專利名稱：一種用于沙門菌快速檢測的Nano/ALISA方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測技術領域，涉及利用適配體代替抗體進行沙門菌捕獲和以納米金偶聯體作為信號報告基團，特別涉及應用該技術建立的一種基于納米/適配體聯合免
口Lfe (nano/aptamer-linked immobilized sorbent assay, Nano/ALISA)白勺菌快速檢測方法及用于沙門菌快速檢測的試劑盒。
背景技術：
沙門菌(Salmonella)為常見的人畜共患病原菌，廣泛存在于各類動物的腸道內，以及被動物糞便污染的水和土壤中，可導致腸炎、腸熱癥甚至敗血癥等。它的感染發病占細菌性食物中毒的主要地位，由其引起的傷寒病已被我國《傳染病防治法》列入乙類傳染病之一，在發展中國家和發達國家都仍然是嚴重的公共衛生問題。美國每年報道的沙門菌感染約有四萬例，但由于許多感染者沒有就醫和報告，實際感染者數是這個數字的20倍以上。2008年9月美國發生了由鼠傷寒沙門菌導致的“花生醬中毒事件”，這是美國10年來最嚴重的沙門菌病疫情，導致了美國歷史上最大的食品召回事件，并迫使奧巴馬政府對現行的食品安全法進行修正。在我國，特別是廣大農村基層，因沙門菌引起的感染時有發生，其傳播速度快、波及面廣，一旦發生，很容易引起擴散流行。張肅等對1985年 2000年我國食物中毒情況重點分析，在微生物性食物中毒的發病人數中，沙門菌最為嚴重；王世杰等對1994年 2003年我國766起細菌性食物中毒的分析結果顯示，沙門菌居第二位。沙門菌對人類的健康構成威脅，而且也給國家帶來沉重的經濟負擔，故對沙門菌暴發的預防，以及對第一例病例的快速確診并對可疑病員進行排查，作到早發現、早治療、早隔離、快速查找傳染源、切斷傳播途徑等對控制本病極為重要。目前沙門菌的實驗室檢測仍以檢出病原菌為主要依據，其檢測程序包括標本采集接種、分離培養、生化鑒定，血清學分型等多個環節，最快也要四到八天才能作出最終檢驗診斷。近年來，世界各地學者針對沙門菌的快速檢測技術展開了大量研究工作，利用特異的生物識別元件來進行快速診斷，如分子生物學和免疫學檢測技術等。通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)可以把痕量的遺傳物質迅速擴增百萬倍，使原本無法進行的各種分析檢測項目得以實施。但PCR往往需要先提取沙門菌的DNA或RNA，利用已報道的特異引物進行擴增，根據擴增結果可以進行定性或定量檢測，可以檢測< 100CFU的沙門菌。雖然PCR具有快速、靈敏、特異等優點，但是在檢測沙門菌方面仍有缺陷，如需要專業人員操作，所用的試劑和儀器昂貴，檢測結果假陽性高等，都是研究者們面臨的難題。免疫學檢測技術則利用抗原和抗體之間的特異性反應實現沙門菌的快速檢測，最常用的為酶聯免疫吸附技術(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，已報道的檢測靈敏度為IO5CFU Iiir1tjELISA技術自20世紀70年代出現以來，就因其特異性高、敏感性強、簡單快速，不需要昂貴儀器設備，特別適合于對大量樣本的篩檢工作等優點而備受關注。此外，免疫磁分離(immimomagnetic separation)技術能在各種樣品中捕獲特異菌體，起到濃縮的作用，往往與ELISA技術聯用。但是ELISA技術的靈敏度和特異性往往依賴于抗體和抗原之間親和力的大小，且抗體具有制備困難、標記繁瑣、容易變性等缺點，這都是我們需要改進的關鍵；另外，ELISA檢測的目標難以像核酸一樣直接通過PCR進行擴增，所以信號放大效率受到了很大限制，而沙門菌在實際樣本中往往濃度較低。因此，迫切需要發展新的簡便、快速、靈敏的方法來滿足對沙門菌的檢測。適配體(aptamer)是一類具有高度親和力和能夠高度特異性識別結合目標分子的寡核苷酸序列，其目標分子范圍廣，從小分子，如藥物和染料；到復雜的生物大分子，如酶分子，多肽以及蛋白質，甚至完整的細胞。這種人工受體是通過一種新的體外篩選技術-指數富集配體系統進化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，從隨機單鏈寡核苷酸文庫中篩選得到的。由于適配體具有與抗體相同或優于抗體的選擇性和親和力，所以能夠取代抗體作為一種新型分子識別元件。另外，與抗體相比，適配體還具有幾個優點，如熱穩定性增加、耐廣泛的PH值和鹽濃度以及合成、修飾和固化方法簡便。因此，適配體與ELISA方法的結合成為了一個新的發展趨勢。2006年，Vivekananda等首次在文章中提出適配體聯合免疫吸附法(aptamer-1 inked immobilized sorbentassay, ALISA)這個概念，并成功地檢測了土拉熱弗朗西絲菌。納米材料(nanomaterials)是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1 IOOnm)或由它們作為基本單元構成的具有特殊性能的材料。由于納米材料的小尺寸以及特殊的表面狀態，使其表現出許多既不同于微觀粒子又不同于宏觀物體的特性，例如量子尺寸效應、表面效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應等。納米技術的快速發展為生物檢測的信號放大方式提供了新的選擇，兩者的結合已成為新的發展趨勢。在生物檢測領域，利用納米材料極大的比表面積，研究者們可以更加方便地構建多種生物分子的偶聯體，可在裝載目標識別分子(如寡核苷酸探針、抗體等)的同時攜帶大量信號分子(如可以產生顯色或熒光信號的蛋白質)用于信號增強，這就為發展高靈敏度的生物學檢測方法提供了可能。其中，納米金(gold nanoparticles,AuNPs)因其具有優異的光學性質、電學性質、化學活性、生物兼容性，使其在生物領域的應用最為廣泛，最早可以追溯到上世紀七十年代免疫金在生物成像中的應用。納米金還具有獨特的生物兼容性，能廣泛地應用于DNA、抗體、抗原和酶等物質的標記。近年來，國內外的研究機構相繼報道了利用納米金為載體偶聯多個生物分子進行信號放大的生物學檢測策略。2003年以來，Mirkin研究組報道了一系列基于“抗體-納米金-條碼DNA”偶聯結構的高靈敏度蛋白檢測策略，利用納米金表面裝載的大量作為信號分子的條碼DNA，使檢測信號大大增強。2009年，Chim-Ping Jia等將p53抗體和親和素化HRP共組裝在納米金粒子表面，制備成p53抗體-納米金-親和素化HRP復合納米結構，2h內即可檢測5pg πιΓ1的p53，比傳統ELISA的最低檢測限降低了 25倍。
發明內容
本發明要解決的第一個技術問題是提供用于捕獲沙門菌的特異適配體標記磁性顆粒。免疫磁分離技術能在各種樣品中捕獲特異菌體，起到濃縮的作用；適配體可通過自動化的固相合成大規模制備，不依賴于活體動物或活細胞，批間誤差小，重復性好，成本低廉，且穩定性好，變性可逆，易于進行生物化學修飾。因此，本發明通過化學或生物學方法將沙門菌特異適配體與磁性顆粒偶聯。此步驟中為使磁性顆粒表面的適配體盡量保持豎立而不是倒伏在磁性顆粒表面，以利于其捕獲沙門菌，選用間隔DNA(spacer DNA)來封閉磁性顆粒的空余位點，通常為20個T或A ；相應地在適配體標記端也設計連續的相同堿基，提高適配體捕獲沙門菌的效率。本發明中具有特異性識別沙門菌功能的適配體并不局限于一種具體的適配體，而包括所有能夠通過合適的方法修飾到磁性顆粒表面沙門菌的特異適配體。修飾方法如戊二醛交聯法、碳化二亞胺法、親和素-生物素法等。本發明要解決的第二個技術問題是提供用于沙門菌檢測的納米金偶聯體。由于納米金極大的比表面積和良好的生物相容性，我們可以方便地構建多種生物分子的偶聯體，可在裝載目標識別分子(如沙門菌的特異適配體、抗體等)的同時攜帶大量信號分子(如過氧化物酶、堿性磷酸酶等)用于信號增強。因此本發明的納米金偶聯體可以作為一種信號放大試劑，通過催化劑催化的底物反應或自身反應起到信號放大的作用。根據本發明，納米金與目標識別分子、信號分子的偶聯連接同現有的方法。其中，適配體序列修飾有巰基，與納米金通過金硫鍵連接。通常將原納米金溶液離心濃縮得到大約IOnM的納米金溶液，放置在4°C下備用；將巰基化適配體加入納米金溶液混合過夜(16h)，然后加鹽老化，室溫放置40h，接著離心洗滌3次，最后以實驗中用的反應液懸浮，4°C保存。而蛋白質可以很容易地通過金硫鍵、靜電力等多種作用力與納米金粒子偶聯。通常調節納米金溶液的PH值略高于蛋白質等電點，加入蛋白質溶液37°C振蕩孵育10分鐘，4°C靜置過夜；加5% PEG至終濃度0. 5%，混勻，4°C放置1小時；離心洗滌3次，最后以儲存溶液重懸。所述的儲備液優選含有0. 5% BSA, 2. 5%蔗糖，0. l%PEG,pH 7. 4的PBS緩沖液。另外，需要提高納米金的PH值時可用0. IM K2CO3，需要降低納米金的pH值時可用0. IMHCl。本發明的第一個目的是公開一種新型的免疫學檢測技術(Nano/ALISA)，以及利用此技術進行快速檢測沙門菌的方法。這種新方法可包括以下步驟1.用沙門菌特異適配體捕獲沙門菌，通過磁性顆粒進行分離富集沙門菌；2.加入沙門菌的特異一抗進行反應；3.加入上述本發明的納米金偶聯體，獲得適用于高靈敏度免疫檢測“三明治”結構；4.通過納米金偶聯體上的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質催化底物生成一定顏色或熒光并進行檢測。本發明的第二個目的是提供一種基于Nano/ALISA技術的沙門菌快速檢測試劑盒，它含有1.特異適配體修飾的磁性顆粒，其粒徑約1 1. 5 μ m，濃度約為5mg πιΓ1 ；2.沙門菌的特異一抗，最適濃度2μ g πιΓ1 ；3. 二抗-納米金-報告基團的偶聯體，最佳稀釋度為1 10;4.封閉液，其組分為含有BSA的IOmM PBS (pH 7. 4)溶液；5.洗滌液，其組分為含有0. 05% Tween 20的IOmM PBS(pH 7. 4)溶液；6.底物，納米金偶聯體中報告基團相對應的底物，如3，3' ,5,5'-四甲基聯苯胺(3,3' ,5,5' -tetramethylbenzidine, TMB)等；7.陽性對照菌液和陰性對照菌液；
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8.說明書。用于本發明的封閉液、洗滌液沒有特別限制，可以采用本領域相對應的封閉液、洗滌液。此外，試劑盒中的封閉液和洗滌液可以是濃縮或稀釋液。相對于現有技術，本發明提供了一種成本低廉、操作簡單、靈敏度高、特異性強的快速檢測沙門菌的新型免疫學方法和試劑盒；并首次提出了以適配體、病原菌和納米金構成三明治結構以用于特異性檢測病原菌的新型免疫學方法，為病原菌的檢測提供了一種新的思路。與傳統的ELISA方法相比，本發明以Nano/ALISA技術作為一種新型的多級信號放大手段，有望在僅需類似于ELISA技術的操作和設備條件下實現對各種物質快速、靈敏地檢測。這種便利性有利于該技術的應用和推廣，特別適合疫區病原菌的現場檢測。
下面結合附圖對本發明做進一步說明。圖1 (a)為納米金的AFM圖；(b)為納米金的TEM圖；圖2為納米金的紫外-可見光吸收光譜圖；圖3 (a)為二抗的最適穩定量；(b)為HRP的最適穩定量；圖4為納米金偶聯體上修飾的二抗和HRP比值優化結果；圖5為一抗濃度優化結果；圖6為基于Nano/ALISA技術的鼠傷寒沙門菌快速檢測方法的工作示意圖；圖7為對本發明檢測方法的特異性進行研究的結果；圖8為對本發明檢測方法的靈敏度進行分析的結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發明的限定。以下是部分本發明實施例中所用的儀器和設備，其他未注明的實驗條件按照常規或以其制造廠商所建議的條件。納米金溶液進行400nm SOOnm波長范圍的掃描所用儀器為紫外可見分光光度計(U-3010，Hitachi)，用石英黑體微量比色皿進行測量，樣品體積100 μ 1，室溫，參數設置波段掃描，400nm 800nm, Scan Speed 1200nm/min, Sampling Interval 2nm, SlitWidth 0. 5nm, Lamp Change 339nm。紫外可見光波長范圍內吸光度檢測所用儀器為酶標儀(Genios, TECAN)，用96孔板或384孔板進行測量，室溫。納米金的粒徑和形狀進行表征所用儀器為透射電子顯微鏡(JEM-2011，JE0L)和原子力顯微鏡(NanoScope Illa，Veeco)。15nm納米金采用檸檬酸三鈉法制備將IOOml的0. 01 %的氯金酸水溶液加入250ml圓底燒瓶，加熱至劇烈沸騰后，劇烈攪拌下快速加入3. 5ml的1 %檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱攪拌15min后，停止加熱，繼續攪拌30min后靜置，室溫自然冷卻。用0. 22 μ m濾膜過濾，4°C保存。根據此法制備所得的納米金利用原子力顯微鏡和透射電鏡對其粒徑和形狀進行表征，如圖1所示，粒徑比較均一，大約在15 20nm之間；采用紫外-可見光光譜分光光度計表征樣品對應的特征吸收峰(如圖2所示)。金納米粒子對應的消光系數￡52(|值取3. 64X IO8L modern-1，根據朗伯-比爾定律以及溶膠在520nm處的吸光度，可以計算出金溶膠的濃度為2. 2nM。所用各種溶液成分如表1所示。表1溶液成分表
權利要求
1.一種基于Nano/ALISA技術的沙門菌快速檢測方法，其特征在于，依次包括以下步驟(1)將沙門菌的特異適配體修飾到磁性顆粒表面；(2)加入標本進行反應；(3)加入沙門菌的特異一抗進行反應；(4)加入二抗-納米金-報告基團的偶聯體進行反應；(5)加入特異性底物進行反應，或直接記錄此時的光信號。
2.根據權利要求1所述的基于Nano/ALISA技術的沙門菌快速檢測方法，其特征在于，首次提出了以適配體、病原菌和納米金構成三明治結構以用于特異性檢測病原菌的新型免疫學方法。
3.根據權利要求1所述的基于Nano/ALISA技術的沙門菌快速檢測方法，其特征在于，步驟⑷所述納米金的粒徑為15 20nm。
4.根據權利要求1所述的基于Nano/ALISA技術的沙門菌快速檢測方法，其特征在于，步驟(4)所述報告基團為能催化底物生成具有顏色或熒光信號的酶，或具有自發光性能的熒光蛋白。
5.根據權利要求1所述的基于Nano/ALISA技術的沙門菌快速檢測方法，其特征在于，步驟(4)所述二抗-納米金-報告基團的偶聯體的制備方法包括下列步驟(1)將二抗和報告基團按一定比例混合，加入到納米金溶液中，調節PH值，37°C振蕩孵育10min，4°C靜置過夜；(2)加入封閉液封閉納米金表面的空余的結合位點；(3)離心洗滌去除未結合物質；(4)加儲存液混勻，置于4°C保存。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征是步驟(1)所述的二抗和報告基團的摩爾數分別為納米金的50 100倍和200 400倍，pH值為8. 0 9. 0。
7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征是步驟(3)所述的離心條件為12000rpm離心 20mino
8.根據權利要求5所述的制備方法，其特征是步驟C3)和(4)所述的洗滌液和儲存液組成為0.5%牛血清白蛋白2. 5%蔗糖，0. 1% PEG,10mM PBS(pH7. 4)。
9.一種基于Nano/ALISA技術的沙門菌快速檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中含有(1)特異適配體修飾的磁性顆粒，其粒徑約1 1.5 μ m，濃度約為5mg πιΓ1 ；(2)沙門菌的特異一抗，最適濃度2μg πιΓ1 ；(3)二抗-納米金-報告基團的偶聯體，最佳稀釋度為1 10;(4)封閉液，其組分為含有BSA的IOmMPBS (pH 7. 4)溶液；(5)洗滌液，其組分為含有0.05% Tween 20的IOmM PBS(pH 7. 4)溶液；(6)底物，納米金偶聯體中報告基團相對應的底物，如3，3',5,5'-四甲基聯苯胺(3，3' ,5,5' -tetramethylbenzidine, TMB)等；(7)陽性對照菌液和陰性對照菌液；(8)說明書。
全文摘要
本發明涉及利用適配體代替抗體進行沙門菌捕獲和以納米金偶聯體作為信號報告基團，建立的一種基于納米/適配體聯合免疫吸附法的新型沙門菌快速檢測方法及用于沙門菌快速檢測的試劑盒。包括以下步驟(1)將沙門菌的特異適配體修飾到磁性顆粒表面；(2)加入標本進行反應；(3)加入沙門菌的特異一抗進行反應；(4)加入二抗-納米金-報告基團的偶聯體進行反應；(5)加入特異性底物進行反應，或直接記錄此時的光信號。試劑盒中含有(1)特異適配體修飾的磁性顆粒；(2)沙門菌的特異一抗；(3)二抗-納米金-報告基團的偶聯體；(4)封閉液；(5)洗滌液；(6)底物；(7)陽性對照菌液和陰性對照菌液等。
文檔編號G01N33/569GK102565389SQ20111031567
公開日2012年7月11日 申請日期2011年10月9日 優先權日2011年10月9日
發明者呂建新, 吳文鶴, 張 杰 申請人:溫州醫學院