具有sted片光源的spim顯微鏡的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：具有sted片光源的spim顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括光源和照相機(jī)的SPIM顯微鏡，所述光源從y方向發(fā)出激發(fā)光束到要成像的對(duì)象上，所述照相機(jī)以ζ方向作為第一檢測(cè)方向檢測(cè)從所述對(duì)象上發(fā)出的熒光和 /或反射光，其中Z方向沿基本與y方向垂直的方向延伸。
背景技術(shù)：
特別地，對(duì)生物樣品的分析應(yīng)是快速且不應(yīng)對(duì)生物樣品造成損傷。對(duì)很多應(yīng)用來(lái)說(shuō)，生成三維圖像很有用。應(yīng)該避免因照射光與樣品的相互作用而發(fā)生的散射偽像和吸收偽像，特別是在熒光顯微鏡的視場(chǎng)下時(shí)，其中照射光具有用于激發(fā)熒光的激發(fā)光功能。所謂的SPIM(選擇性平面照射顯微鏡)技術(shù)特別適合于以高分辨率實(shí)現(xiàn)快速分析顯微樣品，且不損傷樣品，其中照射光產(chǎn)生片光源(light sheet)，同時(shí)照相機(jī)在相對(duì)于照射方向相垂直的方向上檢測(cè)由熒光和反射產(chǎn)生的檢測(cè)光。片光源為具有大體矩形截面的照射體積，其在第一截面方向上(此處為ζ方向) 非常薄，而相對(duì)于第一截面方向，第二截面方向上(此處為X方向)明顯更厚。照射方向 (此處為y方向)基本垂直于第一截面方向(此處為Z方向)延伸，且沿與第二截面方向 (此處為χ方向)基本垂直的方向延伸。片光源由圓柱狀透鏡聚焦且該片光源的焦距或焦長(zhǎng)可被理解為照射方向(此處為y方向)上的特定范圍，其中片光源特別薄，使得被照射體積的形狀為片狀，即在Z方向上非常薄而在X和y方向上較厚。根據(jù)現(xiàn)有SPIM技術(shù)，利用圓柱狀透鏡產(chǎn)生的片光源的缺點(diǎn)在于，該系統(tǒng)很不靈活，例如其提供的是固定焦點(diǎn)，因此被照射體積是預(yù)確定的。為了實(shí)現(xiàn)高分辨率，盡可能薄且縱向延伸的焦距是有益的?？梢栽跇悠返囊粋€(gè)方向上掃描該焦距以獲得三維圖像。由于長(zhǎng)度增加也使寬度增加，ζ方向上的分辨率就降低了。這意味雖然選擇了較低的照射光學(xué)器件的數(shù)值孔徑而得到了長(zhǎng)焦距，但結(jié)果也會(huì)使被照射體積的厚度較大。這意味著檢測(cè)方向上沿光軸的光學(xué)分辨率也同樣降低。根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，結(jié)果與目標(biāo)卻相互矛盾如果應(yīng)該使照射光穿透的深度大，那么就需要焦距長(zhǎng)，然而焦距長(zhǎng)又導(dǎo)致片光源更厚從而降低分辨率。 照射光學(xué)器件的數(shù)值孔徑小，所形成的焦距長(zhǎng)。除期望在照射光的穿透深度大的同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)高分辨率，通常還期望能在照射體積上有靈活性。例如，一些應(yīng)用要求照射體積更大，比如在需要觀(guān)察發(fā)生在特定體積的對(duì)象內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)時(shí)。相對(duì)而言，也有可能期望照射體積更小，例如特別是在通過(guò)更薄的片光源實(shí)現(xiàn)更薄的照射體積以使其具有更明確限定的層或平面從而用于例如確定對(duì)象內(nèi)的擴(kuò)散速度時(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是首先提高被描述顯微鏡的靈活性，尤其提高在選擇照射體積上的靈活性以及提高在選擇顯微鏡類(lèi)型上的靈活性。根據(jù)本發(fā)明，上述目的通過(guò)第一 X掃描儀實(shí)現(xiàn)，該掃描儀通過(guò)在X方向上掃描照明
4光束產(chǎn)生連續(xù)片光源，其中χ方向沿與y方向和ζ方向基本垂直的方向延伸，且片光源在由χ方向與y方向所限定的平面內(nèi)連續(xù)形成；并且去活化光源從y方向發(fā)出至少一個(gè)去活化光束至物體上，使連續(xù)產(chǎn)生的片光源在ζ方向上更薄，其中去活化光束具有在ζ方向上相對(duì)于照明光束偏移的至少一個(gè)強(qiáng)度最大值，且去活化光束平行于照明光束在χ方向上被掃描。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，提供去活化光束調(diào)制器，其適于調(diào)制去活化光束，使得去活化光束的截面包括在ζ方向上的至少兩個(gè)強(qiáng)度最大值，其中在強(qiáng)度最大值之間具有零點(diǎn)，該零點(diǎn)位于激發(fā)光束中心處。在可替代方案中，該去活化光束可被調(diào)制為使去活化光束的旁瓣(側(cè)極值)也被去活化。在該情況下，如果激發(fā)光束的旁瓣與去活化光束的峰值相重合是有益的?？梢哉{(diào)制激發(fā)光束使產(chǎn)生的旁瓣更強(qiáng)，這將使最大值更長(zhǎng)、更細(xì)。在非去活化的情況下更強(qiáng)的旁瓣(側(cè)極值)降低了 ζ方向上的分辨率。然而如果側(cè)最大值被去活化， 就提高了分辨率。另外，可變化地選擇使用短TAG透鏡中的“可調(diào)聲梯度折射率指數(shù)透鏡”來(lái)調(diào)制激勵(lì)光束。該TAG透鏡提供了一種用于產(chǎn)生貝塞爾光束的替代方法。在該TAG透鏡中，在圓形壓電元件中提供光折射流體，該流體被交流電激勵(lì)從而產(chǎn)生變化的折射率。激勵(lì)信號(hào)在振幅及頻率上的變化使傳輸?shù)膱D案發(fā)生快速改變。切換速率由允許形成穩(wěn)定圖案的切換動(dòng)作間所需的時(shí)間來(lái)確定-這主要取決于流體的粘度。對(duì)于粘度在640cs和0. 65cs之間的流體，切換時(shí)間可以為300和2000 μ s之間。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供適于調(diào)制去活化光束的相移片。如果需要調(diào)制去活化光束，使得僅限于在兩側(cè)進(jìn)行激發(fā)以產(chǎn)生更薄的片光源，那么一個(gè)獨(dú)立的相移片就足夠了。然而，在可替代方案中，還可以限制每側(cè)上的各個(gè)激發(fā)點(diǎn)，例如渦流濾光片或圓形相移片，或者提供兩個(gè)彼此呈90°角度的相移片，用于在χ方向(掃描方向)和ζ方向 (連續(xù)產(chǎn)生的片光源的厚度)上進(jìn)行限制。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，可提供激發(fā)光束調(diào)制器用于把激發(fā)光束調(diào)制成貝塞爾光束。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，激發(fā)光束為可調(diào)聲梯度折射率指數(shù)(TAG)透鏡。 另外，多光子激發(fā)的優(yōu)點(diǎn)是被調(diào)制的激發(fā)光束的旁瓣被激發(fā)的可能性比用連續(xù)光(也稱(chēng)為連續(xù)波或CW激發(fā))激發(fā)時(shí)低10的2次方，因此在檢測(cè)時(shí)背景較暗。特別地，當(dāng)用連續(xù)光激發(fā)時(shí)，調(diào)制去活化光束用于限制激發(fā)光束的旁瓣是有用的，其中去活化光束也可類(lèi)似地使用TAG透鏡來(lái)調(diào)制。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述激發(fā)光束調(diào)制器為軸錐鏡(Axicon)。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供至少一個(gè)聲光元件用以調(diào)節(jié)至少激發(fā)光束。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，聲光元件為聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD)。通過(guò)A0D，照明光束被偏轉(zhuǎn)，例如用于提供掃描功能。在可替代方案中，檢流計(jì)可替代AOD用于提供掃描功能。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，聲光元件為聲光可調(diào)諧濾波器(AOTF)，用于選擇激發(fā)光束的波長(zhǎng)并調(diào)節(jié)其強(qiáng)度。使用AOT的特別優(yōu)點(diǎn)在于其具有雙重功能，也就是，既可以調(diào)節(jié)強(qiáng)度也可以調(diào)節(jié)波長(zhǎng)。特別地，可以通過(guò)AOTF把輸出強(qiáng)度控制在較寬的限界內(nèi)，也就是，在A(yíng)OFT輸出側(cè)的輸出強(qiáng)度可以被調(diào)節(jié)為輸入強(qiáng)度的幾乎100%，也可以被控制為僅為輸入強(qiáng)度的千分之幾。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，去活化光束具有恒定波長(zhǎng)。其優(yōu)點(diǎn)是可以免去例如通過(guò)AOTF來(lái)調(diào)制去活化光束的波長(zhǎng)。為此，在多色熒光顯微鏡中，優(yōu)選選擇這樣的染料， 該染料具有不同的激發(fā)波長(zhǎng)，但可由一個(gè)相同的去活化波長(zhǎng)去活化。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供至少一個(gè)強(qiáng)度控制器用于調(diào)節(jié)激發(fā)光束和去活化光束的強(qiáng)度。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，強(qiáng)度控制器包括聲光元件根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供適于在第一工作模式和第二工作模式間進(jìn)行切換的切換器，所述第一工作模式為沒(méi)加入去活化光束的正常SPIM模式，所述第二工作模式為其中另外開(kāi)啟去活化光束的SPIM加STED模式。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，切換器適于在所述第一和第二工作模式間做永久選擇。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，切換器適于以特定切換頻率在所述第一和第二工作模式間自動(dòng)切換。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，圖像處理單元以該切換頻率根據(jù)各自的第一和第二工作模式將由照相機(jī)在第一檢測(cè)方向上檢測(cè)的檢測(cè)光分成兩個(gè)數(shù)據(jù)流，所述數(shù)據(jù)流產(chǎn)生根據(jù)第一工作模式的圖像和根據(jù)第二工作模式的圖像。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供照射光學(xué)元件，其包括提供在激發(fā)光束的光束路徑中的光學(xué)變焦元件且包括彼此間能機(jī)械移動(dòng)的透鏡組以改變數(shù)值孔徑，由此擴(kuò)大或縮短連續(xù)產(chǎn)生的片光源的焦距，且由此在y照射方向上擴(kuò)大或縮短由片光源照射到物體上的視場(chǎng)的長(zhǎng)度。該照射光學(xué)元件優(yōu)選包括照明物鏡。通過(guò)該靈活的光學(xué)變焦元件，可調(diào)節(jié)片光源的長(zhǎng)度(在y方向和ζ方向上)。如果僅需要照射一薄層，可以增大數(shù)值孔徑，但結(jié)果是片光源的可用長(zhǎng)度縮短了。本發(fā)明通過(guò)加入STED光束的去活化作用，使片光源更薄且由此使被照射體積變薄來(lái)克服上述矛盾，從而可在實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)焦距的同時(shí)具有薄的、連續(xù)產(chǎn)生的片光源。可以得到一系列高分辨率的沿ζ方向的圖像。由于變焦光學(xué)元件的光學(xué)參數(shù)已知，通過(guò)僅在此范圍內(nèi)選擇合適的圖像處理來(lái)使用并組合，可以提供高分辨率圖像。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供光探測(cè)器用于檢測(cè)由物體發(fā)出的與χ方向相反的第二檢測(cè)方向上的熒光和/或反射光。光探測(cè)器通常比照相機(jī)速度快，但不能提供定位，然而這完全不必要，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)多光子照明光束實(shí)現(xiàn)定位；特別是在多光子照明時(shí)， 這更容易實(shí)現(xiàn)，因?yàn)檫@種類(lèi)型的照明幾乎可以及時(shí)準(zhǔn)確地知道物體中哪部分特定體積在任何給定點(diǎn)處被照射了，從而檢測(cè)到來(lái)自所有可能方向上的信號(hào)檢測(cè)光。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，通過(guò)應(yīng)用SPIM技術(shù)在ζ方向上檢測(cè)到2維寬視場(chǎng)圖像的同時(shí)，并行生成物體的共焦一維圖像，該共焦一維圖像為在X方向上延伸的一行。二維圖像成像的是由以上描述的片光源所照射的并由變焦光學(xué)元件控制的那個(gè)照射面，同時(shí)并行產(chǎn)生稱(chēng)為x-t的圖像，即行圖像，該行圖像特別提供了在生物樣品內(nèi)的關(guān)于物體內(nèi)特定單元的移動(dòng)速度信息，例如分子或其他細(xì)胞(細(xì)胞器)的擴(kuò)散。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，掃描儀在ζ方向上移動(dòng)物體，使得在ζ方向上生成多個(gè)彼此間隔的連續(xù)片光源，因此提供了多個(gè)照射面，其中各個(gè)片光源與照相機(jī)間的距離保持不變。其優(yōu)點(diǎn)是可選擇地開(kāi)啟整個(gè)照射光學(xué)元件、SPIM檢測(cè)光學(xué)元件以及共焦檢測(cè)光學(xué)元件，并保持在同一位置，而且照明光束不必由掃描儀在ζ方向上偏轉(zhuǎn)，這也使照明光學(xué)元件得以簡(jiǎn)化。然而，在可替代方案中，還可以移動(dòng)照明光學(xué)元件或在ζ方向上偏轉(zhuǎn)照明光束，例如通過(guò)聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD)或檢流計(jì)。在該情況下，SPIM檢測(cè)光學(xué)元件優(yōu)選移動(dòng)跟蹤照明，這可以通過(guò)改變SPIM檢測(cè)光學(xué)元件的物鏡的位置或通過(guò)偏置包括照相機(jī)的整個(gè)SPIM 檢測(cè)光學(xué)元件來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，切換器適于在以下工作模式間切換i)與y照明方向相反的檢測(cè)光的共焦檢測(cè)；ii) ζ方向?qū)捯晥?chǎng)檢測(cè)光的SPIM檢測(cè)；iii) ζ方向?qū)捯晥?chǎng)檢測(cè)光的多光子檢測(cè)；iv)前述共焦檢測(cè)與SPIM檢測(cè)的同時(shí)檢測(cè)；以及ν)前述共焦檢測(cè)與多光子檢測(cè)的同時(shí)檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述工作模式i)_v)可選擇地設(shè)置具有或不具有額外開(kāi)啟的STED去活化光束。可以按行或按像素執(zhí)行開(kāi)啟或關(guān)閉，然后將數(shù)據(jù)流分開(kāi)。這可以產(chǎn)生兩個(gè)不同的圖像，這兩個(gè)圖像的照射體積不同。還可以把這兩個(gè)圖像通過(guò)重疊方式相組合，例如用于觀(guān)察在較大照射體積內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)的同時(shí)，還可用于更準(zhǔn)確地檢測(cè)在較小照射體積內(nèi)的擴(kuò)散速率，例如通過(guò)二維FCS(熒光相關(guān)光譜)方法。


以下參照附圖對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行討論。其中，圖1為根據(jù)現(xiàn)有SPIM技術(shù)的示意性基本原理透視圖；圖2為根據(jù)現(xiàn)有SPIM技術(shù)的照射光束路徑與檢測(cè)光束路徑的示意圖；圖3是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)描述的STED原理的示意圖；圖4是根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡的示意圖；圖5是描述由通過(guò)相移片調(diào)制STED去活化光束(deactivation beam)的示意圖；圖6是圖4所示的根據(jù)本發(fā)明顯微鏡的從χ掃描方向觀(guān)察的示意圖，包括激發(fā)光束，去活化光束和檢測(cè)光束路徑；圖7是圖6所示的顯微鏡從y照射方向觀(guān)察的示意圖；圖示出了激發(fā)光束的截面以及在X、y和ζ坐標(biāo)系中的相關(guān)強(qiáng)度分布；圖8b示出了激發(fā)光束與活化光束的相互比較，以及通過(guò)在χ方向上的掃描生成的連續(xù)片光源和在χ、y和ζ坐標(biāo)系中的相關(guān)強(qiáng)度分布；以及圖9為本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例的示意圖，其另外采用SPIM檢測(cè)光學(xué)元件用于檢測(cè)多光子信號(hào)。
具體實(shí)施例方式圖1示出了根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的SPIM顯微鏡的簡(jiǎn)化后原理圖，該顯微鏡的工作原理基于“有選擇性的平面成像”技術(shù)。由片光源實(shí)現(xiàn)y方向上的照射，用于只照射物平面內(nèi)的物體。檢測(cè)方向基本垂直于片光源1(即在ζ方向上)延伸，其中對(duì)檢測(cè)光的檢測(cè)由物鏡3實(shí)現(xiàn)。如圖1所示，片光源1應(yīng)該在其內(nèi)部區(qū)域內(nèi)特別薄，從而在ζ方向上獲得高分辨率。當(dāng)片光源1在物體中的聚焦較窄時(shí)，能實(shí)現(xiàn)高分辨率。
如下面將更詳細(xì)解釋?zhuān)劢沟拈L(zhǎng)度是可控的使得被成像的視場(chǎng)更大，但這樣會(huì)降低聚焦的清晰度，并降低片光源1的寬窄度，從而減低圖片在ζ方向上的分辨率。根據(jù)特定場(chǎng)合的應(yīng)用，也許有用的是基于更厚的片光源，降低ζ方向上的分辨率，但同時(shí)能看到更大的視場(chǎng)和更大的成像體積。如果生成的圖像還能允許觀(guān)察圖像的關(guān)注區(qū)域，那么更大的成像體積也許是有用的，因?yàn)閷?shí)現(xiàn)更大圖像體積的優(yōu)點(diǎn)在于，更容易確認(rèn)被成像體積確實(shí)包含了所關(guān)注的區(qū)域。如果在形成被關(guān)注區(qū)域的圖像時(shí)需要用更高的分辨率，可以借助變焦光學(xué)元件調(diào)節(jié)連續(xù)的片光源1的聚焦，使該聚焦更小但更清晰。與共焦掃描顯微技術(shù)相比，SPIM技術(shù)在對(duì)ζ方向上檢測(cè)光進(jìn)行檢測(cè)時(shí)要求定位被檢測(cè)光，因?yàn)镾PIM技術(shù)是一種寬視場(chǎng)顯微技術(shù)。該定位一般通過(guò)照相機(jī)來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如CXD 照相機(jī)或CMOS照相機(jī)。如果應(yīng)該由SPIM技術(shù)生成物體的三維圖像，可以在ζ方向上掃描片光源1或物體，然后把在不同照射面內(nèi)獲得的圖像組合成三維圖像。該成像過(guò)程也稱(chēng)為 “重現(xiàn)”，此時(shí)為ζ方向上的重現(xiàn)。圖2示意性示出了根據(jù)現(xiàn)有SPIM技術(shù)的照射光束路徑。激光器4產(chǎn)生照射光束 5，其穿過(guò)擴(kuò)束器傳輸?shù)綔?zhǔn)直透鏡6內(nèi)，接著由柱面透鏡7聚焦成片光源1至物體上。物鏡透鏡收集檢測(cè)光束并將其導(dǎo)入照相機(jī)9。通過(guò)移動(dòng)透鏡組中的元件可以調(diào)節(jié)片光源的焦距， 在圖2的這個(gè)極其簡(jiǎn)化的示例中，可以相對(duì)準(zhǔn)直透鏡6移動(dòng)柱面透鏡7來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)另外開(kāi)啟STED去活化光束(受激發(fā)射損耗)進(jìn)一步窄化片光源1，即，使片光源1變得更薄以在Z方向上實(shí)現(xiàn)更高分辨率。本領(lǐng)域已知的STED顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)如圖3所示。激發(fā)光束31和去活化光束32由光束組合器組合成(在該實(shí)施例中例如為分色濾光器)共同光束路徑34，然后導(dǎo)向穿過(guò)物鏡3到物體2上。在該光路中可以提供數(shù)個(gè)其他光學(xué)元件，例如透鏡、光導(dǎo)纖維或?yàn)V色片。一般可調(diào)制去活化光束的強(qiáng)度分布，例如可通過(guò)下面參照?qǐng)D5描述的相移片來(lái)調(diào)制，但還可以通過(guò)為此目的而具有特殊結(jié)構(gòu)的透鏡來(lái)實(shí)現(xiàn)。在調(diào)制時(shí)，使去活化光束的中心為零點(diǎn)，這意味著在零點(diǎn)處強(qiáng)度為零或非常低，而在該零點(diǎn)周?chē)峁┚鶆?、圓形的強(qiáng)度極值。在熒光顯微技術(shù)中用以在特定激發(fā)波長(zhǎng)和去活化波長(zhǎng)處進(jìn)行反應(yīng)的染料也可以被用來(lái)激發(fā)熒光或去活化熒光。一般激發(fā)波長(zhǎng)和去活化波長(zhǎng)彼此是有區(qū)別的，而且通常以時(shí)間延遲的方式將激發(fā)光束和去活化光束分別傳送到對(duì)象上。這被稱(chēng)為脈沖STED，但還發(fā)現(xiàn)存在以下可能的混合類(lèi)型·具有被延遲的脈沖去活化的脈沖激發(fā)·具有CW去活化的CW (連續(xù)波)激發(fā)·具有CW去活化的脈沖激發(fā)·具有脈沖去活化的脈沖MP (多光子)激發(fā)·具有CW去活化的脈沖MP (多光子)激發(fā)通過(guò)激發(fā)，具有特定尺寸的成像點(diǎn)受激發(fā)射出熒光，與此同時(shí)立即在該激發(fā)中心周?chē)┘尤セ罨?，使得由物體的該成像點(diǎn)發(fā)出的熒光變窄而形成小成像點(diǎn)，由此提高分辨率。對(duì)于彩色熒光顯微技術(shù)，可以使用各種不同的染料，這些染料通過(guò)不同的激發(fā)波長(zhǎng)相區(qū)分，即，用于發(fā)射熒光的特定強(qiáng)激發(fā)的各種波長(zhǎng)的激發(fā)光。優(yōu)選地，可以選擇染料進(jìn)行組合， 使得它們可以被共同且相同的去活化波長(zhǎng)去活化，從而不必提供不同的去活化波長(zhǎng)。從物體返回的檢測(cè)光35穿過(guò)物鏡3，由分束器(此情況下為分光鏡37)傳送通過(guò)透鏡和合適的孔徑38至光檢測(cè)器36上，所述孔徑用于消除散射光。
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在圖3所示的示例中示意了 STED顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)，其中激發(fā)光束和去活化光束被合成為共同光束路徑。檢測(cè)光束路徑與激發(fā)光束同軸延伸一段距離，但檢測(cè)光束路徑與激發(fā)光束的方向相反，去活化光束向上延伸至分色鏡37處并由分色鏡37將去活化光束向外耦合至光檢測(cè)器36。這樣的布置是特別緊湊的，但應(yīng)理解的是，也可以使用單獨(dú)的去活化光束光學(xué)元件傳送去活化光束，從而可獨(dú)立于照射光學(xué)元件，更靈活地調(diào)節(jié)去活化光束。圖5示意了由相移片39調(diào)節(jié)去活化光束40。使用該相移片39可調(diào)節(jié)相位以及強(qiáng)度分布。為此，相移片被設(shè)計(jì)為調(diào)節(jié)去活化光束40，而不是激發(fā)光束41，即該調(diào)節(jié)取決于與激發(fā)光束41不同的去活化光束40的波長(zhǎng)。圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的SPIM顯微鏡的示意性結(jié)構(gòu)，其中參考數(shù)字10表示照明光束路徑，參考數(shù)字11表示SPIM-檢測(cè)光束路徑。照明光束路徑10還包括提供共焦檢測(cè)光束路徑的功能，但是后者的延伸方向與照明方向相反。首先描述一下照明光束路徑；激光器4產(chǎn)生照明光，該照明光經(jīng)掃描儀12傳送至變焦光學(xué)元件13。掃描儀12產(chǎn)生連續(xù)片光源1用于照明物體2。為了連續(xù)產(chǎn)生片光源1， 照明激光束在χ方向上進(jìn)行掃描，即分別沿圖4所示的從外向里的方向或從里向外的方向掃描。激光束例如可以具有圓形截面，但在可替代的方案中，也可以調(diào)節(jié)截面的形狀，例如為橢圓形截面，其中橢圓形的長(zhǎng)軸在χ方向上延伸。類(lèi)似地，照明光束路徑例如可以為矩形或任一其他可選擇的形狀。SPIM檢測(cè)光束路徑11沿ζ方向延伸，即與照明光束路徑10的延伸方向(y方向) 基本垂直。使照明光束路徑與檢測(cè)光束路徑間的垂直關(guān)系稍有偏離是有益的，例如兩個(gè)路徑間的夾角可比90°稍小或稍大，這樣可為物體中的顆?；蚓植慨a(chǎn)生背景照明。還可以從不同角度檢測(cè)圖像，然后將它們合成，例如與公知的SPIM技術(shù)相同。為了保持描述上的簡(jiǎn)化，下面描述的關(guān)系為矩形的，但應(yīng)理解的是其還包含了偏離角度，即比90°稍大或稍小。 由物體2發(fā)出的檢測(cè)光(反射或發(fā)射熒光)被物鏡3收集。對(duì)于多色檢測(cè)來(lái)說(shuō)，尤其需要在物鏡下游提供濾光片14，其能夠?yàn)V過(guò)特定波長(zhǎng)的檢測(cè)光，然后該檢測(cè)光經(jīng)管狀透鏡15被導(dǎo)向至照相機(jī)16，例如CXD照相機(jī)16。提供另外的激光器46用于產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的去活化光。該去活化光的波長(zhǎng)與激發(fā)光的波長(zhǎng)不同。一般地，去活化光具有比激發(fā)光更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。對(duì)于多色顯微鏡來(lái)說(shuō)，染料被選擇為具有不同的激發(fā)波長(zhǎng)，但去活化波長(zhǎng)基本相同。這帶來(lái)的優(yōu)點(diǎn)是，為了提供去活化波長(zhǎng)，僅需要提供一個(gè)可準(zhǔn)確產(chǎn)生去活化波長(zhǎng)的獨(dú)立激光器，且不需要進(jìn)行波長(zhǎng)調(diào)制，從而免去在波長(zhǎng)調(diào)制上的花費(fèi)，例如免去聲光元件(聲光可調(diào)諧濾波器，A0TF)以及用于驅(qū)動(dòng)AOTF 的頻率發(fā)生器的花費(fèi)。作為例子，對(duì)于已知STED的約20種染料，已知可在波長(zhǎng)590nm處激發(fā)，在波長(zhǎng)600nm處去活化，或在波長(zhǎng)440nm處激發(fā)，在波長(zhǎng)532nm處去活化?？捎葾OTF調(diào)節(jié)激發(fā)和去活化的頻率和強(qiáng)度。如以上關(guān)于圖3所討論，去活化光束既可以經(jīng)過(guò)與激發(fā)光束相同的光學(xué)元件被傳送，即光束路徑相同，也可以如下面圖6中所示的，經(jīng)過(guò)單獨(dú)的光束路徑傳送。在根據(jù)圖4 的實(shí)施例中，激光器4產(chǎn)生激發(fā)光束，激光器46產(chǎn)生去活化光束，經(jīng)共同掃描儀12進(jìn)行掃描。為了生成三維圖像，載物臺(tái)17可在ζ方向上被掃描用于連續(xù)照射物體2內(nèi)不同的照射面，每個(gè)照射面由在X方向上掃描的掃描激光束掃描且由在各個(gè)照射面內(nèi)連續(xù)形成的片光源1連續(xù)照射。在ζ方向上連續(xù)形成的多個(gè)相鄰的片光源1可通過(guò)ζ方向上的“重現(xiàn)” 被合成。如果需要通過(guò)ζ向驅(qū)動(dòng)的“重現(xiàn)”生成三維圖像，那么移動(dòng)物體2的優(yōu)點(diǎn)是，物體內(nèi)每個(gè)相鄰的照射面與物鏡間的距離保持相同，因?yàn)檎丈涔馐奈恢煤驼障鄼C(jī)16的位置均沒(méi)有變化。在可替代的方案中，可以由例如檢流計(jì)(galvanometer)在ζ方向上掃描片光源1。然而，這也需要移動(dòng)物鏡3，使每個(gè)照射面與物鏡間的距離保持相同。在可替代的方案中，可以移動(dòng)包括物鏡3、濾光片14、管狀透鏡15以及照相機(jī)16的整個(gè)SPIM檢測(cè)光學(xué)組件。如已提到，照明檢測(cè)光束路徑10還可提供共焦檢測(cè)光束路徑的功能，為此，提供檢測(cè)器18用于檢測(cè)y方向上的從物體反射的檢測(cè)光和/或檢測(cè)發(fā)出的熒光。在用SPIM技術(shù)通過(guò)檢測(cè)光束路徑11進(jìn)行圖像檢測(cè)的同時(shí)，還可以平行地進(jìn)行共焦圖像檢測(cè)，因?yàn)槠庠?由χ方向上的掃描連續(xù)地生成。該共焦生成的圖像比由SPIM檢測(cè)所檢測(cè)到的圖像少一個(gè)維度。例如，如果由SPIM生成的是二維圖像，即只在一個(gè)獨(dú)立像平面內(nèi)的圖像，那么還可以檢測(cè)到稱(chēng)為x_t的圖像，即一維行圖像。這例如可用來(lái)確定特定分子的擴(kuò)散速率，該特定分子可以由標(biāo)記物所標(biāo)記或被染色用于發(fā)出熒光，然而同時(shí)成像的二維SPIM圖像可以提供不同的信息，例如關(guān)于在被成像物體的像平面內(nèi)哪些分子與其他分子相結(jié)合的信息。這同樣可應(yīng)用到通過(guò)SPIM檢測(cè)用ζ驅(qū)動(dòng)生成三維圖像的情況，即可以生成共焦二維圖像。通過(guò)這種方式可以例如用來(lái)確定在三維圖像中的物體內(nèi)哪些分子與其他分子相結(jié)合，并可同時(shí)確定穿過(guò)特定平面擴(kuò)散的分子的擴(kuò)散速率。對(duì)于在檢測(cè)“η”維SPIM圖像時(shí)同時(shí)檢測(cè)到的并行共焦生成的“η-?！S圖像，可以結(jié)合其額外的確定信息，例如結(jié)合其額外的速度信息來(lái)確定哪些獨(dú)立單元(例如分子或其他單元)在物體2內(nèi)移動(dòng)。因此，在顯微鏡領(lǐng)域中，這可應(yīng)用到有生命的有機(jī)體內(nèi)。圖6示出了根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例。使用之前附圖中相同的參考數(shù)字來(lái)表示類(lèi)似的元件。該圖中，仍用參考數(shù)字10表示照明光束路徑，參考數(shù)字11表示SPIM-檢測(cè)光束路徑。在該圖6的實(shí)施例中，照明光束路徑10還具有檢測(cè)光束路徑的額外功能，其中共焦檢測(cè)光21穿過(guò)孔20，通過(guò)光電二極管19接收并實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測(cè)，然后信號(hào)經(jīng)過(guò)圖像處理單元22傳送至監(jiān)視器23內(nèi)。檢測(cè)光由分色鏡M反射至光電二極管19。可以提供其他光學(xué)傳感器來(lái)替代光電二極管19，例如雪崩二極管、光電倍增管或照相機(jī)。因?yàn)檫@些與共焦圖像檢測(cè)相關(guān)聯(lián)，所以不需要定位，原因是關(guān)于定位的信息由被掃描的照明光束提供，即如果及時(shí)知道在特定點(diǎn)處物體的哪個(gè)成像點(diǎn)被照射，那么就獲知了這樣的信息，即從該特定成像點(diǎn)接收的信號(hào)來(lái)自于正好在接收信號(hào)之前被照射的成像點(diǎn)的信號(hào)。因此，共焦檢測(cè)不需要照相機(jī)。為了改變連續(xù)產(chǎn)生的片光源1的焦點(diǎn)，可以在y方向上相對(duì)另一透鏡沈移動(dòng)變焦透鏡25。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可以為此提供一透鏡組，但為了簡(jiǎn)化，所討論的實(shí)施例僅具有一個(gè)獨(dú)立的變焦透鏡25。變焦光學(xué)元件13與照明物鏡(顯宏物鏡)組合，從而提供光學(xué)變焦以調(diào)節(jié)焦距范圍27的長(zhǎng)度。聚焦越清晰，可用的焦距長(zhǎng)度越短，但同時(shí)片光源越薄。為了簡(jiǎn)化， 圖6中省去了 SPIM檢測(cè)光學(xué)元件的細(xì)節(jié)，因?yàn)檫@些光學(xué)元件在圖4中已示出，包括物鏡3、 濾色片14和管狀透鏡15。圖中示意性示出的CCD照相機(jī)16給接收到的ζ方向上的檢測(cè)光提供了 x_y平面內(nèi)的定位。由CXD照相機(jī)接收的信號(hào)經(jīng)SPIM圖像處理單元觀(guān)處理且轉(zhuǎn)至SPIM監(jiān)視器四。如果需要照射物體2內(nèi)的多個(gè)平面，可沿ζ方向移動(dòng)載物臺(tái)17。從圖6 可以清楚地理解，表示照射面與CCD照相機(jī)間距離的長(zhǎng)度L通常保持不變。如參照?qǐng)D4已說(shuō)明，還可以在ζ方向上移動(dòng)照射光束同時(shí)保持物體2的位置不變，從而替代移動(dòng)CCD照相機(jī)，因?yàn)檫@更易于改變物鏡3相對(duì)CCD照相機(jī)16的位置。去活化光束已由激光器46產(chǎn)生——該光束還稱(chēng)為STED光束——根據(jù)該實(shí)施例， 其通過(guò)單獨(dú)的去活化光束路徑47傳送。與照明光束類(lèi)似，去活化光束首先被放大，然后被共同的變焦光學(xué)元件聚焦。隨后，去活化光束的光束路徑通過(guò)位于掃描模塊12前面的分色鏡偏轉(zhuǎn)，使得去活化光束路徑與激發(fā)光束路徑共軸延伸。如以上參照?qǐng)D5的描述，通過(guò)相移片39調(diào)制去活化光束。下面參照?qǐng)D8a和圖8b更詳細(xì)地描述去活化光束的調(diào)制。圖7示出了從另一不同觀(guān)察角度所觀(guān)察到的圖6的實(shí)施例，其中沿照明光束，也就是y方向觀(guān)察。此處特別示意出照射點(diǎn)30和去活化點(diǎn)50，其中照射點(diǎn)30在χ方向上被掃描以產(chǎn)生連續(xù)形成的片光源，通過(guò)掃描成行(該行與照射點(diǎn)相平行，即χ方向)的去活化點(diǎn) 50將去活化點(diǎn)50傳送至物體上。分色鏡M朝光電二極管19的方向偏轉(zhuǎn)檢測(cè)光?？稍讦?方向上掃描載物臺(tái)17，即，可以朝著CXD照相機(jī)16移動(dòng)，也可以遠(yuǎn)離于CXD照相機(jī)移動(dòng)，用于照射物體內(nèi)不同的照射面。還可以?xún)H使用一個(gè)單獨(dú)激光器4(白色激光器)產(chǎn)生激發(fā)光束和去活化光束。為此，將光束分離，使一部分光束穿過(guò)聲光元件(例如聲光可調(diào)諧濾波器，A0TF)，其中可以選擇所期望的波長(zhǎng)。通過(guò)使用脈沖激光器，可以憑所謂的延遲階段實(shí)現(xiàn)激發(fā)光束與去活化光束間的時(shí)間延遲。圖和圖8b示出了激發(fā)光束與去活化光束間的關(guān)系。圖8a示出了激發(fā)光束41 的圓形截面。圖8a和圖8b還示出了圖4和圖5中所示的x、y、z方向。圖右側(cè)示出的是激發(fā)光束的強(qiáng)度分布輪廓，該輪廓基本符合高斯分布-除了由于衍射效應(yīng)旁瓣部分相對(duì)較低。圖8b示出了去活化光束40，其被調(diào)制成在激發(fā)光束41兩側(cè)具有最大強(qiáng)度，而在這兩個(gè)最大強(qiáng)度之間有一零點(diǎn)，即強(qiáng)度為零或至少非常低。從圖8b中可以看出，位于零點(diǎn)兩側(cè)的該去活化光束40的最大強(qiáng)度處，光束的截面非圓形，與遠(yuǎn)離激發(fā)中心的一側(cè)相比，截面中面向激發(fā)中心這一側(cè)的曲率較平坦。由于連續(xù)產(chǎn)生的片光源1 (如圖8b中所示的虛線(xiàn)區(qū)域)，去活化光束只有在中心部分內(nèi)的一小條區(qū)域內(nèi)沒(méi)有去活化熒光。在挨著激發(fā)光束41、 去活化光束40和連續(xù)產(chǎn)生的片光源1的截面的右側(cè)，也就是圖8b的右側(cè)，示意出激發(fā)光束 41和去活化光束40的強(qiáng)度I的分布。圖8b更顯現(xiàn)出本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，與現(xiàn)有共焦STED顯微鏡相比，本發(fā)明不需要把所有周邊的照明點(diǎn)作為實(shí)現(xiàn)有效的去活化的邊界，其僅僅需要把兩側(cè)的照明點(diǎn)作為邊界，從而使連續(xù)產(chǎn)生的片光源1更薄。這就使在調(diào)制去活化光束時(shí)更加簡(jiǎn)單，例如，可以?xún)H通過(guò)一個(gè)圖5所示的單獨(dú)的相移片39來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施例，還可以通過(guò)施加去活化光束使片光源的僅一側(cè)更薄。通過(guò)對(duì)去活化光束的特殊調(diào)制，可以產(chǎn)生單側(cè)去活化光束輪廓，包括在一側(cè)的陡?jìng)?cè)翼(steep flank)和最小強(qiáng)度值，后者優(yōu)選在激發(fā)強(qiáng)度的最大值的區(qū)域內(nèi)。對(duì)單側(cè)去活化光束而言，如橢圓或矩形的其他截面形狀也有優(yōu)點(diǎn)?？梢岳斫?，也可以用由多納圈狀的去活化光束來(lái)實(shí)現(xiàn)周?chē)セ罨鳛樘娲?，該多納圈狀的去活化光束例如可以由渦輪濾光片和圓形相移片產(chǎn)生。如以上所討論的，在執(zhí)行與照明方向呈90°的SPIM信號(hào)檢測(cè)的同時(shí)還執(zhí)行與照明方向相反的共焦檢測(cè)時(shí)，這種方式能帶來(lái)一定的優(yōu)點(diǎn)?？梢粤硗庥羞x擇性地開(kāi)啟或關(guān)閉STED-去活化光束，例如可以只在χ方向上的某行或某個(gè)像素上實(shí)現(xiàn)。由于當(dāng)去活化光束打開(kāi)或關(guān)閉時(shí)，已獲知該信息，可以將各自的數(shù)據(jù)流分開(kāi)，即分成第一數(shù)據(jù)流和第二數(shù)據(jù)流，所述第一數(shù)據(jù)流基于較厚的片光源產(chǎn)生圖像且覆蓋較大的照明區(qū)域(相比于照明焦點(diǎn)的截面)和較大的照明體積，所述第二數(shù)據(jù)流基于較薄的片光源產(chǎn)生圖像且覆蓋較小的照明區(qū)域(與照明焦點(diǎn)的截面相關(guān))和較小的照明體積，這就同時(shí)產(chǎn)生了因加入STED光束而在ζ方向上形成的高分辨率圖像，以及因沒(méi)加入 STED光束而在ζ方向上形成的低分辨率圖像，但帶來(lái)的優(yōu)點(diǎn)是物體內(nèi)照射的體積更大。除可加入或關(guān)閉STED光束外，本發(fā)明的顯微鏡還可并行產(chǎn)生η維的SPIM顯微鏡圖像和η-1維的共焦產(chǎn)生圖像，然而通過(guò)另外開(kāi)啟或關(guān)閉STED光束也可以在ζ方向上并行產(chǎn)生具有高分辨率或低分辨率的這些圖像?？偠灾?，可以同時(shí)產(chǎn)生4個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)流，用以產(chǎn)生以下數(shù)據(jù)集i)高分辨率的二維圖像(SPIM)，但物體被成像部分的體積較小；i)低分辨率的二維圖像(SPIM)，但物體被成像部分的體積較大；iii) ζ方向上高分辨率的x-t —維共焦圖像；以及iv) ζ方向上低分辨率的x-t —維共焦圖像。片光源在ζ方向上的維度不取決于χ方向上的維度，即，可以選擇不同的圖像格式，例如χ方向上的像素?cái)?shù)量為512，但ζ方向上的像素?cái)?shù)量可以更多或更少。為了實(shí)現(xiàn)ζ方向上的連續(xù)數(shù)據(jù)集，需要在ζ方向上實(shí)現(xiàn)進(jìn)給運(yùn)動(dòng)，從而保證有部分重疊(Nyquist原理)。圖9示出了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，其中與圖4相同的零部件由相同的參考數(shù)字表示。另外，除了變焦光學(xué)元件13外，還提供了照明物鏡42。該照明物鏡還可以是光學(xué)變焦的一部分，例如根據(jù)圖6所示實(shí)施例的示例。與帶有連續(xù)激光器(連續(xù)波CW)的照明系統(tǒng)相比，還可以使用脈沖激光器用于多光子熒光顯微鏡，從而傳送長(zhǎng)波長(zhǎng)但能量相對(duì)較低的激發(fā)光子，這在避免對(duì)樣品造成損傷 (這對(duì)生物樣品特別重要)時(shí)尤其適用。與檢測(cè)SPIM信號(hào)類(lèi)似，多光子信號(hào)可由可換向的鏡43從沿ζ方向延伸的檢測(cè)光束路徑44中提取，且通過(guò)光電倍增管或雪崩光電二極管45 檢測(cè)。除此之外，SPIM信號(hào)可以由照相機(jī)16檢測(cè)，如參考圖4所描述。如果照相機(jī)16工作速度足夠快，作為圖9所示的實(shí)施例的另一種變形，可以免去可換向的鏡43，取而代之地用照相機(jī)16檢測(cè)多光子信號(hào)。如果多光子照明與檢測(cè)ζ方向上的信號(hào)(即垂直于照明方向)在一起，物體上的每個(gè)照明點(diǎn)在照相機(jī)16上成像為一行，并且通過(guò)在χ方向上進(jìn)行掃描，在χ方向上延伸的物體的連續(xù)掃描行將在照相機(jī)16上連續(xù)照射成一區(qū)域，該區(qū)域需要用軟件來(lái)縮小，以使數(shù)據(jù)縮小成一行。通過(guò)ζ方向上的連續(xù)掃描， 物體的數(shù)行被檢測(cè)并且被進(jìn)一步處理成物體某一區(qū)域的圖像。簡(jiǎn)而言之，該SPIM信號(hào)檢測(cè)結(jié)構(gòu)的變形可用于具有快速照相機(jī)的多光子信號(hào)檢測(cè)，該照相機(jī)的檢測(cè)例如可以達(dá)到每秒1000張，每張格式為51&512。用于多光子信號(hào)檢測(cè)的SPIM信號(hào)檢測(cè)結(jié)構(gòu)的特殊有點(diǎn)是明顯增強(qiáng)了信號(hào)強(qiáng)度， 除其他原因外，主要有以下幾點(diǎn)為了產(chǎn)生片光源，使用數(shù)值孔徑小的照明物鏡，例如數(shù)值孔徑在0. 04NA范圍內(nèi)的物鏡。如果現(xiàn)在用SPIM檢測(cè)路徑檢測(cè)由多光子照射產(chǎn)生的信號(hào)， 所得到的信號(hào)強(qiáng)度明顯提高，因?yàn)樗褂玫奈镧R的數(shù)值孔徑已經(jīng)高得多(NA，例如1.0NA)。 這意味著信號(hào)強(qiáng)度將增大超過(guò)20倍。如果用SPIM檢測(cè)光束路徑(ζ方向上)來(lái)檢測(cè)熒光且該光被傳送至光電倍增管、 APD或APD陣列，或根據(jù)以上所描述的變形，被直接傳送至快速照相機(jī)，那么通過(guò)照明光學(xué)元件實(shí)現(xiàn)的在y方向上的信號(hào)檢測(cè)效率要高得多，這是因?yàn)檎彰飨到y(tǒng)的數(shù)值孔徑一般比 SPIM布置的檢測(cè)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑小。采用多光子檢測(cè)具有諸多優(yōu)點(diǎn)。幾乎只有在焦點(diǎn)處才能激發(fā)出熒光，因?yàn)榧ぐl(fā)需要有數(shù)個(gè)光子大約同時(shí)到達(dá)，而這只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生，或者換言之，在焦點(diǎn)以外激發(fā)的可能性非常低。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)使用紅外范圍內(nèi)的波長(zhǎng)時(shí)(散射較少)，穿透深度較大。還有一個(gè)有點(diǎn)是不需要針孔，因?yàn)樗邪l(fā)射光都被分配至照明焦點(diǎn)。這還便于從各個(gè)方向收集光束。相反，共焦顯微鏡需要阻擋降低信號(hào)強(qiáng)度的散射光和反射光。除具有使信號(hào)強(qiáng)度增大、降低照明強(qiáng)度進(jìn)而避免損傷樣品的這些優(yōu)點(diǎn)外，該方案還提供了結(jié)構(gòu)上的優(yōu)點(diǎn)，即， 已提供用于檢測(cè)的SPIM顯微鏡光學(xué)元件還可以被用來(lái)進(jìn)行多光子信號(hào)檢測(cè)，因此在不用再投入結(jié)構(gòu)成本而僅投入相對(duì)較低的軟件成本的情況下，可以具有所有這些優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)采用STED技術(shù)，甚至還能進(jìn)一步提高多光子照明的高分辨率，S卩，在檢測(cè)方向上的分辨率可以從多光子模式下的大約300nm提高到在多光子加STED模式下的僅幾個(gè) nm的分辨率。換句話(huà)說(shuō)，通過(guò)把增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度與高分辨率相結(jié)合實(shí)現(xiàn)了協(xié)同效應(yīng)，所述信號(hào)強(qiáng)度的增強(qiáng)通過(guò)SPIM檢測(cè)光學(xué)元件實(shí)現(xiàn)，所述高分辨率通過(guò)多光子模式加上采用STED模式額外增加的分辨率實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明在結(jié)構(gòu)上的具體優(yōu)點(diǎn)是將三種類(lèi)型的不同顯微鏡組合成一個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)，即，共焦顯微鏡、SPIM顯微鏡、多光子顯微鏡，同時(shí)可以在這三種類(lèi)型的顯微鏡的工作模式中加入STED光束，使分辨率提高，因此總共有六種不同的工作模式。從軟件角度考慮，還可以把由照相機(jī)16檢測(cè)的數(shù)據(jù)分成行和像素用以同時(shí)產(chǎn)生 SPIM圖像和多光子圖像。甚至可以在SPIM模式和多光子模式間切換，或者在可替代的方案中，增加一種同時(shí)在SPIM模式和多光子模式下工作的切換選擇。綜上所述，根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡使用了共焦顯微鏡的一部分，即照明光學(xué)元件，用于產(chǎn)生基于SPIM技術(shù)的圖像，其中照明光學(xué)元件還可以變成變焦光學(xué)元件。根據(jù)本發(fā)明， 還可以生成比由SPIM技術(shù)生成的圖像低一維的共焦圖像，或者在可替代的方案中，除了共焦圖像，還可以生成多光子圖像，也可以用來(lái)替代由SPIM技術(shù)生成的圖像。這樣不僅能更靈活地控制由SPIM技術(shù)生成的圖像，還可控制由共焦或多光子檢測(cè)所獲得的額外圖像信息，并且根據(jù)具體應(yīng)用，可以把SPIM和/或多光子圖像的交疊組合成最終圖像。通過(guò)增添或關(guān)閉STED光束，可以進(jìn)一步控制光束，且可以產(chǎn)生能提供給各種圖像的額外數(shù)據(jù)流，并且還具有同時(shí)產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)。由此，提供一種具有多方面應(yīng)用的顯微鏡，該顯微鏡具有使調(diào)制圖像與可大量分析的圖像信息產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的可能性。
權(quán)利要求
1.一種STED-SPIM顯微鏡，包括激發(fā)光源，其從y方向發(fā)送激發(fā)光束至待成像的物體上，照相機(jī)，其以ζ方向作為第一檢測(cè)方向檢測(cè)從所述物體上發(fā)出的熒光和/或反射光，其中ζ方向沿基本與1方向相垂直的方向延伸， 其特征在于第一 χ掃描儀，其通過(guò)在χ方向上掃描激發(fā)光束產(chǎn)生連續(xù)片光源，其中χ方向沿與y方向和ζ方向基本垂直的方向延伸，且片光源在由χ方向和y方向所限定的平面內(nèi)連續(xù)形成， 去活化光源，其從y方向發(fā)出至少一個(gè)去活化光束至物體上，使連續(xù)生成的片光源在 Z方向上更薄，其中去活化光束具有至少一個(gè)在Z方向上偏離激發(fā)光束的強(qiáng)度最大值，并且去活化光束平行于激發(fā)光束在X方向上被掃描。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，去活化光束調(diào)制器，其適于調(diào)制去活化光束，使得去活化光束的截面包括在ζ方向上的至少兩個(gè)強(qiáng)度最大值，其中在所述強(qiáng)度最大值之間具有零點(diǎn)，該零點(diǎn)位于激發(fā)光束中心處。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，適于調(diào)制去活化光束的相移片。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的STED-SPIM-顯微鏡，其特征在于，適于把激發(fā)光束調(diào)制成貝塞爾光束的激發(fā)光束調(diào)制器。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，所述激發(fā)光束調(diào)制器為可調(diào)聲梯度折射率指數(shù)(TAG)透鏡。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，所述激發(fā)光束調(diào)制器為軸錐鏡ο
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的STED-SP頂顯微鏡，其特征在于，至少一個(gè)聲光元件， 通過(guò)其適于調(diào)節(jié)至少激發(fā)光束。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，所述聲光元件為聲光偏轉(zhuǎn)器 (AOD)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，所述聲光元件為聲光可調(diào)諧濾波器(AOTF)，用于調(diào)節(jié)激發(fā)光束的頻率和強(qiáng)度。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9之一所述的STED-SPIM-顯微鏡，其特征在于，所述去活化光束具有恒定頻率。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，至少一個(gè)強(qiáng)度控制器，通過(guò)其適于調(diào)節(jié)激發(fā)光束和去活化光束的強(qiáng)度。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的STED-SPIM-顯微鏡，其特征在于，所述強(qiáng)度控制器包括聲光元件。
13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，所述去活化光束調(diào)制器為可調(diào)聲梯度折射率指數(shù)(TAG)透鏡。
14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，所述去活化光束調(diào)制器為空間光調(diào)制器(SLM)。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，適于在第一工作模式和第二工作模式間進(jìn)行切換的切換器，所述第一工作模式為未加入去活化光束的正常SPIM模式，所述第二工作模式為加入去活化光束的SPIM加STED模式。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，所述切換器適于在所述第一和第二工作模式間做永久選擇。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，所述切換器適于以特定切換頻率在所述第一和第二工作模式間自動(dòng)切換。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于圖像處理單元，其以該切換頻率根據(jù)各自的第一和第二工作模式將由照相機(jī)在第一檢測(cè)方向上檢測(cè)到的光分成兩個(gè)數(shù)據(jù)流，所述數(shù)據(jù)流同時(shí)產(chǎn)生根據(jù)第一工作模式的圖像和根據(jù)第二工作模式的圖像。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，照射光學(xué)元件包括在激發(fā)光束的光束路徑中提供的光學(xué)變焦元件，在該光學(xué)變焦元件中彼此間機(jī)械移動(dòng)透鏡組，并如此通過(guò)改變數(shù)值孔徑擴(kuò)大或縮短連續(xù)產(chǎn)生的片光源的焦距，由此在y照射方向上擴(kuò)大或縮短由片光源照射到物體上的視場(chǎng)的長(zhǎng)度。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，光探測(cè)器用于檢測(cè)由物體發(fā)出的與χ方向相反的第二檢測(cè)方向上的熒光和/或反射光形式的檢測(cè)光。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，通過(guò)應(yīng)用SPIM技術(shù)在ζ 方向上檢測(cè)到2維寬視場(chǎng)圖像的同時(shí)，并行生成物體的共焦一維圖像，該共焦一維圖像為在χ方向上延伸的一行。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，掃描儀在ζ方向上移動(dòng)物體，使得在ζ方向上在各自照射面內(nèi)生成多個(gè)彼此間隔的連續(xù)片光源，其中各個(gè)片光源和照相機(jī)之間的距離保持不變。
23.根據(jù)權(quán)利要求20至22之一所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，切換器適于在以下工作模式間切換i)與y照明方向相反的檢測(cè)光的共焦檢測(cè)；ii)ζ方向?qū)捯晥?chǎng)檢測(cè)光的SPIM檢測(cè)；iii)ζ方向?qū)捯晥?chǎng)檢測(cè)光的多光子檢測(cè)；iv)前述共焦檢測(cè)與SPIM檢測(cè)的同時(shí)檢測(cè)；以及ν)前述共焦檢測(cè)與多光子檢測(cè)的同時(shí)檢測(cè)。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的STED-SPIM顯微鏡，其特征在于，所述工作模式i)-v)均可選擇地設(shè)置形成具有或不具有額外開(kāi)啟的STED去活化光束。
全文摘要
描述了一種具有y方向照明光源和z方向檢測(cè)光照相機(jī)的SPIM顯微鏡(選擇性平面照射顯微鏡)。x掃描儀通過(guò)在x方向上掃描照明光束產(chǎn)生連續(xù)片光源。通過(guò)選擇性開(kāi)啟STED去活化光束，該片光源可選擇性地變得更薄，由此可提高光學(xué)分辨率。
文檔編號(hào)G01N21/17GK102455500SQ20111032602
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者W·克內(nèi)貝爾, W·奧斯特賴(lài)克 申請(qǐng)人:徠卡顯微系統(tǒng)復(fù)合顯微鏡有限公司