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品的制備方法，其特征在于(1)是通過雞LaSota株新城疫病毒和新城疫滅活疫苗免疫SPF雞制備高免血清。當抗體水體滿足要求時采用無菌心臟采血法取血、分離血清、加入抗生素，備用；(2)陽性血清國家標準品候選物的選擇和制備紅細胞凝集抑制試驗的方法對被檢陽性血清分別進行測定，若連續重復測定3次以上，試驗結果完全一致，且陽性血清的HI效價達1 5120倍以上則該陽性血清即可作為；以雞新城疫陰性血清將雞新城疫陽性血清國家標準品的候選物稀釋成與雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國際標準品的效價一致；候選物經0. 4 μ m和0. 22 μ m無菌濾膜過濾、精確分裝至ImL滅菌長安瓿，分裝精度為士0. OlmL，按常規方法凍干后抽真空、熔封；(3)標準品的檢驗1)物理性狀、無菌檢驗、真空度測定、剩余水分測定按《中華人民共和國獸用生物制品規程》和《中華人民共和國獸藥典》規定方法進行檢驗；2)效價測定隨機抽取規定數量的樣品用陽性血清國際標準品為參比進行HI試驗測定其效價；3)均一性檢驗隨機抽取規定數量的樣品，作參比進行HI試驗測定其效價，試驗結果應一致；4)穩定性試驗檢查在37°C下，樣品放置的時間，并以此數據作為依據，為下一批穩定性試驗作基礎；5)協作標定定值選擇3個以上具有對雞新城疫HI試驗富有經驗的實驗室，每個實驗室用3個樣品，每個樣品重復2次，同時用國際標準品做參比，各協作標定單位按照協作標定方案的要求進行標定；并將實驗結果交給組織單位進行整理后確定協作標定數值；通過協作標定結果，計算出ImL雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品的國際單位含量，以此作為國家標準品的確定值。
全文摘要
本發明涉及一種雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品及其制備方法。本發明所涉及的雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品是利用雞新城疫La Sota株病毒(NDV)和滅活疫苗免疫SPF雞制備高免血清作為候選物，通過候選物檢驗、標準品制備和檢驗、分裝、凍干等工藝過程，并以NIBSC獲得的雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國際標準品為參比進行紅細胞凝集抑制試驗測定其效價，經過均一性檢驗、穩定性試驗、協作標定，數據統計，保證效價定值準確而制備出雞新城疫血凝抑制試驗用陽性血清國家標準品。本發明的方法按照標準品制備程序使標準品制備更加科學、嚴謹、完善。
文檔編號G01N33/96GK102426258SQ20111035673
公開日2012年4月25日 申請日期2011年11月11日 優先權日2011年11月11日
發明者關孚時, 張秀英, 戴志紅, 李翠, 溫芳, 王在時, 蔣卉, 陸連壽 申請人:中國獸醫藥品監察所