專利名稱：固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法
技術領域：
本發明涉及牛奶中香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的檢測方法，具體涉及一種固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法。
背景技術：
近年來中國乳品行業發展迅猛，市場上存在品種和規格各式各樣的純牛奶。市場上這些乳品的奶源質量參差不齊，很多乳品企業為平衡季節造成的奶源供應短缺、奶源質量參差不齊、滿足消費者口味需求，在純牛奶產品中添加奶味香精等食品添加劑。而根據我國現行的乳品生產標準GBM08. 2-1999規定純牛奶，包括巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳，是以生鮮牛乳為原料、不得添加任何輔料、經過高溫瞬時滅菌、無菌罐裝而制成達到“商業無菌”要求的液態產品。目前，香蘭素、乙基香蘭素和香豆素是最重要的香料之一，用作粉底香料，幾乎用于所有香型。因此牛奶中香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的檢測對于評價牛奶中是否添加了食用添加劑是一個重要的指標。目前，香蘭素的檢測方法有高效液相色譜法、紫外光光度法、電化學法、毛細管電泳法、氣相色譜峰、氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法等，但目前并無牛奶中香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的同時檢測。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提供了一種固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，能夠對牛奶中香蘭素、乙基香蘭素和香豆素同時進行測定，該方法具有準確、快速、靈敏度高的優點，為牛奶的快速檢測提供了可靠的分析平臺。為了實現上述目的，本發明的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法包括以下步驟
①超聲萃取稱取牛奶1.7 2. 3g，加入0. 8 1. 5mL13C標記的香蘭素和0. 8 1. 5mL 5，6，7，8-D4標記的香豆素，所述"C標記的香蘭素的濃度為500 μ g/L，所述5，6，7，8-D4標記的香豆素的濃度為500 μ g/L,再加入17 23mL的甲醇/水混合溶液，在27 33°C下超聲處理25 35min，超聲頻率為36 38kHz，取出靜置，取上層清液，定容，得到待凈化液；
②固相萃取凈化取C18SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取4 6mL待凈化液至SPE 柱，再依次用4 6mL水和4 6mL甲醇/水混合溶液淋洗SPE柱，，將SPE柱真空抽干，用 8 12mL的甲醇/水混合溶液對SPE柱進行洗脫，得到洗脫液，將洗脫液過微孔濾膜，備用；
③標準溶液的配置取香蘭素，分別配置1.0,2. 0,5. 0,10. 0,20. 0濃度為50 μ g/L的混合標準工作溶液，取乙基香蘭素，分別配置1. 0,2. 0,5. OUO. 0、20. 0濃度為50 μ g/L的混合標準工作溶液，取香豆素，分別配置1. 0,2. 0,5. 0,10. 0,20. 0濃度為50 μ g/L的混合標準工作溶液，取13C標記的香蘭素，分別配置1. 0,2. 0,5. 0、10. 0,20. 0濃度為10 μ g/L的混合標準工作溶液，取5，6，7，8-D4標記的香豆素，分別配置1. 0,2. 0,5. 0、10. 0,20. 0濃度為 10 μ g/L的混合標準工作溶液；
③標準溶液的配置取香蘭素、乙基香蘭素、香豆素、1V標記的香蘭素和5，6，7，8-D4標記的香豆素，用甲醇/水混合溶液分別配制成質量濃度為100mg/L的單標儲備液，進行測定使用時，用甲醇/水混合溶液，甲醇/水混合溶液中甲醇與水的比例為1:1，稀釋上述標準儲備液，將香蘭素、乙基香蘭素、香豆素分別配制成1. 0，2. 0，5. 0，10. 0，20. 0，5(^g/L的混合標準工作溶液，同時將"C標記的香蘭素和5，6，7，8-D4標記的香豆素配制成1. 0，2. 0，5. 0， 10. 0,20.0,10μ§/1的混合標準工作溶液；
④測定將過0.45 μ m微孔濾膜厚的洗脫液進入LC-MS/MS，多反應監測模式檢測，即 MRM，并采用內標法定量。作為優選，所述的步驟①中的加入的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為 1:1。作為優選，所述的步驟②中的淋洗SPE柱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為2:8，洗脫所用的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為1:1。作為優選，所述的步驟②中微孔濾膜為0. 45 μ m微孔濾膜。作為優選，述的LC-MS/MS的色譜條件如下
色譜柱:ffaters XBridge C18 反相柱，規格為 2. 1X150 mm, 3. 5 μ m ； 流速300μ L/min ；
流動相A為0. 1%甲酸的水溶液，B為乙腈。A與B的體積比為55:45 ； 等度洗脫時間5min ； 進樣量:5μ L ； 色譜柱溫度25 35°C。作為優選，所述的LC-MS/MS的質譜條件如下 電噴霧離子源正離子掃描，電噴霧電壓為5000V ； 離子源溫度540 560°C ；
霧化氣壓力為47 53psi ； 輔助氣流速為38 42 psi ； 氣簾氣壓力為9 11 psi ； 碰撞氣壓力為18 22 psi。本發明的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法建立了高效液相色譜-電噴霧串聯四級桿質譜法同時測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的檢測方法，樣品用甲醇/水混合溶液超聲提取，提取溶液經C18固相萃取柱凈化，使用Cw反相柱分離；在等度條件下分析，目標分析物在多反應監測模式下以保留時間和離子對信息比較進行定性分析，內標法定量，本方法分析速度快、靈敏度高、 重現性好，為評價牛奶樣品質量提供了新的檢測方法。
圖1為本發明實施例香蘭素的二級質譜圖2為本發明實施例13C-標記香蘭素的二級質譜圖；圖3為本發明實施例乙基香蘭素的二級質譜圖； 圖4為本發明實施例香豆素的二級質譜圖； 圖5為本發明實施例5，6，7，8-D4標記香豆素的二級質譜圖； 圖6為本發明實施例香蘭素、乙基香蘭素和香豆素濃度為2 μ g/L的標準品的總離子流圖。
具體實施例方式本發明的實施例具體是一種固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，該方法包括以下步驟
①超聲萃取稱取牛奶2.Og,加入ImLuC標記的香蘭素和ImL 5，6，7，8-D4標記的香豆素，13C標記的香蘭素的濃度為500 μ g/L, 5，6，7，8-D4標記的香豆素的濃度為500 μ g/L,再加入20mL的甲醇/水混合溶液，加入的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為1:1。在 30°C下超聲處理30min，超聲頻率為37kHz，取出靜置，取上層清液，定容，得到待凈化液；
②固相萃取凈化取C18SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取5mL待凈化液至SPE柱， 再依次用5mL水和5mL甲醇/水混合溶液淋洗SPE柱，淋洗SPE柱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為2:8。再將SPE柱真空抽干，用8 12mL的甲醇/水混合溶液對 SPE柱進行洗脫，洗脫所用的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為1 1，得到洗脫液，將洗脫液過0. 45 μ m微孔濾膜，備用；
③標準溶液的配置取香蘭素，分別配置1.0,2. 0,5. 0,10. 0,20. 0濃度為50 μ g/L的混合標準工作溶液，取乙基香蘭素，分別配置1. 0,2. 0,5. 0,10. 0,20. 0濃度為50 μ g/L的混合標準工作溶液，取香豆素，分別配置1. 0,2. 0,5. 0、10. 0,20. 0濃度為50 μ g/L的混合標準工作溶液，取13C標記的香蘭素，分別配置1. 0,2. 0,5. 0、10. 0,20. 0濃度為10 μ g/L的混合標準工作溶液，取5，6，7，8-D4標記的香豆素，分別配置1. 0,2. 0,5. 0,10. 0,20. 0濃度為 10 μ g/L的混合標準工作溶液；
③標準溶液的配置取香蘭素、乙基香蘭素、香豆素、1V標記的香蘭素和5，6，7，8-D4標記的香豆素，用甲醇/水混合溶液分別配制成質量濃度為100mg/L的單標儲備液，進行測定使用時，用甲醇/水混合溶液，甲醇/水混合溶液中甲醇與水的比例為1:1，稀釋上述標準儲備液，將香蘭素、乙基香蘭素、香豆素分別配制成1. 0，2. 0，5. 0，10. 0，20. 0，5(^g/L的混合標準工作溶液，同時將"C標記的香蘭素和5，6，7，8-D4標記的香豆素配制成1. 0，2. 0，5. 0， 10. 0,20.0,10μ§/1的混合標準工作溶液；
④測定將過0.45 μ m微孔濾膜厚的洗脫液進入LC-MS/MS，多反應監測MRM模式檢測， 內標法定量。LC-MS/MS的色譜條件如下
色譜柱采用Waters XBridge C18反相柱，規格為2. 1 X 150 mm, 3. 5 μ m。流動相為=A 為0. 1%甲酸的水溶液，B為乙腈。A與B的體積比為55:45。等度洗脫時間為5 min。流速為300 yL/min;進樣量為5 yL，柱溫30°C。LC-MS/MS的質譜條件如下
電噴霧離子源正離子掃描；離子源溫度為550°C。電噴霧電壓為5000V ；霧化氣(GSl) 壓力50psi ；輔助氣流速(GS2) 40 psi ；氣簾氣壓力IOpsi ；碰撞氣CAD20psi。
6
本發明在進行色譜柱的選擇時，選用了不同廠家的C8和C18色譜柱，選用了 ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1X 150 mm, 3. 5 μ m ； ZORBAX Eclipse Plus C8 2. 1X 150 mm, 3. 5 ym ； Waters Symmetry column C18 2. 1X 150 mm, 3. 5 μ m ；Waters X BridgeTM C18 2. 1X 150 mm, 3.5 μ m進行實驗。結果表明，Waters XBridgeTM Cw反相柱能夠保證香蘭素、乙基香蘭素和香豆素良好的分離，且峰形尖銳，分析時間較短。進行流動相的選擇時，考察了甲醇/水、乙腈/水混合溶劑體系以及添加了 0. 1% 甲酸、0. 1%乙酸、5 mmoL/L乙酸銨、lOmmoL/L乙酸銨等溶液為流動相對香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的色譜行為和離子化程度的影響。發現采用0. 1%甲酸的水溶液/乙腈為流動相等度洗脫時，體積比為55 45，在;3min內即可完成香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的分離，獲得了最優的色譜分離效果和質譜信號響應，見圖6。提取溶劑的優化本實驗選用了甲醇/水混合溶液、乙醇/水混合溶液、乙醇和甲醇作為提取溶劑進行提取，其中甲醇/水中甲醇和水的比例為1 1，乙醇/水混合溶液中乙醇與水的比例為1:1，比較了各提取劑的提取效率。結果發現，以體積比為1:1的甲醇/水為提取溶劑的提取效果較好，能夠同時保證香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的回收率較高。固相萃取吸附劑的選擇，本發明采用不同廠家的C18 SPE柱，VARIAN BOND ELUT PLEXA C18, Supelclean Envi-18、Supelclean LC-18作為吸附劑的固相萃取凈化處理效果，比較了各固相萃取吸附劑的萃取效率。結果發現，對香蘭素、乙基香蘭素和香豆素而言， VARIAN BOND ELUT PLEXA C18 SPE柱的凈化處理效果較好，其加標回收率結果基本都能滿足要求。本發明實施例中，香蘭素和乙基香蘭素購自ChromaDex公司，純度彡97%，13C-標記的香蘭素即 HOC6H3 (OCH3) *CH0 購自 Cambridge Isotope Laboratories, he 公司，純度彡97%,香豆素和5，6，7，8-D4標記的香豆素購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，純度彡98%。 使用時，用甲醇/水混合溶液配制成質量濃度為100mg/L的儲備液；實用的甲醇/水混合溶液的體積比為1:1。⑤結果及分析 (1)質譜分析參數見表1
表1香蘭素、乙基香蘭素、香豆素、香蘭素內標和香豆素內標的質譜分析參數
權利要求
1.一種固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于該方法包括以下步驟①超聲萃取稱取牛奶1.7 2. 3g，加入0. 8 1. 5mL13C標記的香蘭素和0. 8 1. 5mL 5，6，7，8-D4標記的香豆素，所述"C標記的香蘭素的濃度為500 μ g/L，所述5，6，7，8-D4標記的香豆素的濃度為500 μ g/L,再加入17 23mL的甲醇/水混合溶液，在27 33°C下超聲處理25 35min，超聲頻率為36 38kHz，取出靜置，取上層清液，定容，得到待凈化液；②固相萃取凈化取VARIANBOND ELUT PLEXA C18SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱， 取4 6mL待凈化液至SPE柱，再依次用4 6mL水和4 6mL甲醇/水混合溶液淋洗SPE 柱，，將SPE柱真空抽干，用8 12mL的甲醇/水混合溶液對SPE柱進行洗脫，得到洗脫液， 將洗脫液過微孔濾膜，備用；③標準溶液的配置取香蘭素、乙基香蘭素、香豆素、1V標記的香蘭素和5，6，7，8-D4標記的香豆素，用甲醇/水混合溶液分別配制成質量濃度為100mg/L的單標儲備液，進行測定使用時，用甲醇/水混合溶液，甲醇/水混合溶液中甲醇與水的比例為1:1，稀釋上述標準儲備液，將香蘭素、乙基香蘭素、香豆素分別配制成1. 0，2. 0，5. 0，10. 0，20. 0，5(^g/L的混合標準工作溶液，同時將"C標記的香蘭素和5，6，7，8-D4標記的香豆素配制成1. 0，2. 0，5. 0， 10. 0,20.0,10μ§/1的混合標準工作溶液；④測定將過0.45 μ m微孔濾膜厚的洗脫液進入LC-MS/MS，采用多反應監測(MRM)模式檢測，內標法定量。
2.根據權利要求1所述的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于所述的步驟①中的加入的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為1:1。
3.根據權利要求1所述的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于所述的步驟②中的淋洗SPE柱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為2:8，洗脫所用的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為 1:1。
4.根據權利要求1所述的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于所述的步驟②中微孔濾膜為0. 45 μ m微孔濾膜。
5.根據權利要求1所述的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于所述的LC-MS/MS的色譜條件如下色譜柱=Waters XBridge C18反相柱，色譜柱規格為2. 1X150 mm, 3. 5 μ m ；流速300μ L/min ；流動相A為0. 1%甲酸的水溶液，B為乙腈，A與B的體積比為55:45 ；等度洗脫時間5min ；進樣量:5μ L ；色譜柱溫度25 35°C。
6.根據權利要求1所述的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于所述的LC-MS/MS的質譜條件如下電噴霧離子源正離子掃描，電噴霧電壓為5000V ；離子源溫度540 --560 0C ；霧化氣壓力為47〃 53psi ；輔助氣流速為38廣 42 psi ；氣簾氣壓力為9 ‘11 psi ；碰撞氣壓力為18- 22 psi。
全文摘要
本發明公開了一種固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，建立了高效液相色譜-電噴霧串聯四級桿質譜法同時測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的檢測方法。本發明的方法能夠同時測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素和香豆素，樣品用甲醇/水混合溶液超聲提取，提取溶液經C18固相萃取柱凈化，使用C18反相柱分離；在等度條件下分析，目標分析物在多反應監測模式下以保留時間和離子對信息比較進行定性分析，內標法定量，本方法分析速度快、靈敏度高、重現性好，為評價牛奶樣品質量提供了新的檢測方法。
文檔編號G01N30/89GK102507833SQ201110350198
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者劉濱, 劉翠平, 朱振甌, 陳祥準, 韓超 申請人:韓超