專利名稱：AB/Rh血型確認試劑卡及其制備方法
技術領域：
本發明一種血型確認試劑卡的制備及其應用。更具體的說，本發明涉及一種ABO/ Rh(D)血型確認試劑卡的組成、制備方法及其應用，涉及輸血醫學領域。
背景技術：
正確鑒定血型是安全輸血的首要步驟，輸血是臨床搶救病人生命的重要醫療手段。自1900年發現ABO血型以來，Hoktoen早在1907年就首先提出了血型鑒定對輸血治療中的重要性。Ottenberg等再1908年進一步提出了交叉配血實驗的概念，強調了血型鑒定對臨床輸血的深遠意義。ABO血型不相容在臨床輸血中會導致嚴重的即發行溶血性輸血反應，危及患者生命。因此，ABO血型的準確定型至關重要，是安全輸血的基礎和保障。同時僅次于ABO血型系統的重要血型系統，也是紅細胞系統中最為復雜的一個系統，目前國際輸血協會(ISBT)已確認1 血型抗原有49個。Mi血型系統的5種主要抗原為 D、C、E、c、e抗原。由于不規則抗體絕大多數屬于Mi血型系統的抗體，在輸入含有相應抗原的血液后，能引起嚴重的免疫性溶血反應。IgG性質的1 系統的抗體通過胎盤能力強，從而破壞胎兒具有與抗體對應抗原的紅細胞，引起嚴重的新生兒溶血病。因此進行正確的Mi分型對于減少免疫性溶血型輸血反應、對新生兒溶血病進行診斷、預防和治療具有重要的臨床意義。Mi血型鑒定還廣泛應用于器官移植方面。紅細胞表面含有D抗原為IihD陽性，紅細胞表面不含有D抗原為IihD抗原陰性。IihD陰性患者接受MiD陽性血液后，至少有20% 患者會對D抗原發生免疫應答，在第二次或多次輸入Mi陽性血液時即可發生溶血反應。另外，IihD陰性妊娠婦女在孕育Mi陽性胎兒或孕前接受過Mi陽性的血液，可產生 Ml抗體，Ml抗體主要是不完全抗體IgG，分子能透過胎盤。若再次妊娠的胎兒為Mi陽性時，此抗體通過胎盤鍵入胎兒體內，與相應的Mi陽性紅細胞發生反應，可能發生新生兒溶血病。2000年衛生部頒發的《臨床輸血技術規范》(衛醫法[2000] 184號)第四章第十五條明確規定“輸血科(血庫)要逐項核對輸血申請單、受血者和供血者血樣，復查受血者和供血者ABO血型(正反定型)。并常規檢查患者的Mi血型，正確無誤時可進行交叉配血。在國內外，有些產家生產用于ABO和Mi血型定型試劑卡，采用的凝膠為葡聚糖凝膠，此凝膠顆粒的直徑大約在20-50微米。已有的ABOAh試劑卡包含ABO正、反定型檢測試劑卡，但對于部分已知自己血型的病人，輸血前為了進一步確認血型，若繼續使用ABOAh 正、反定型檢測試劑卡，不僅增加了臨床工作量，同時也提高了血型卡生產成本。
發明內容
本發明的目的在于提供一種使用方便、靈敏度高、準確性好的ABAh血型確認試劑卡及其制備方法。本發明的技術解決方案是一種AB/I h血型確認試劑卡，其特征是試劑卡上具有至少一組微柱凝膠管，每組
3微柱凝膠管有4個微柱凝膠管，分別是含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠管、含有IgM 性質的單克隆抗B抗體的凝膠管、含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠管和用于陰性對照的含有凝膠緩沖液的凝膠管。一種ABAh血型確認試劑卡的制備方法，其特征是包括下列步驟1)凝膠緩沖液的配制所述緩沖液配方如下20mL的0. 15M磷酸鹽緩沖液氯化鈉1.75g甘氨酸 18g其中20mL 的 0. 15M 磷酸鹽緩沖液由 11. 3mL 的 0. 15M KH2PO4 和 8. 7mL 的 0. 15M Na2HPO4 組成；以上試劑用800毫升蒸餾水溶解，用IM氫氧化鈉調節pH至6. 7，最后定容至1升； 再添加0. 6g對羥基苯甲酸甲酯和0. 13g對羥基苯甲酸丙酯，添加牛血清白蛋白，添加量為使牛血清白蛋白的終濃度為3% ；得到凝膠懸浮緩沖液；2)凝膠的準備選用顆粒大小為20-50微米葡聚糖凝膠，用步驟1)配制的凝膠懸浮緩沖液浸泡后再用該凝膠懸浮緩沖液洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片，收集得到顆粒大小均勻完整呈球形的凝膠；3)抗體的選擇選擇IgM性質的單克隆抗A抗體，效價彡128選擇IgM性質的單克隆抗B抗體，效價彡128選擇IgM性質的單克隆抗D抗體，效價彡644)凝膠的配制將步驟幻制得的凝膠與步驟幻所選擇的各個抗體按照體積65 35%的比例混合，分別配制成含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠、含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠和含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠；將步驟2、制得的凝膠與步驟1)配制得到的凝膠懸浮緩沖液按照體積65 35%的比例混合，配制成含有凝膠緩沖液的凝膠。5)分裝將步驟4)中含各種抗體或含有凝膠緩沖液的凝膠分別加入到一空白卡片的不同微柱管中；得產品。本發明的優點是第一個方面標準化的凝膠緩沖液體系用于凝膠的溶脹、懸浮和洗滌，并可以長時間維持抗體以及凝膠的穩定，其特點在于①使用具有很強緩沖能力的緩沖體系，采用磷酸鹽和氨基酸組成的緩沖體系，體系的PH維持在6. 7左右。與常規輸血領域使用的枸櫞酸緩沖體系相比，具有更強的緩沖能力，有利于保證整個體系處于合適的緩沖范圍。②本發明的凝膠緩沖液具有低離子濃度體系，用氨基酸和氯化鈉作為添加劑，輔助微量的磷酸鹽維持低離子強度環境，保持凝膠顆粒呈圓球顆粒并充分溶脹，使凝膠顆粒的直徑大小控制在一定的范圍內。同時低離子強度鹽水可以增加抗原抗體之間的引力，使原來在鹽水介質中不能凝集紅細胞的抗體能夠發生凝集。可加快反應速度，縮短保溫的時間。③本緩沖液具有潤滑體系，采用一定濃度的牛血清白蛋白，使得紅細胞通過凝膠間隙時獲得合適的潤滑能力，使無凝集的紅細胞具有完全通過凝膠間隙的能力，而凝集的紅細胞則不能通過。④具有防腐作用，大量文獻證實選擇有機物苯甲酸酯類作為防腐劑，能有效防止細菌的繁衍，相對于疊氮鈉不僅具有更長時間的保存期，而且可以避免使用疊氮鈉化學防腐劑對凝膠懸浮介質體系的離子強度提升而對ABO-CDE血型鑒定試劑卡的靈敏度和特異性產生的不良影響。另一方面，為了保證本發明ABOAh(D)血型確認試劑卡的質量，在凝膠準備過程中需要選擇適當的凝膠，現所選擇的凝膠顆粒直徑為20-50微米。通過對葡聚糖凝膠顆粒進行充分溶脹，洗滌去除破損的凝膠顆粒和超大或超小凝膠顆粒。洗滌后的凝膠用懸浮緩沖液來懸浮凝膠。除了篩選凝膠的顆粒外，另外還需選擇合適效價的抗體。本發明的ABOAh(D)血型確認試劑卡之所以具有優良的特異性、靈敏度以及長達 1年半的保存期，是在于整個體系各種成分的協同作用，凝膠顆粒排列于一張卡上可以同時供兩人的ABOAh (D)血型確認定型，緩沖體系可以維持反應體系需要的pH，低鹽弄許體系可以保證凝膠顆粒得到充分溶脹且凝膠顆粒直徑在所需要的范圍內。潤滑體系可以保證凝膠顆粒之間的潤滑能力。有機防腐劑可以防止凝膠或抗體因細菌污染而失效。呈球形的凝膠可以保證凝膠顆粒之間合適的間隙。合適的抗體為抗原的檢測提供有效的保障。本ABABOAh (D)血型確認試劑卡可以用于ABO、Rh (D)血型確認，產生的陽性反應不低于3+。一般在2-25°C條件下保存有效期不低于18個月。本發明的實施為ABO、Rh(D)血型確認提供了標準化，各大醫院和采供血機構可以用本標準一致的ABOAh (D)血型確認試劑卡，準確的確認ABOAh (D)血型，為保證輸血安全創造了條件。下面結合實施例對本發明作進一步說明。
具體實施例方式一種ABAh血型確認試劑卡的制備方法，包括下列步驟1)凝膠緩沖液的配制所述緩沖液配方如下20mL的0. 15M磷酸鹽緩沖液氯化鈉1. 75g甘氨酸 18g其中20mL 的 0. 15M 磷酸鹽緩沖液由 11. 3mL 的 0. 15M KH2PO4 和 8. 7mL 的 0. 15M Na2HPO4 組成；以上試劑用800毫升蒸餾水溶解，用IM氫氧化鈉調節pH至6. 7，最后定容至1升； 再添加0. 6g對羥基苯甲酸甲酯和0. 13g對羥基苯甲酸丙酯，添加牛血清白蛋白，添加量為使牛血清白蛋白的終濃度為3% ；得到凝膠懸浮緩沖液；2)凝膠的準備
選用顆粒大小為20-50微米葡聚糖凝膠，用步驟1)配制的凝膠懸浮緩沖液浸泡后再用該凝膠懸浮緩沖液洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片，收集得到顆粒大小均勻完整呈球形的凝膠；3)抗體的選擇選擇IgM性質的單克隆抗A抗體，效價彡128選擇IgM性質的單克隆抗B抗體，效價彡128選擇IgM性質的單克隆抗D抗體，效價彡644)凝膠的配制將步驟幻制得的凝膠與步驟幻所選擇的各個抗體按照體積65 35%的比例混合，分別配制成含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠、含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠和含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠；將步驟2、制得的凝膠與步驟1)配制得到的凝膠懸浮緩沖液按照體積65 35%的比例混合，配制成含有凝膠緩沖液的凝膠。5)分裝將步驟4)中含各種抗體或含有凝膠緩沖液的凝膠分別加入到一空白卡片的不同微柱管中；得產品。6)檢測要求將分裝好的微柱凝膠管，具有與抗體相應抗原的紅細胞產生陽性反應，即紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現直線型。而與不含抗體對應抗原的紅細胞產生陰性反應，即紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部。而不含抗體只含有凝膠懸浮介質和凝膠混合物的凝膠管中紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部，呈現陰性反應。7)封口用鋁箔紙通過壓膜方式將微柱管上口密封。貼標簽標記后于2-25度保存。8)保存實驗上述完成的ABOAh血型確認試劑卡可以保存18個月，保存期間，該AB0/I h血型確認試劑卡具有以下檢測結果(1)外觀ABO/Rh血型確認試劑卡是由8個微柱管組成，凝膠均為乳白色，膠面上端有l_2mm 清澈透明的液體，凝膠顆粒之間不應有氣泡和異物。(2)靈敏度含有抗體的微柱凝膠管中，具有與抗體相應抗原的紅細胞產生陽性反應，且紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現直線型。(3)特異性含抗體的微柱凝膠管中，具有與抗體相應抗原的紅細胞產生陽性反應，即紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現直線型。與不含抗體對應抗原的紅細胞產生陰性反應，即紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部。而不含抗體只含有凝膠懸浮介質和凝膠混合物的凝膠管中紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部，呈現陰性反應。上述AB0/I h血型確認試劑卡使用方法
UABO/Rh血型確認試劑卡可以由二組共8個凝膠管組成，其中兩管含IgM性質的抗A抗體的凝膠，兩管是含IgM性質的抗B抗體的凝膠，兩管是含IgM性質的抗D抗體的凝膠，兩管用于陰性對照僅含凝膠緩沖液的凝膠。即第一、五管是含抗A抗體的凝膠，第二、六管是含抗B抗體的凝膠，第三、七管是含抗D抗體的凝膠，第四、八管是陰性對照管，可供兩份血樣同時進行血型確認。2、用低離子鹽溶液(LISQ或生理鹽水(賂)將待測者紅細胞配制成0. 8% (ν/ν)， 分別加入第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八支微管中，50μ L/管。3、用微柱凝膠卡專用離心機離心，900rpm 2min, 1500rpm3min，取出后肉眼判定結
果，記錄。4、結果判斷
權利要求
1.一種AB/I h血型確認試劑卡，其特征是試劑卡上具有至少一組微柱凝膠管，每組微柱凝膠管有4個微柱凝膠管，分別是含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠管、含有IgM 性質的單克隆抗B抗體的凝膠管、含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠管和用于陰性對照的含有凝膠緩沖液的凝膠管。
2.—種AB/I h血型確認試劑卡的制備方法，其特征是包括下列步驟1)凝膠緩沖液的配制所述緩沖液配方如下·20 mL的0. 15 M磷酸鹽緩沖液氯化鈉1. 75 g甘氨酸18 g其中20 mL的0. 15 M磷酸鹽緩沖液由11.3 mL的0. 15 M KH2PO4和8. 7 mL的0. 15 M Na2HPO4 組成；以上試劑用800毫升蒸餾水溶解，用1 M氫氧化鈉調節pH至6. 7，最后定容至1升； 再添加0. 6g對羥基苯甲酸甲酯和0. 13g對羥基苯甲酸丙酯，添加牛血清白蛋白，添加量為使牛血清白蛋白的終濃度為3% ；得到凝膠懸浮緩沖液；2)凝膠的準備選用顆粒大小為20-50微米葡聚糖凝膠，用步驟1)配制的凝膠懸浮緩沖液浸泡后再用該凝膠懸浮緩沖液洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片，收集得到顆粒大小均勻完整呈球形的凝膠；3)抗體的選擇選擇IgM性質的單克隆抗A抗體，效價> 128 選擇IgM性質的單克隆抗B抗體，效價> 128 選擇IgM性質的單克隆抗D抗體，效價> 644)凝膠的配制將步驟2)制得的凝膠與步驟3)所選擇的各個抗體按照體積65 35%的比例混合，分別配制成含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠、含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠和含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠；將步驟2)制得的凝膠與步驟1)配制得到的凝膠懸浮緩沖液按照體積65 35%的比例混合，配制成含有凝膠緩沖液的凝膠；5)分裝將步驟4)中含各種抗體或含有凝膠緩沖液的凝膠分別加入到一空白卡片的不同微柱管中；得產品。
全文摘要
本發明公開了一種AB/Rh血型確認試劑卡及其制備方法，試劑卡上具有至少一組微柱凝膠管，每組微柱凝膠管有4個微柱凝膠管，分別是含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠管、含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠管、含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠管和用于陰性對照的含有凝膠緩沖液的凝膠管。本發明的實施為ABO、Rh(D)血型確認提供了標準化，各大醫院和采供血機構可以用本標準一致的ABO/Rh(D)血型確認試劑卡，準確的確認ABO/Rh(D)血型，為保證輸血安全創造了條件。
文檔編號G01N33/80GK102331505SQ20111032216
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者施秀英, 朱曉霞, 王惠民 申請人:江蘇中盛醫學診斷試劑有限公司