專利名稱：鑒別從人或動物生物體液中富集的非血源性有核細胞的方法
技術領域：
本發明主要涉及使用同步免疫熒光原位雜交技術鑒定從人或動物生物體液中富集的惡性上皮來源(實體腫瘤)或非上皮來源(黑色素瘤)的腫瘤細胞。
背景技術：
提取并檢測人生物體液(胸水或胸腔積液，腹水或腹腔積液，腦脊液，淋巴液及/或血液等)中的惡性上皮細胞(腫瘤細胞)的巨大現實及潛在的臨床意義早已被人們所證實。在許多采集的人的生物體液樣本中，常常混有大量的紅細胞及白細胞.從而對實驗操作及結果的判別造成極大干擾.目前臨床或醫學實驗中通用的去除紅細胞的方法是使用低滲裂解法裂解去除紅細胞.然而在低滲裂解過程中，伴隨著紅細胞的裂縫，許多惡性上皮細胞(腫瘤細胞)也受到了一定程度的損害，使細胞形態與特性發生改變，從而影響對這類細胞的正確判別。突光原位雜交(Fluorescencein situ Hybridization,FISH)技術用于病理組織中的腫瘤細胞檢測已有廣泛報道。其中一項主要技術應用即為使用熒光標記的染色體著絲粒特異探針對體液中處于間期的腫瘤細胞進行染色體數目的識別(正常細胞染色體為二倍體)，以發現存在于腫瘤細胞內的非二倍體染色體，即超二倍體或多倍體染色體，從而達到識別腫瘤細胞的目的。FISH方法以往已被較多地使用在血液病腫瘤的診斷中，但用于檢測體液包括血液中的實體瘤細胞(非血液病腫瘤)的報道卻極為罕見。應用FISH方法從血標本中檢測腫瘤細胞最常見的問題就是如何區分血緣性非正常染色體數目的細胞，這類細胞可見于血小板增生引起的血中某些白細胞染色體數目異常，或人體內自然形成的某些少量白細胞染色體數目異常，以及染色體探針非特異著色引起的血細胞假陽性染色體數目異常。所以在進行FISH識別判斷血液中的非血緣性實體瘤細胞時，有效區分血緣性與非血緣性細胞具有極其重要的意義。然而這方面的研究還沒有任何報道。除此之外，雖然個別文章報道了基于腫瘤上皮細胞染色基礎之上的非同步FISH方法用于檢測血中的循環腫瘤細胞，即FISH與抗腫瘤細胞標識物抗體染色非同步交替進行，但考慮到大量脫落的實體瘤腫瘤細胞在液體環境中因生長環境發生了徹底改變而喪失了腫瘤上皮細胞的特性，而直接影響對腫瘤細胞的抗體免疫染色，從而造成大量假陰性，所以不具備任何臨床使用價值。由于上述原因，本發明將基于利用一種密度分離劑(即細胞分離介質)的組合物的離心方法用于將人的生物體液中的紅細胞與惡性上皮細胞及其它有核細胞進行快速有效的分離，在無融破裂解紅細胞實驗步驟的情況下取得了令人意料不到的實驗結果，證明利用此組合物能夠快速、高效地將人的體液樣品中的絕大部分紅細胞及血漿蛋白質與體液標本中的其它有核細胞包括腫瘤細胞進行有效分離，不會對人的體液內的靶細胞(如體液中的腫瘤細胞)產生任何影響，從而很好地保持了原有的細胞形態，以極大地便于后續的細胞識別與判斷。在使用免疫磁珠去除白細胞后，能夠快速富集并提取生物體液中的非血源性惡性上皮細胞(腫瘤細胞)及血管內皮細胞等。在后續使用FISH方法進行鑒別非血源性惡性上皮細胞時，同步使用抗人白細胞表面抗原的抗體進行免疫熒光染色以排除任何血源性細胞的干擾，從而對人的生物體液樣本中富集的非血源性惡性腫瘤細胞進行快速、準確的鑒別。
發明內容
本發明涉及一種鑒別從人或動物生物體液中富集的非血源性惡性有核細胞的方法，其中同步實施抗人或動物白細胞抗體免疫熒光染色以及染色體熒光原位雜交以區別血源性有核細胞。非血源性惡性有核細胞例如是腫瘤細胞或血管上皮細胞。用于所述免疫熒光染色的抗人或動物白細胞抗體特異性地識別下述人的白細胞表面標示物的一種或多種的抗原:⑶3、⑶31、⑶34、⑶45、⑶50、⑶69、⑶84、或⑶102。用于所述染色體熒光原位雜交的熒光標記的探針或探針組合群可特異性地識別人或動物的任何一個或多個染色體。本發明還涉及一種用于從人的生物體液中將紅細胞與非血源性有核細胞如腫瘤細胞，血管上皮細胞等進行快速有效分離的方法，其中所述方法無需融破裂解紅細胞的步驟，其中利用一種細胞分離介質來進行分離，所述細胞分離介質在20°C下的比重為1.07156 1.07738克/毫升，所述細胞分離介質包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份:聚乙烯卩比咯燒酮包被的膠質二氧化娃(polyvinylpyrrolidine coatedcolloidal silica);多聚糖(polysucrose);泛影酸鈉(sodium diatrizoate)或其衍生物；由蔗糖和表氯醇構成的非離子聚合物；或任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物，如甲泛影酰胺(metrizamide);或任意蛋白溶液。本發明的新的細胞分離介質的使用可極大地縮短離心時間，并將細胞回收率從原有的60 ± 20 %穩定地提高到95% -100%。本發明還涉及一種用于從人的生物體液中富集非血源性惡性有核細胞的方法，其中所述方法無需融破裂解紅細胞的步驟，該方法包括離心以去除血漿蛋白；將離心后的上清液置于細胞分離介質頂層再次進行離心，取上清液，加入抗白細胞抗體偶聯的免疫磁珠進行孵育后吸附磁珠，離心以富集細胞沉淀。本發明還涉及一種從人或動物生物體液中富集非血源性有核細胞并對其進行鑒別的方法，包括:離心以去除血漿蛋白；將離心后的上清液置于細胞分離介質頂層再次進行離心，取上清液，加入抗白細胞抗體偶聯的免疫磁珠進行孵育后吸附磁珠，離心，取富集的細胞沉淀，其中對該富集的細胞沉淀同步實施抗人或動物白細胞抗體免疫熒光染色以及染色體熒光原位雜交來區別血源性有核細胞。人或動物的生物體液包括但并不限于胸水或胸腔積液，腹水或腹腔積液，腦脊液，淋巴液及/或血液。人或動物生物體液內的非血源性有核細胞選自由以下組成的組:具有上皮來源的任何實體瘤細胞、或不具有上皮來源的任何腫瘤細胞，循環的血管內皮細胞和腫瘤干細胞。非血緣性有核細胞來自人的所有上皮來源的實體瘤細胞，包括但不局限于胰腺癌、肺癌、宮頸癌、食管癌、結直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來源的腫瘤細胞，如黑色素瘤。相對于目前市場上通用的商品化紅細胞裂解液而言，本發明的細胞分離介質的使用僅針對人或病人，在不影響所有細胞形態與特性基礎上可快速完成與紅細胞的分離，并將靶細胞的回收率從原有的60±20%穩定地提高到95%以上。該細胞分離介質與去除白細胞試劑手段及同步免疫-FISH方法相結合，在免除融破紅細胞實驗步驟的前提下，可以有效地快速富集提取并準確鑒定人或動物生物體液中的非血緣性有核細胞，如腫瘤上皮細胞等，對腫瘤的早期診斷，惡性胸、腹水的判別，腦脊液中神經腫瘤細胞(如神經膠質瘤)的判別，抗腫瘤新藥及治療心血管疾病新藥的研發等方面，都具有極大的現實與潛在的臨床意義。
具體實施例方式本發明一方面提供了利用一種密度分離劑(即細胞分離介質)將人的生物體液中的紅細胞與惡性上皮細胞及其它有核細胞進行快速有效分離的方法。另一方面，本發明還提供了一種獨特地使用同步免疫-熒光原位雜交技術用于快速、準確地鑒別從人或動物生物體液中富集的非血緣性有核細胞，如腫瘤細胞的方法，其中該方法將抗人或動物白細胞表面抗原的免疫熒光抗體染色與FISH相結合，同步染色。在一個具體實施例中，所述細胞分離介質在20°C下的比重為1.07156 1.07738克/毫升，所述細胞分離介質包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份:聚乙烯卩比咯燒酮包被的膠質二氧化娃(polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica)；多聚糖(polysucrose);泛影酸鈉(sodium diatrizoate)或其衍生物；由鹿糖和表氯醇構成的非離子聚合物；或任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物，如甲泛影酰胺(metrizamide);或任意蛋白溶液。優選地，所述細胞分離介質在20°C下的比重為
1.07224 1.07568 克 / 毫升。在優選實施例中，用于免疫熒光染色的單克隆抗體特異性地識別下述人或動物白細胞表面標示物的一種或多種的抗原:⑶3、⑶31、⑶34、⑶45、⑶50，⑶69、⑶84、或⑶102。用于所述染色體熒光原位雜交的熒光標記的探針或探針組合群可特異性地識別人或動物的任何一個或多個染色體。在優選實施例中，所述體液中的非血緣性有核細胞選自:人或動物的生物體液中具有上皮來源的任何實體瘤細胞(惡性上皮細胞)、或不具有上皮來源的任何腫瘤細胞，循環的血管內皮細胞，腫瘤干細胞。在優選實施例中，腫瘤細胞選自具有上皮來源的實體瘤細胞例如肺癌、宮頸癌、食管癌、結直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來源的腫瘤細胞，如黑色素瘤等。在優選實施例中,所述體液中的非血緣性有核(稀有)細胞選自:體液中具有上皮來源的任何實體瘤細胞、或不具有上皮來源的任何實體瘤細胞，循環的血管內皮細胞，腫瘤干細胞，干細胞，以及免疫細胞。名詞解釋人生物體液中的血緣性有核細胞:指白細胞，包括淋巴細胞(T細胞、B細胞等);嗜中性粒細胞；嗜酸性粒細胞；嗜堿性粒細胞等。生物體液:包括但不限于胸水或胸腔積液，腹水或腹腔積液，腦脊液，淋巴液及/或血液等。人或動物生物體液中的非血緣性有核細胞:主要指在人或動物的生物體液中具有上皮來源的或不具有上皮來源的腫瘤細胞和循環的血管內皮細胞；腫瘤干細胞，干細胞，血中胎兒細胞，某些免疫細胞等稀有細胞。本發明主要用于從人或動物生物體液中將人的生物體液中的紅細胞與惡性上皮細胞及其它有核細胞進行快速有效的分離，并使用同步免疫-熒光原位雜交技術將抗人或動物白細胞表面抗原的免疫熒光抗體染色與FISH相結合，以用于快速、準確地鑒別從人或動物生物體液中富集的非血緣性有核細胞，如腫瘤細胞等。采用本發明用于富集生物體液樣品中非血緣性有核細胞的方法的主要步驟包括:離心以收集或去除血漿蛋白；將血液置于細胞分離介質頂層進行離心取上清，加抗白細胞抗體偶聯的免疫磁珠孵育后吸附磁珠離心，取富集的細胞沉淀。將該富集的細胞沉淀涂片用于后續的鑒別。本發明的鑒別從生物體液中富集的非血緣性有核細胞，如腫瘤細胞的方法包括:同步FISH+抗人或動物白細胞抗體染色，其中特殊單克隆抗體指的是抗下述人或動物任意一個或幾個CD的抗體組合:CD3、CD31、CD34、CD45、CD50, CD69、CD84、或 CD102 ；在本發明的組合物中，細胞分離介質的比重為1.07156 1.07738克/毫升(gr/ml或gr/cm3)。所述細胞分離介質包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份:聚乙烯卩比咯燒酮包被的膠質二氧化娃(polyvinylpyrrolidine coated colloidalsilica);多聚糖(polysucrose);泛影酸鈉(sodium diatrizoate)或其衍生物;由蔗糖和表氯醇構成的非離子聚合物；或任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物，如甲泛影酰胺(metrizamide);或任意蛋白溶液。細胞分離介質的比重可用任何滲透壓介于260 320m0sm/kg H20、pH 6.8 7.8的緩沖液調制而成。實施例利用本發明從病人生物體液(血液或胸水等)中快速富集并鑒別非血緣性惡性上皮細胞將采集的7.5毫升抗凝血室溫離心5分鐘(700xg)。去掉上清血漿后，將血液加入到10毫升細胞分離介質頂層，室溫離心5分鐘(500xg)以分離紅細胞。收集上層有核細胞，加入0.5毫升包被有人白細胞表面抗原的單克隆抗體的磁珠后室溫孵育60分鐘。使用磁力架去除磁珠。收集上清去，室溫離心3分鐘(1200xg)。得到的沉積細胞即富集的非血緣性有核細胞涂片。后續鑒定實驗使用CEP-7，CEP-8人染色體探針+抗人白細胞抗體進行同步染色。FISH信號異常但抗人白細胞抗體染色不著色的細胞可判斷為體液中非血源性惡性腫瘤細胞。具體地，在本發明的組合物中，所述獨特的細胞分離介質在20°C溫度下比重范圍優選介于1.07260 1.07650克/毫升(gr/ml或gr/cm3),這一特定范圍內的密度適于將幾乎所有有核細胞與紅細胞及免疫微球或免疫顆粒進行分離。所述細胞分離介質包含下列任何一種或任意兩種或兩種以上的試劑成份:聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質二氧化硅；多聚糖；泛影酸鈉或其衍生物；由蔗糖和表氯醇構成的非離子聚合物；或任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(metrizamide);或任意蛋白溶液。所述細胞分離介質的比重可用任何滲透壓介于285 315mOsm/kg H20、pH 6.8 7.8的緩沖液在20°C溫度下調制在1.07260 1.07650克/毫升范圍內。所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細胞分離介質的比重。基于所述細胞分離介質的離心在普通的商品化的離心管內進行。在本發明中，用于抗人或動物白細胞抗體染色的單克隆抗體可特異性地識別下述但不局限于這些白細胞表面標示物中的一種或多種:⑶3，⑶31，⑶34，⑶45，⑶50，⑶69，CD84，或 CD102 等。本領域的技術人員應當明了，上述優選實施例只是對本發明的具體說明，并不構成對本發明的限制。根據需要可以對其進行多種改進，組合，亞組合以及變換，所有的改進，組合，亞組合、變換以及等效替換都落入在所附的權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種鑒別從人或動物生物體液中富集的非血源性有核細胞的方法，其中同步實施抗人或動物白細胞抗體免疫熒光染色以及染色體熒光原位雜交以區別血源性有核細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其中用于所述免疫熒光染色的抗人或動物白細胞抗體特異性地識別下述人或動物的白細胞表面標示物的一種或多種的抗原:⑶3、⑶31、⑶34、CD45、CD50、CD69、CD84、或 CD102。
3.根據權利要求1所述的方法，其中用于所述染色體熒光原位雜交的熒光標記的探針或探針組合群可特異性地識別人或動物的任何一個或多個染色體。
4.一種用于從人的生物體液中將紅細胞與非血源性有核細胞進行快速有效分離的方法，其中所述方法無需融破裂解紅細胞的步驟，其中利用一種細胞分離介質來進行分離，所述細胞分離介質在20°C下的比重為1.07156 1.07738克/毫升，所述細胞分離介質包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份:聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質二氧化硅(polyvinylpyrroIidine coated colloidal silica);泛影酸鈉(sodium diatrizoate)或其衍生物；由蔗糖和表氯醇構成的非離子聚合物；或任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷、蔗糖或多聚糖(polysucrose);碘化小分子化合物,如甲泛影酰胺(metrizamide);或任意蛋白溶液。
5.一種用于從人的生物體液中富集非血源性有核細胞的方法，其中所述方法無需融破裂解紅細胞的步驟，該方法包括 離心以收集或去除血漿蛋白； 將離心后的上清液置于細胞分離介質頂層再次進行離心， 取上清液，加入抗白細胞抗體偶聯的免疫磁珠進行孵育后吸附磁珠， 離心以富集細胞沉淀。
6.一種從人或動物的生物體液中富集非血源性有核細胞并對其進行鑒別的方法，包括: 離心以去除血漿蛋白； 將離心后的上清液置于細胞分離介質頂層再次進行離心， 取上清液，加入抗白細胞抗體偶聯的免疫磁珠進行孵育后吸附磁珠， 離心，取富集的細胞沉淀， 其中對該富集的細胞沉淀同步實施抗人或動物白細胞抗體免疫熒光染色以及染色體熒光原位雜交來區別血源性有核細胞。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中，人或動物的生物體液包括胸水或胸腔積液、腹水或腹腔積液、腦脊液、淋巴液和/或血液。
8.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中，所述人或動物生物體液內的非血源性有核細胞選自由以下組成的組:具有上皮來源的任何實體瘤細胞、或不具有上皮來源的任何腫瘤細胞，循環的血管內皮細胞和腫瘤干細胞。
9.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中，所述非血緣性有核細胞來自人或動物的所有上皮來源的實體瘤細胞，包括胰腺癌、肺癌、宮頸癌、食管癌、結直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來源的腫瘤細胞，如黑色素瘤。
10.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中，所述非血緣性有核細胞包括腫瘤細胞和血管內皮細胞。
全文摘要
本發明提供了一種用于從人的生物體液中將紅細胞與非血源性有核細胞進行快速有效分離的方法，該方法不需裂解融破紅細胞，不會對人的體液內的靶細胞(如體液中的腫瘤細胞)產生任何影響，從而很好地保持了原有的細胞形態，極為便于后續的細胞識別與判斷。本發明還涉及一種鑒別從人或動物生物體液中富集的非血源性有核細胞(如腫瘤細胞，血管上皮細胞等)的方法，其中同步實施抗人白細胞抗體免疫熒光染色以及染色體熒光原位雜交以區別血源性有核細胞，以有效去除在判斷腫瘤細胞過程中血源性細胞產生的干擾，從而達到高效快速地從人體液中富集提取并有效鑒別非血源性上皮來源(實體瘤)或非上皮來源(黑色素瘤)的稀有腫瘤細胞。
文檔編號G01N33/577GK103091491SQ20111034054
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者李彥萍 申請人:李彥萍