專利名稱：檢測組織或細胞中可溶性表氧化物水解酶活性的試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑，具體地涉及一種用于檢測可溶性表氧化物水解酶活性的試劑，該試劑通過熒光檢測可以測定細胞或組織中可溶性表氧化物水解酶活性。
背景技術：
可溶性表氧化物水解酶(Soluble epoxide hydrolase, sEH,又稱EPXH2)廣泛存在于哺乳動物中，在肝臟、腎臟、肺、心臟、腦、脾臟、血管內皮和平滑肌等多個組織器官中都有分布；sHl蛋白是由兩個大小為62kD的單體組成的同源二聚體，每個單體的N端和C端具有不同的酶活性，N端具有磷酸酶活性，C端具有表氧化物水解酶的活性，可以水解表氧化脂肪酸或其它表氧化物，將其轉化為相應二醇，從而降低表氧化物的化學反應性，增加其水溶性，改變它們的生物活性(Newman Jff7Prog Lipid Res，2005 ;44 :1-5)。sHl的C端活性在多種疾病過程中發揮著關鍵的調節作用，抑制其活性可以降低血管緊張素2所導致的高血壓(Imig JD, Hypertension, 2002 ;39 :690-94)、心肌肥大(Ai D, Proc Natl Acad Sci USA, 2009 ;106 :564-69)、動脈粥樣硬化(Ulu A, J Cardiovasc Pharmacol, 2008 ；52 :314-23) 等，因而測定細胞及組織中的sHl活性對于相關疾病的研究及藥物的開發具有至關重要的作用。目前測定sEHC端活性的方法主要有以下幾種通過LC/MS/MS或ELISA的方法檢測體液、尿液、血液、細胞裂解液或上清及組織勻漿中的sEH內源性底物EETs與產物 DHETs 的比例來反映 sEH 的活性(Nithipatikom K, Analytical Biochemistry, 2001 ;298， 327-336, Newman Jff, Prog Lipid Res，2002 ;43，1563-78);或將細胞裂解液與 EETs 或放射性標記的sHl底物孵育，檢測產物生成量從而測定sHl的活性(Liu Y,Proc Natl Acad Sci USA，2005 ; 102，16747-52，Ai D, Proc Natl Acad Sci USA，2009 ; 106 :564-69)。這些方法中EETs及DHETs不穩定，極易氧化和降解且含量較低，對于實驗條件和儀器設備要求高，而使用放射性物質，易造成污染或對人體傷害，因而限制了其應用。Nicola M. Wolf等人報道可以使用PHOME等化合物作為sHl的底物，高通量地評估 sEH 抑制劑的效果(WolfNM, Analytical Biochemistry, 2006 ；355 :71-80) 這類化合物被 sEH作用后的產物可以被激發出熒光，而化合物本身并不能被激發熒光，但此方法只被用于體外檢測重組純化sEH的活性。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測組織或細胞中可溶性表氧化物水解酶活性的試劑。本發明的又一目的在于提供一種制備上述試劑的方法。為實現上述目的，本發明提供的檢測組織或細胞中可溶性表氧化物水解酶活性的試劑，由裂解液、檢測緩沖溶液、檢測底物溶液和Sffi抑制劑溶液組成；通過下述方法制備得到裂解液包括低滲溶液和苯甲基磺酰氟溶液，其中
低滲溶液可以采用去離子水，也可以是如下配制的低滲溶液將三羥甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化鎂15-25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸 35-40毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，調節pH至7. 0-7. 5，水定容至IOOml ；本發明優選的低滲溶液是去離子水。苯甲基磺酰氟溶液將苯甲基磺酰氟溶于異丙醇中，濃度為IOOmM ；苯甲基磺酰氟溶液與低滲溶液的體積比為1/1000 1/100 ；檢測緩沖溶液將三羥甲基氨基甲烷溶解至水中，濃度為50禮，調節pH至
6.8-7. 3，加入牛血清白蛋白溶解，牛血清白蛋白的加入量為O. 1-0. 3mg/ml ；檢測底物溶液將Epoxy Fluor 7溶解至二甲基亞砜中配成5mM的溶液；sHl抑制劑溶液將sHl抑制劑溶解至二甲基亞砜中，配成IOmM的溶液。本發明提供的制備上述試劑的方法，其主要包括I)制備裂解液，所述裂解液包括低滲溶液和苯甲基磺酰氟溶液低滲溶液可以采用去離子水，也可以是如下配制的低滲溶液將三羥甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化鎂15-25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸 35-40毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，調節pH至7. 0-7. 5，水定容至100ml，存放于 4。。；本發明優選的低滲溶液是去離子水；2)苯甲基磺酰氟溶液將苯甲基磺酰氟溶于異丙醇中，濃度為lOOmM，存放于-20°C至 4°C ；苯甲基磺酰氟溶液與低滲溶液的體積比為1/1000 1/100 ；3)檢測緩沖溶液將三羥甲基氨基甲烷溶解至水中，濃度為50mM，調節pH至
6.8-7. 3，加入牛血清白蛋白溶解，牛血清白蛋白的加入量為O. 1-0. 3mg/ml，存放于4°C ；4)檢測底物溶液將Epoxy Fluor 7溶解至二甲基亞砜中配成5mM的溶液，存放于-20。。；5) sHl抑制劑溶液將sHl抑制劑溶解至二甲基亞砜中，配成IOmM的溶液，存放于-20 0C ο所述的sE；H抑制劑為12-(3-金剛燒-I-基-服基)_正十二燒酸[12-(3_adama ntan-l-yl-ureido) -dodecanoic acid, AUDA]、反式 _4-[4-(3_ 金剛燒-I-基-服基)-環己氧基]-苯甲酸{trans-4- [4- (3-Adamantan-l-yl-ureido) -cyclohexyloxy] -benzoic acid、t-AUCB}或1-(1-甲磺酰哌唳_4_基)-3-(4-三氟甲氧基苯基)-尿素[l-(l_methy lsulfonyl-piperidin-4-yl)-3-(4-trifluoromethoxy-phenyl)-urea, TUP S]。本發明的優點是I)利用該試劑的檢測方法快速，簡便易行，可以進行高通量檢測。樣本處理方法簡單，除裂解液不同外，其它與普通蛋白提取方法無異，反應過程為酶促反應，無高難度技術， 可操作性強；操作中所使用試劑為無毒或低毒物品，不存在放射性，不會造成污染及對操作者的傷害；樣本處理之后整個反應過程用時不超過I小時，檢測快捷；使用96孔板，一次可檢測40多個樣本，方便大樣本檢測，且樣品用量少。2)實現了組織特異的sEH活性檢測。以往的檢測方法多是檢測純品sEH活性，或通過檢測EETs與DHETs的比值，間接反映sHl的活性，但EETs或DHETs都不穩定，在樣本保存和提取過程中，容易被氧化降解，使方法準確性降低。而本方法則可直接檢測組織中sEH 的活性，對于藥物的研發和sEH在不同疾病模型中的作用評估提供了更為便捷的條件。
圖I是小鼠肝臟和腎臟sEH活性測定加樣示意圖；圖中的標記說明如下 空白對照； 肝臟裂解上清；·肝臟裂解上清+sEH抑制劑；@腎臟裂解上清； 腎臟裂解上清+sEH抑制劑。圖2是小鼠肝臟sEH活性-反應時間曲線；圖3是小鼠腎臟sEH活性-反應時間曲線；圖4是sEH抑制劑tAUCB飲水給藥對小鼠肝臟sEH活性的抑制效果；圖5是sHl抑制劑tAUCB飲水給藥對小鼠腎臟sEH活性的抑制效果；圖6是HEK293細胞sHl活性測定加樣示意圖；圖中的標記說明如下 空白對照；_細胞裂解上清；·細胞裂解上清+sEH抑制劑；圖7是HEK293細胞sHl活性-反應時間曲線； 圖8是sHl抑制劑tAUCB對HEK293細胞中sHl活性的抑制效果；圖9是HEK293細胞過表達sHl后活性測定結果。
具體實施例方式本發明通過檢測組織或細胞中可溶性表氧化物水解酶活性的試劑而建立一種穩定可靠、簡便易行的檢測細胞和組織中sHl活性的方法。利用該試劑的方法基本原理是將細胞用低滲溶液通過低滲裂解，或組織通過勻漿器勻漿，離心，去除細胞及組織碎片，裂解液進行蛋白定量，取同等量的蛋白在96孔板的孔中與一種表氧化物Epoxy fluor 7反應，Epoxy fluor 7可以作為sHl底物，被sHl水解后，通過熒光酶標儀在330nm 的波長下被激發出熒光，在465nm處可以檢測到熒光強度，通過該強度來判斷此酶促反應的速率，體現sEH的酶活性高低。該檢測試劑的制備如下I、溶液配制I)裂解液低滲溶液+苯甲基磺酰氟(PMSF)低滲溶液是將三羥甲基氨基甲烷(Tris) 55-65毫克、氯化鎂(MgCl2) 15-25毫克、 乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA) 35-40毫克、乙二胺四乙酸(EDTA) 3_5毫克溶解于水中，調節pH至7. 0-7. 5，水定容至IOOml ；低滲溶液也可以直接用去離子水。2)檢測緩沖液50mM Tris中按O. 2mg/ml加入牛血清白蛋白(BSA), pH = 6. 8-7. 3，存放于 4°C ；3)檢測底物Epoxy Fluor 7溶于二甲基亞砜(DMSO)中配成5mM的儲存液，存放于-20。。；4) sHl 抑制劑12-(3-金剛烷-I-基-脲基)_ 正十二烷酸[12-(3-adamantan-1-yl-ureido) -dodecanoic acid, AUDA]、反式 _4-[4-(3_ 金剛燒-I-基-服基)-環己氧基]-苯甲酸{trans-4-[4- (3-Adamantan-l-yl-ureido) -cyclohexyloxy] -benzoic acid、 t-AUCB}或1-(1-甲磺酰哌唳-4-基)-3-(4-三氟甲氧基苯基)-尿素[I-(1-methylsulf onyl-piperidin-4-yl) -3-(4-trifluoromethoxy-phenyl) -urea, TUP S]溶于 DMSO 中配成 IOmM的儲存液，存放于_20°C2、樣本處理I)細胞樣本6孔板、12孔板或24孔板細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，吸凈 PBS,加入200-100ul裂解液，冰上靜置20分鐘，讓細胞由于處于低滲環境吸水脹裂，隨后將細胞刮下，收集到EP管中，用271/4G注射器針頭反復抽吸15次，使胞漿蛋白充分釋放入裂解液。2)組織樣本取約10-15ug組織，加入200ul裂解液，通過勻漿器勻漿，將勻漿液收集到EP管中。細胞裂解液或組織勻漿液4°C，12000RCF離心lOmin，取上清至新EP管中，BCA蛋
白定量。3、檢測過程I)抑制劑孵育將每個樣品分為兩份，一份為純樣品組，一份為sEH抑制組。sEH抑制劑工作液配制sHl抑制劑用去離子水稀釋至200uM ;取同等量的去離子水，加入與抑制劑溶液相同體積的DMS0，配制成對照溶液。分別取IOul sHl抑制劑工作液和對照溶液加入至costar 96孔黑色酶標板相應的孔中；取50或IOOug細胞或組織蛋白分別加入至加有sHl抑制劑或對照溶液的孔中， 用裂解液補足總體積至lOOul，震蕩混勻，30°C孵育lOmin。用檢測緩沖液稀釋檢測底物至 80uM，取IOOul加入costar 96孔黑色酶標板相應的樣品孔中，震蕩混勻，讀取熒光強度。檢測條件突光酶標儀，激發波長330nm,發射波長465nm,縫寬20nm,溫度設定 300C，頂部檢測。每5分鐘讀值一次，共30分鐘。或在30°C孵育30分鐘，讀取熒光強度。3)酶活性的表示方法酶活性最終以相對熒光強度表示，即以純樣品孔的熒光強度值減去相應的sEH抑制孔的熒光強度值。根據不同時間點的相對熒光值繪制出反應曲線或柱狀圖。以下結合附圖和實施例對本發明利用該試劑檢測組織或細胞中可溶性表氧化物水解酶活性的效果作進一步的描述。實施例II、溶液配制I)裂解液 5ml :去離子水 4. 95ml+100mM PMSF50ul ；2)檢測緩沖液50mM Tris+0. 2mg/ml BSA, pH 7. 0，存放于 4°C ；3)檢測底物Epoxy Fluor 7溶于DMSO中配成5mM的儲存液，存放于_20°C ；4) sEH抑制劑t-AUCB溶于DMSO中配成IOmM的儲存液，存放于_20°C ；2、樣本l)sHl抑制劑tAUCB溶于PEG400中，配成4mg/ml的溶液。8周大C57BL/6小鼠11 只，隨機分成兩組，一組6只，給予sHl抑制劑tAUCB加入到飲水中，使濃度為20mg/L，另一組5只，加入相同體積的溶劑PEG400至飲水中。小鼠自由飲食、飲水。
2)給藥4天后，將小鼠麻醉，右心室取血后，自左心室使用生理鹽水灌流，之后取肝臟和腎臟組織，液氮速凍，之后凍于-80°C，用于后續實驗分析。分別取適量肝臟或腎臟組織，加入裂解液200ul，玻璃勻漿器冰上勻漿。之后將組織勻漿轉移至I. 5mlEP管中，使用 Eppendorf離心機,4°C, 12000RCF離心IOmin,吸取上清至新的EP管中。3)使用BCA定量法，對組織勻漿上清進行蛋白定量。3、檢測I)將DMSO溶解的IOmM的sHl抑制劑tAUCB取IOul溶解至490ul的去離子水中， 配成200uM的抑制劑溶液。再取IOul DMSO溶解至490ul去離子水中，配成對照溶液。2)取96孔黑色酶標板，在相應的孔中分別加入IOul對照溶液或10ul200uM的sHl 抑制劑。計算組織勻漿上清的蛋白濃度，取IOOug蛋白分別加入至對照溶液和sHl抑制劑孔中，用裂解液補足總體積至lOOul，吹吸混勻每個孔中的溶液。空白對照孔加入IOul對照溶液和90ul裂解液，混勻。30°C孵育10分鐘。3)熒光酶標儀設置激發波長330nm，發射波長465nm，縫寬20nm，溫度設定30°C， 頂部讀值。每5分鐘讀值一次，共30分鐘。4)稀釋檢測底物，取160ul 5mM的Epoxy Fluor 7溶解至9. 84ml檢測緩沖液中， 配成80uM的底物溶液，在步驟2配制的每個樣本孔和空白孔分別加入IOOul底物溶液，迅速震蕩混勻，酶標儀下讀值。4、計算酶活性將平行孔的熒光強度讀值取平均值，用對照溶液孔的熒光強度值減去相應的抑制劑孔熒光強度值，得到相對的熒光強度值，用此表示sEH的酶活性。繪制以反應時間為橫坐標，相對熒光強度為縱坐標的曲線，可以看到反應速率的變化(圖2、圖3)。酶活性也可以以反應30分鐘時的相對突光強度表不(圖4、圖5)。實施例2I、溶液配制I)先配制低滲溶液將三羥甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化鎂15_25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸35-40毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，調節pH至7. 0-7. 5，水定容至IOOml ；取低滲溶液2. 475ml，加入濃度為IOOmM的PMSF 25ul，制成裂解液5ml ；2)檢測緩沖液50mM Tris+0. 2mg/ml BSA, pH 7. 0，存放于 4°C ；3)檢測底物Epoxy Fluor 7溶于DMSO中配成5mM的儲存液，存放于_20°C4) sEH抑制劑t-AUCB溶于DMSO中配成IOmM的儲存液，存放于_20°C2、樣本I)細胞培養與處理人胚胎腎293細胞系，鋪于6cm細胞培養皿中，細胞80%融合，換液，給予處理。共分4組，每組3個平行處理。第一組溶劑DMS0I 1000 ；第二組sHl抑制劑t_AUCB I 1000，終濃度為 IOuM ;第三組對照腺病毒Ad_GFP 20moi ；第四組腺病毒過表達sEH Ad-sEH 20moi ；37°C,5% CO2 培養 24 小時。
2)細胞棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，將殘留PBS吸凈，每個皿加入 200ul裂解液，冰上放置20min，刮取細胞收于EP管中，使用271/4G注射器針頭反復吹吸15 次，40C，12000RCF離心lOmin，吸取上清至新的EP管中。3)使用BCA定量法，對裂解上清進行蛋白定量。3、檢測I)將DMSO溶解的IOmM的sHl抑制劑tAUCB取2ul溶解至98ul的去離子水中，配成200uM的抑制劑溶液。再取2ul DMSO溶解至98ul去離子水中，配成對照溶液。2)取96孔黑色酶標板，在相應的孔中分別加入IOul對照溶液或10ul200uM的SEH 抑制劑。計算細胞裂解上清的蛋白濃度，取IOOug蛋白分別加入至對照溶液和sHl抑制劑孔中，用裂解液補足總體積至lOOul，吹吸混勻每個孔中的溶液。空白對照孔加入IOul對照溶液和90ul裂解液，混勻，30°C孵育10分鐘。(圖6)3)熒光酶標儀設置激發波長330nm，發射波長465nm，縫寬20nm，溫度設定30°C， 頂部讀值。每5分鐘讀值一次，共30分鐘。4)稀釋檢測底物，取48ul 5mM的Epoxy Fluor 7溶解至2. 952ml檢測緩沖液中， 配成80uM的底物溶液，在步驟2配制的每個樣本孔和空白孔分別加入IOOul底物溶液，迅速震蕩混勻，酶標儀下讀值。4、計算酶活性將平行孔的熒光強度讀值取平均值，用對照溶液孔的熒光強度值減去相應的抑制劑孔熒光強度值，得到相對的熒光強度值，用此表示sEH的酶活性。繪制以反應時間為橫坐標，相對熒光強度為縱坐標的曲線，可以看到反應速率的變化(圖7、圖8、圖9)。
權利要求
1.一種檢測組織或細胞中可溶性表氧化物水解酶活性的試劑，由裂解液、檢測緩沖溶液、檢測底物溶液和SHl抑制劑溶液組成；通過下述方法制備得到裂解液包括低滲溶液和苯甲基磺酰氟溶液，其中低滲溶液為去離子水，或按如下配制將三羥甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化鎂15-25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸35-40 毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，調節pH至7. 0-7. 5，水定容至IOOml ；苯甲基磺酰氟溶液將苯甲基磺酰氟溶于異丙醇中，濃度為IOOmM ；苯甲基磺酰氟溶液與低滲溶液的體積比為1/1000 1/100 ；檢測緩沖溶液將三羥甲基氨基甲烷溶解至水中，濃度為50禮，調節pH至6. 8-7. 3，加入牛血清白蛋白溶解，牛血清白蛋白的加入量為O. 1-0. 3mg/ml ；檢測底物溶液將Epoxy Fluor 7溶解至二甲基亞砜中配成5mM的溶液； sEH抑制劑溶液將sHl抑制劑溶解至二甲基亞砜中，配成IOmM的溶液。
2.根據權利要求I所述的試劑，其中，低滲溶液為去離子水。
3.根據權利要求I所述的試劑，其中，所述sEH抑制劑為12-(3-金剛烷-I-基-脲基)-正十二烷酸、反式-4-[4- (3-金剛烷-I-基-脲基)-環己氧基]-苯甲酸或I- (I-甲磺酰哌啶-4-基)-3- (4-三氟甲氧基苯基)-尿素。
4.權利要求I所述試劑的制備方法，其主要包括1)制備裂解液，所述裂解液包括低滲溶液和苯甲基磺酰氟溶液低滲溶液為去離子水，或按如下配制將三羥甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化鎂15-25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸35-40 毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，調節pH至7. 0-7. 5，水定容至100ml，存放于4°C ；2)苯甲基磺酰氟溶液將苯甲基磺酰氟溶于異丙醇中，濃度為IOOmM,存放于-20°C至4 0C ；苯甲基磺酰氟溶液與低滲溶液的體積比為1/1000 1/100 ；3)檢測緩沖溶液將三羥甲基氨基甲烷溶解至水中，濃度為50禮，調節pH至6.8-7. 3， 加入牛血清白蛋白溶解，牛血清白蛋白的加入量為O. 1-0. 3mg/ml，存放于4°C ；4)檢測底物溶液JfEpoxyFluor 7溶解至二甲基亞砜中配成5mM的溶液，存放于-20 0C ；5)sHl抑制劑溶液將sHl抑制劑溶解至二甲基亞砜中，配成IOmM的溶液，存放于-20 0C ο
5.根據權利要求4所述的制備方法，其中，低滲溶液為去離子水。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其中，所述sHl抑制劑為12-(3-金剛烷-I-基-脲基)-正十二烷酸、反式-4-[4- (3-金剛烷-I-基-脲基)-環己氧基]-苯甲酸或I- (I-甲磺酰哌啶-4-基)-3- (4-三氟甲氧基苯基)-尿素。
全文摘要
一種檢測組織或細胞中可溶性表氧化物水解酶活性的試劑，由裂解液、檢測緩沖溶液、檢測底物溶液和sEH抑制劑溶液組成。本發明還提供了制備上述試劑的方法。
文檔編號G01N21/64GK102608081SQ201110330608
公開日2012年7月25日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者何金龍, 劉燕, 朱毅, 李楠 申請人:北京大學