專利名稱：Abo-cde血型鑒定試劑卡及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種血型定型卡的制備及其應用。更具體的說，本發明涉及一種 ABO-⑶E血型定型試劑卡的組成、制備方法及其應用，涉及輸血醫學領域。
背景技術：
ABO血型系統和Rh血型系統是人類最為重要的兩個血型系統，高度的免疫原性使它們具有重要的臨床意義，尤其是與臨床急救輸血、器官移植等關系較為密切。因此，開展 ABO血型及Rh血型抗體的研究對臨床血型鑒定、血型理論研究及應用血型抗體預防和治療新生兒溶血病等具有重要意義。自1900年發現ABO血型以來，Hoktoenl907年先提出了血型鑒定在輸血治療中的重要性。Ottenberg等再1908年進一步提出了交叉配血實驗的概念，強調了血型鑒定對臨床輸血的深遠意義。輸血是臨床搶救病人生命的重要醫療手段之一，正確鑒定血型是安全輸血的首要步驟，ABO血型不相容在臨床輸血中會導致嚴重的即發性溶血性輸血反應，危及患者生命。因此，ABO血型的準確定型至關重要，是安全輸血的基礎和保障。Levine等于1939年發現了人類的Rh血型，之后證明該血型是僅次于ABO血型的重要血型，也是紅細胞系統中最為復雜的一個系統，目前國際輸血協會(ISBT)已確認Rh血型抗原有49個。Rh血型系統的5種主要抗原為D、C、E、c、e抗原，其中抗原D抗原性最強。 紅細胞表面含有Rh陽性抗原，紅細胞表面不含有Rh陰性抗原，當Rh陰性患者接受Rh陽性血液后，至少有20%患者會對Rh抗原發生免疫應答，在第二次或多次輸入Rh陽性血液時即可發生溶血反應。另外，Rh陰性妊娠婦女在孕育Rh陽性胎兒或孕前接受過Rh陽性的血液，可產生 Rh抗體，Rh抗體主要是不完全抗體IgG，分子能透過胎盤。若再次妊娠的胎兒為Rh陽性時，此抗體通過胎盤鍵入胎兒體內，與相應的Rh陽性紅細胞發生反應，可能發生新生兒溶血病。2000年衛生部頒發的《臨床輸血技術規范》(衛醫法[2000] 184號)第四章第十五條明確規定“輸血科(血庫)要逐項核對輸血申請單、受血者和供血者血樣，復查受血者和供血者ABO血型(正反定型)。并常規檢查患者的Rh血型，正確無誤時可進行交叉配血。在國內外，有些產家已采用的凝膠為葡聚糖凝膠，此凝膠顆粒的直徑大約在20-50 微米，生產了用于ABO血型定型和Rh系列定型的ABO/Rh血型定型檢測試劑卡，但已有的卡僅進行ABO正定型，不進行ABO反定型，降低了 ABO血型定型的準確性，容易導致ABO血型的錯誤。此外，已有的ABO/Rh血型檢測卡僅進行D (Rhl)的鑒定，但沒有Rh(Rh2、Rh3)系列的定型。
發明內容
本發明的目的在于提供一種使用方便、靈敏度高、準確性好的ABO-CDE血型鑒定試劑卡及其制備方法。
本發明的技術解決方案是一種ABO-CDE血型鑒定試劑卡，其特征是試劑卡上具有8個微柱凝膠管，分別是 一管為含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗C抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗E抗體的凝膠管、一管為用于陰性對照的含有凝膠緩沖液的凝膠管、兩管為用于反定型含有凝膠緩沖液的凝膠管。一種ABO-⑶E血型鑒定試劑卡的制備方法，其特征是包括下列步驟1)凝膠緩沖液的配制所述緩沖液配方如下20mL的0. 15M磷酸鹽緩沖液氯化鈉1.75g甘氨酸18g其中20mL 的 0. 15M 磷酸鹽緩沖液由 11. 3mL 的 0. 15M KH2PO4 和 8. 7mL 的 0. 15M Na2HPO4 組成；以上試劑用800毫升蒸餾水溶解，用IM氫氧化鈉調節pH至6. 7，最后定容至1升； 再添加0. 6g對羥基苯甲酸甲酯和0. 13g對羥基苯甲酸丙酯，添加牛血清白蛋白，添加量為使牛血清白蛋白的終濃度為3% ；得到凝膠懸浮緩沖液；2)凝膠的準備選用顆粒大小為20-50微米的葡聚糖凝膠，用步驟1)配制的凝膠緩沖液充分浸泡后再用該緩沖液洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片，收集得到顆粒大小均勻完整呈球形的凝膠；3)抗體的選擇選擇IgM性質的單克隆抗A抗體，效價彡128選擇IgM性質的單克隆抗B抗體，效價彡128選擇IgM性質的單克隆抗D抗體，效價彡64選擇IgM性質的單克隆抗C抗體，效價彡64選擇IgM性質的單克隆抗E抗體，效價彡644)凝膠的配制將步驟2)制備的凝膠與步驟3)所選擇的各個抗體按照體積65% 35%的比例混合，分別配制成一管含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗C抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗E抗體的凝膠；將2)制備的凝膠與1)配制的凝膠緩沖液按照上面相同的比例混合，配制成三管含有凝膠懸浮介質的凝膠，其中一管用于陰性對照，兩管用于反定型鑒定；5)分裝將步驟4)中含各種抗體或含有凝膠緩沖液的凝膠管分別加入到一空白卡片的8 個微柱管中，形成具有8個微柱凝膠管的ABO-CDE血型定型檢測試劑卡。本發明的優點是一個方面標準化的凝膠緩沖液體系用于凝膠的溶脹、懸浮和洗滌，并可以長時間維持抗體以及凝膠的穩定，其特點在于①使用具有很強緩沖能力的緩沖體系，采用磷酸鹽和氨基酸組成的緩沖體系，體系的PH維持在6. 7左右。與常規輸血領域使用的枸櫞酸緩沖體系相比，具有更強的緩沖能力，有利于保證整個體系處于合適的緩沖范圍。②本發明的凝膠緩沖液具有低離子濃度體系，用氨基酸和氯化鈉作為添加劑，輔助微量的磷酸鹽維持低離子強度環境，保持凝膠顆粒呈圓球顆粒并充分溶脹，使凝膠顆粒的直徑大小控制在一定的范圍內。同時低離子強度鹽水可以增加抗原抗體之間的引力，使原來在鹽水介質中不能凝集紅細胞的抗體能夠發生凝集。可加快反應速度，縮短保溫的時間。③本緩沖液具有潤滑體系，采用一定濃度的牛血清白蛋白，使得紅細胞通過凝膠間隙時獲得合適的潤滑能力，使無凝集的紅細胞具有完全通過凝膠間隙的能力，而凝集的紅細胞則不能通過。④具有防腐作用，大量文獻證實選擇有機物苯甲酸酯類作為防腐劑，能有效防止細菌的繁衍，相對于疊氮鈉不僅具有更長時間的保存期，而且可以避免使用疊氮鈉化學防腐劑對凝膠懸浮介質體系的離子強度提升，從而對ABO-CDE血型鑒定試劑卡的靈敏度和特異性產生的不良影響。另一方面，為了保證本發明ABO-CDE血型鑒定試劑卡的質量，在凝膠準備過程中需要選擇適當的凝膠，現所選擇的凝膠顆粒直徑為20-50微米。通過對葡聚糖凝膠顆粒進行充分溶脹，洗滌去除破損的凝膠顆粒和超大或超小凝膠顆粒。洗滌后的凝膠用懸浮緩沖液來懸浮凝膠。除了篩選凝膠的顆粒外，另外還需選擇合適效價的抗體。本發明的ABO-⑶E血型鑒定試劑卡之所以具有優良的特異性、靈敏度以及長達1 年半的保存期，是在于整個體系各種成分的協同作用，凝膠顆粒排列于一張卡上可以保證僅使用一張卡就能完成ABO-CDE血型定型，緩沖體系可以維持反應體系需要的pH，低鹽弄許體系可以保證凝膠顆粒得到充分溶脹且凝膠顆粒直徑在所需要的范圍內。潤滑體系可以保證凝膠顆粒之間的潤滑能力。有機防腐劑可以防止凝膠或抗體因細菌污染而失效。呈球形的凝膠可以保證凝膠顆粒之間合適的間隙。合適的抗體為抗原的檢測提供有效的保障。本ABO-⑶E血型鑒定試劑卡可以用于ABO-⑶E血型鑒定，產生的陽性反應不低于 3+。一般在2-25°C條件下保存有效期不低于18個月。本發明的實施為ABO-⑶E血型鑒定提供了標準化，各大醫院和采供血機構可以用本標準一致的ABO-⑶E血型鑒定試劑卡，進行準確的ABO-⑶E血型鑒定，為保證輸血安全創造了條件。下面結合實施例對本發明作進一步說明。
具體實施例方式一種ABO-⑶E血型鑒定試劑卡的制備方法，包括下列步驟1)凝膠緩沖液的配制所述緩沖液配方如下20mL的0. 15M磷酸鹽緩沖液氯化鈉1. 75g
甘氨酸18g其中20mL 的 0. 15M 磷酸鹽緩沖液由 11. 3mL 的 0. 15M KH2PO4 和 8. 7mL 的 0. 15M Na2HPO4 組成；以上試劑用800毫升蒸餾水溶解，用IM氫氧化鈉調節pH至6. 7，最后定容至1升； 再添加0. 6g對羥基苯甲酸甲酯和0. 13g對羥基苯甲酸丙酯，添加牛血清白蛋白，添加量為使牛血清白蛋白的終濃度為3% ；得到凝膠懸浮緩沖液；2)凝膠的準備選用顆粒大小為20-50微米的葡聚糖凝膠，用步驟1)配制的凝膠緩沖液充分浸泡后再用該緩沖液洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片，收集得到顆粒大小均勻完整呈球形的凝膠；3)抗體的選擇選擇IgM性質的單克隆抗A抗體，效價彡128選擇IgM性質的單克隆抗B抗體，效價彡128選擇IgM性質的單克隆抗D抗體，效價彡64選擇IgM性質的單克隆抗C抗體，效價彡64選擇IgM性質的單克隆抗E抗體，效價彡644)凝膠的配制將步驟2)制備的凝膠與步驟3)所選擇的各個抗體按照體積65% 35%的比例混合，分別配制成一管含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗C抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗E抗體的凝膠；將2)制備的凝膠與1)配制的凝膠緩沖液按照上面相同的比例混合，配制成三管含有凝膠懸浮介質的凝膠，其中一管用于陰性對照，兩管用于反定型鑒定；5)分裝將步驟4)中含各種抗體或含有凝膠緩沖液的凝膠管分別加入到一空白卡片的8 個微柱管中，形成具有8個微柱凝膠管的ABO-CDE血型定型檢測試劑卡。6)半成品檢測要求分裝好的微柱凝膠管具有抗體與相應抗原的紅細胞產生陽性反應，即紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現直線型。而與不含抗體對應抗原的紅細胞產生陰性反應，即紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部。而不含抗體只含有凝膠緩沖液和凝膠混合物的凝膠管中紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部，呈現陰性反應。7)封口用鋁箔紙微柱管上口密封。貼標簽標記后于2_25°C保存。8)保存實驗上述完成的ABO-⑶E血型鑒定試劑卡可以在于2-25°C下保存18個月，保存期間， 該ABO-⑶E血型鑒定試劑卡具有以下檢測結果(1)外觀ABO-⑶E血型鑒定試劑卡是由8個微柱管組成，凝膠均為乳白色，膠面上端有l-2mm清澈透明的液體，凝膠顆粒之間不應有氣泡和異物。(2)靈敏度含有抗體的微柱凝膠管中，具有與抗體相應抗原的紅細胞產生陽性反應，且紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現直線型。(3)特異性含抗體的微柱凝膠管中具有與抗體相應抗原的紅細胞產生陽性反應，即紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現直線型；與不含抗體對應抗原的紅細胞產生陰性反應，即紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部。而不含抗體只含有凝膠緩沖液的凝膠管中紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部，呈現陰性反應。上述ABO-⑶E血型鑒定試劑卡使用方法1、ABO-⑶E血型鑒定試劑卡由8個凝膠管組成，其中一管含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗C抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗E抗體的凝膠、兩管用于反定型的含凝膠緩沖液的凝膠管和一管用于陰性對照的含有凝膠緩沖液的凝膠管。即第一管是含抗A抗體的凝膠，第二管是含抗B抗體的凝膠，第三管是含抗D抗體的凝膠，第四管是含抗C抗體的凝膠、第五管是含抗E抗體的凝膠、第六管是用于陰性對照、第七、八管用于反定型鑒定。2、用低離子鹽溶液(LISS)或生理鹽水(NS)將待測者紅細胞配制成0. 8% (ν/ν)， 分別加入第一、第二、第三、第四、第五和第六支微管中，50μ L/管。3、將A型、B型紅細胞試劑用LISS溶液或NS調節至終濃度為0. 8%，分別加到第七和第八支微管中，50yL/管。4、將待檢者血清/血漿分別加入第七和第八支微管中，50μ L/管。混勻后，室溫孵育 IOmin05、用微柱凝膠卡專用離心機離心，900rpm 2min, 1500rpm3min，取出后肉眼判定結
果，記錄。6、結果判斷陽性結果紅細胞懸浮在凝膠表面或膠中。陰性結果紅細胞沉積于微柱凝膠的底部。7、血型判斷見下表ABO 系列
權利要求
1.一種ABO-CDE血型鑒定試劑卡，其特征是試劑卡上具有8個微柱凝膠管，分別是 一管為含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗C抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗E抗體的凝膠管、一管為用于陰性對照的含有凝膠緩沖液的凝膠管、兩管為用于反定型含有凝膠緩沖液的凝膠管。
2.—種權利要求1所述的ABO-⑶E血型鑒定試劑卡的制備方法，其特征是包括下列步驟1)凝膠緩沖液的配制所述緩沖液配方如下20 mL的0. 15 M磷酸鹽緩沖液氯化鈉1. 75 g甘氨酸18 g其中20 mL的0. 15 M磷酸鹽緩沖液由11.3 mL的0. 15 M KH2PO4和8. 7 mL的0. 15 M Na2HPO4 組成；以上試劑用800毫升蒸餾水溶解，用1 M氫氧化鈉調節pH至6. 7，最后定容至1升； 再添加0. 6g對羥基苯甲酸甲酯和0. 13g對羥基苯甲酸丙酯，添加牛血清白蛋白，添加量為使牛血清白蛋白的終濃度為3% ；得到凝膠懸浮緩沖液；2)凝膠的準備選用顆粒大小為20-50微米的葡聚糖凝膠，用步驟1)配制的凝膠緩沖液充分浸泡后再用該緩沖液洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片，收集得到顆粒大小均勻完整呈球形的凝膠；3)抗體的選擇選擇IgM性質的單克隆抗A抗體，效價> 128 選擇IgM性質的單克隆抗B抗體，效價> 128 選擇IgM性質的單克隆抗D抗體，效價> 64 選擇IgM性質的單克隆抗C抗體，效價> 64 選擇IgM性質的單克隆抗E抗體，效價> 644)凝膠的配制將步驟2)制備的凝膠與步驟3)所選擇的各個抗體按照體積65% 35%的比例混合， 分別配制成一管含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗B 抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗C 抗體的凝膠、一管含有IgM性質的單克隆抗E抗體的凝膠；將2)制備的凝膠與1)配制的凝膠緩沖液按照上面相同的比例混合，配制成三管含有凝膠懸浮介質的凝膠，其中一管用于陰性對照，兩管用于反定型鑒定；5)分裝將步驟4)中含各種抗體或含有凝膠緩沖液的凝膠管分別加入到一空白卡片的8個微柱管中，形成具有8個微柱凝膠管的ABO-CDE血型定型檢測試劑卡。
全文摘要
本發明公開了一種ABO-CDE血型鑒定試劑卡，試劑卡上具有8個微柱凝膠管，分別是一管為含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗D抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗C抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質的單克隆抗E抗體的凝膠管、一管為用于陰性對照的含有凝膠緩沖液的凝膠管、兩管為用于反定型含有凝膠緩沖液的凝膠管。本發明的實施為ABO-CDE血型鑒定提供了標準化，各大醫院和采供血機構可以用本標準一致的ABO-CDE血型鑒定試劑卡，進行準確的ABO-CDE血型鑒定，為保證輸血安全創造了條件。
文檔編號G01N33/80GK102331504SQ20111032195
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者施秀英, 朱曉霞, 王惠民 申請人:江蘇中盛醫學診斷試劑有限公司