專利名稱:一種dna烷化損傷的紅外光譜快速檢測方法
技術領域:
本發明涉及一種DNA烷化損傷的紅外光譜快速檢測方法。
背景技術:
DNA損傷是癌癥等重大疾病發生的重要原因之一,導致DNA損傷的因素非常復雜, 如體內代謝過程中產生的自由基和其它活潑中間體,DNA復制和重組過程中的自發錯誤,環境中的紫外線和離子輻射以及內源和外源化學物質等。在諸多 導致DNA損傷的因素中,活潑親電烷化劑作為一類重要的化學物質能夠通過與細胞內靶DNA作用,將單個烷基或復合的烷基基團轉移到DNA堿基的特殊位置上,引起堿基烷化損傷,并可進一步導致堿基丟失、 核苷酸結構變異以及DNA鏈發生斷裂、交聯,造成基因突變,從而誘發細胞凋亡或癌變。多種致癌物質和臨床應用的抗癌藥物都能夠導致DNA的烷基化損傷。環境中廣泛存在的亞硝胺、食品高溫加工過程中生成的丙烯酰胺以及汽車尾氣和卷煙煙氣中存在的1,3-丁二烯, 經過代謝活化后均能夠生成烷基正離子與DNA堿基發生反應,導致DNA損傷并最終誘發癌癥。臨床上常用的烷化劑類抗癌藥物也是通過導致DNA堿基的烷基化而發揮抗癌作用,如用于治療腦瘤等的亞硝基脲類烷化劑、用于治療惡性淋巴瘤等的氮芥類烷化劑、用于治療白血病的甲基磺酸酯類烷化劑和用于治療卵巢癌的乙烯亞胺類烷化劑等。研究表明,烷化劑經過代謝或分解生成的烷基正離子與DNA中堿基分子電子云密度較高的部位發生親電反應,比如在鳥嘌呤的06或N7位形成烷化損傷,進而導致DNA交聯或斷鏈。DNA烷化損傷作為癌癥發病的一種重要的分子標志物,其檢測分析是癌癥防治、 分子生物學和生物化學等領域的研究熱點。目前,針對烷化劑導致DNA損傷的檢測方法主要包括熒光光譜、核磁共振和液相色譜-質譜聯用等分析化學方法,以及凝膠電泳、彗星電泳和Southern印記雜交等生物化學和分子生物學方法。Bathaie等人(S. Z. Bathaie, et al. Spectrochim. Acta, Part A, 2008, 71 (3) :803 808)報道了鏈脲霉素導致的 DNA 烷化物的研究方法,該方法對抗癌藥物鏈脲霉素產生的DNA甲基化產物及其二級結構變化進行了分析。Zhou 等人(Q. Zhou,et al. Chem. Res. Toxicol. ,2011,24(3) :402 411) 報道了苯醌甲基化物導致DNA甲基化損傷的檢測方法,該方法使用凝膠電泳、質譜和核磁對具有高至變性的苯醌甲基化物產生的DNA甲基化損傷產物進行了研究。Garaguso等人(I.Garaguso,et al. Anal. Chem.,2010,82 (20) :8573 8582)報道了多環芳烴代謝物對DNA鳥嘌呤烷化損傷的質譜分析方法,該方法使用基質輔助激光解吸飛行時間質譜法對 DNA鳥嘌呤的烷化損傷產物進行了定量檢測。Kakadiya等人(R. Kakadiya,et al. Bioorg. Med. Chem. ,2010,18(6) :2285 2299)報道了氮芥-喹啉結合物的DNA烷化產物的研究方法,該方法使用彗星電泳法對DNA的烷化損傷產物進行了檢測。Janka等人(V. Janka, et al. Acta Histochemica,2011,113 :423 427)報道了甲基亞硝基脲(MNU)所導致的 DNA損傷的單細胞凝膠電泳檢測法,該方法對DNA損傷的程度進行了定量分析。Penkenth 等人(P. G. Penkenth, et al, Biochem Pharmacol. ,2000,59(3) :283 291)報道了利用熒光光譜法對氯乙基亞硝基脲(CENU)導致的DNA損傷產物的研究,該方法證實CENU能夠通過多種途徑分解成活潑親電試劑,進而導致DNA堿基烷化。Bodell等人(W.J.Bodell,et al. J. Neurooncol.,2009,91 257 264)報道了利用高效液相色譜-質譜聯用技術檢測 CENU烷基化產物,該方法檢測到CENU和DNA反應后生成至少13種DNA烷化損傷產物。綜上所述,現有技術中報道的DNA烷化損傷檢測方法雖然被廣泛應用于致癌物和抗癌藥的毒理、藥理研究中,但均不適用于DNA烷化損傷的快速檢測,此外還各自仍存在以下不足之處(1)質譜方法檢測DNA烷化損傷,樣品需經過脫鹽、濃縮等復雜的前處理過程,而且質譜儀器價格昂貴、操作復雜、對分析環境要求高,實驗成本高,無法實現樣品的回收利用;(2)熒光方法檢測DNA烷化損傷,需要特殊的熒光染料,易受樣品雜質干擾,實驗結果重現性低,不能確定烷化位點,實驗過程不易于操作;(3)電泳方法檢測DNA烷化損傷,最顯著的缺點是靈敏度低、專屬性差,不能確定烷化位點,需要溴化乙錠等具有致癌性的染料,容易對人體產生危害且不符合環保要求;(4) Southern印跡雜交方法檢測DNA烷化損傷,靈敏度低、專屬性差,對DNA的樣品量和純度要求高,不能確定烷化位點,分析速度慢。
發明內容
本發明的目的是提供一種靈敏度高、專屬性強,實驗過程簡單且安全環保,樣品便于回收且能夠直接測定DNA烷化損傷位點及損傷程度的紅外光譜快速檢測方法。本發明所提供的一種DNA烷化損傷的紅外光譜快速檢測方法,包括以下步驟(1)稱取小牛胸腺DNA,溶于1 20mmol/L Tris-HCl溶液中,配制成濃度為4 10mg/mL的DNA溶液,pH值為7 8,向DNA溶液中加入烷化劑乙醇溶液,烷化劑的摩爾濃度為0. 25 15mmol/L,在37°C下反應4 IOh ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定設定掃描范圍4000 400CHT1,分辨率2 4CHT1,掃描次數100 500,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將Tris-HCl溶液滴于非水溶性窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于非水溶性窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)將與烷化劑反應后的DNA樣品采用與步驟⑵中DNA空白溶液相同的方法進行測定,得到DNA樣品溶液的紅外光譜圖,將得到的所有紅外譜圖使用大氣補償將空氣中 CO2和H2O的吸收峰扣除,最后進行基線校正;(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較,根據峰位和峰強比的變化確定DNA烷化損傷的位點和程度。上述步驟(1)中烷化劑為甲基亞硝基脲、乙基亞硝基脲、甲烷磺酸甲酯、甲烷磺酸乙酯、碘甲烷、碘乙烷、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、甲基亞硝基胍或丙基亞硝基胍。上述步驟(2)中非水溶性窗片為AgBr、CaF2, ZnSe或KRS-5。上述步驟(2)中DNA空白溶液是指未加入烷化劑的DNA溶液。上述步驟(4)中特征峰的變化包括 (a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699 1701CHT1,表明鳥嘌呤發生了烷化損傷;(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608 1609CHT1,表明腺嘌呤發生了烷化損傷;(c) 1088cm"1處和1228CHT1處磷酸基團特征峰的峰強比1_/11228減小,表明磷酸基團發生了烷化損傷。本發明方法與現有 方法相比,具有以下有益效果(1)操作方法簡單,無需復雜的樣品處理過程,可將反應完的溶液直接進行紅外光譜檢測,不需要對待測物質進行分離純化,便于推廣使用,而現有技術中的液質聯用方法需要對樣品進行酶解、離心過濾、色譜分離等復雜的前處理步驟;(2)檢測速度快,每次樣品掃描只需5分鐘即可完成,而現有技術中的液質聯用方法需要8小時以上才能完成;(3)特異性強,靈敏度高,不同種類的DNA烷化損傷均可進行檢測,而現有技術中的電泳方法靈敏度低、不能檢測損傷的位點,熒光方法只能檢測能夠與熒光探針特異結合的部分DNA烷化損傷;(4)本發明無需使用放射性元素和致癌性化學染料,消除了對實驗人員的傷害,安全環保,而現有技術中的電泳方法需要使用溴化乙錠等致癌性化學染料,液質聯用方法需要使用放射性同位素標記;(5)該方法為無損檢測,樣品能夠回收利用,而現有技術中的電泳方法和熒光方法由于加入了化學染料,樣品不能直接回收利用,液質聯用方法則對待測物質的化學結構進行了破壞,無法回收利用。
圖1是DNA空白溶液的紅外光譜圖;圖2是與甲基亞硝基脲反應后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖;圖3是與乙基亞硝基脲反應后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖;圖4是與甲烷磺酸甲酯反應后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖;圖5是與甲烷磺酸乙酯反應后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖;圖6是與碘甲烷反應后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖;圖7是與碘乙烷反應后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖;圖8是與硫酸二甲酯反應后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖;圖9是與硫酸二乙酯反應后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖;圖10是與甲基亞硝基胍反應后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖;圖11是與丙基亞硝基胍反應后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖。
具體實施例方式實施例1(1)稱取50mg小牛胸腺DNA,溶于IOmL濃度為10mmol/L Tris-HCl溶液中,配制成濃度為5mg/mL的DNA溶液,pH值為7. 3,將甲基亞硝基脲(N-methyl-N_nitrosourea,MNU) 固體3mg溶于100 μ L乙醇中,配制成摩爾濃度為30mmol/L的MNU乙醇溶液,向ImL DNA溶液中加入25 μ L MNU乙醇溶液,此時反應體系中MNU的摩爾濃度為7. 5mmol/L,在37°C下反應4h ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定
設定掃描范圍4000 400cm-1,分辨率4cm—1,掃描次數128次,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將所配制濃度為lOmmol/L的Tris-HCl溶液滴于KRS-5 窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于KRS-5窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)將與烷化劑反應后的DNA樣品溶 液采用與步驟(2)中DNA空白溶液相同的方法進行測定,得到DNA樣品溶液的紅外光譜圖,將得到的所有紅外譜圖使用大氣補償將空氣中CO2和H2O的吸收峰扣除,最后進行基線校正。經處理的DNA空白溶液的紅外光譜圖如圖1所示,經處理的與MNU反應的DNA樣品溶液的紅外光譜圖如圖2所示;(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較, 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1,表明鳥嘌呤發生了烷化損傷;(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1,表明腺嘌呤發生了烷化損傷; (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團特征峰的峰強比I1088A1228由1. 879減小為1. 469,表明磷酸基團發生了烷化損傷。實施例2(1)稱取50mg小牛胸腺DNA,溶于IOmL濃度為lmmol/L Tris-HCl溶液中,配制成濃度為5mg/mL的DNA溶液,pH值為7,將乙基亞硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)固體7mg溶于600 μ L乙醇中,配制成摩爾濃度為60mmol/L的ENU乙醇溶液,向ImL DNA溶液中加入10 μ L ENU乙醇溶液,此時反應體系中ENU的摩爾濃度為lmmol/L,在37°C下反應 6h ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定設定掃描范圍4000 400cm—1,分辨率2cm—1,掃描次數256次,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將所配制濃度為lmmol/L的Tris-HCl溶液滴于KRS-5 窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于KRS-5窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)同實施例1中步驟(3),經處理的與ENU反應的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 3所示;(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較, 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1,表明鳥嘌呤發生了烷化損傷;(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1,表明腺嘌呤發生了烷化損傷; (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團特征峰的峰強比I1088A1228由1. 879減小為1. 664,表明磷酸基團發生了烷化損傷。實施例3(1)稱取70mg小牛胸腺DNA,溶于IOmL濃度為10mmol/L Tris-HCl溶液中,配制成濃度為7mg/mL的DNA溶液,pH值為7. 4,將甲烷磺酸甲酯(methane sulfonic acid methyl ester,MMS)液體10 μ L稀釋于190 μ L乙醇中,配制成摩爾濃度為100mmol/L的MMS乙醇溶液,向ImL DNA溶液中加入20 μ LMMS乙醇溶液,此時反應體系中MMS的摩爾濃度為IOmmol/ L,在37°C下反應5h ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定設定掃描范圍4000 400cm-1,分辨率4cm—1,掃描次數192次,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將所配制濃度為lOmmol/L的Tris-HCl溶液滴于CaF2窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于CaF2窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)同實施例1中步驟(3),經處理的與匪S反應的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 4所示;
(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較, 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1700CHT1,表明鳥嘌呤發生了烷化損傷;(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1,表明腺嘌呤發生了烷化損傷; (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團特征峰的峰強比I1088A1228由1. 879減小為1. 746,表明磷酸基團發生了烷化損傷。實施例4(1)稱取40mg小牛胸腺DNA,溶于IOmL濃度為5mmol/L Tris-HCl溶液中,配制成濃度為4mg/mL的DNA溶液,pH值為7. 8,將甲烷磺酸乙酯(methane sulfonic acid ethyl ester, EMS)液體10 μ L稀釋于190 μ L乙醇中,配制成摩爾濃度為100mmol/L的EMS乙醇溶液,向ImL DNA溶液中加入10 μ L EMS乙醇溶液,此時反應體系中EMS的摩爾濃度為5mmol/ L,在37°C下反應7h ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定設定掃描范圍4000 400cm—1,分辨率2cm—1,掃描次數384次,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將所配制濃度為5mmol/L的Tris-HCl溶液滴于CaF2窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于CaF2窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)同實施例1中步驟(3),經處理的與EMS反應的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 5所示;(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較, 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1,表明鳥嘌呤發生了烷化損傷;(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1,表明腺嘌呤發生了烷化損傷; (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團特征峰的峰強比I1088A1228由1. 879減小為1. 725,表明磷酸基團發生了烷化損傷。實施例5(1)稱取60mg小牛胸腺DNA,溶于IOmL濃度為20mmol/L Tris-HCl溶液中,配制成濃度為6mg/mL的DNA溶液,pH值為7. 5,將碘甲烷(iodo methane,MeI)液體10 μ L稀釋于190 μ L乙醇中,配制成摩爾濃度為160mmol/L的MeI乙醇溶液,向ImL DNA溶液中加入 10 μ L MeI乙醇溶液,此時反應體系中MeI的摩爾濃度為8mmol/L,在37°C下反應6h ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定設定掃描范圍4000 400cm—1,分辨率4cm—1,掃描次數320次,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將所配制濃度為20mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe 窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)同實施例1中步驟(3),經處理的與MeI反應的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖6所示;(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較, 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1,表明鳥嘌呤發生了烷化損傷;(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1,表明腺嘌呤發生了烷化損傷; (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團特征峰的峰強比I1088A1228由1. 879減小為1. 325,表明磷酸基團發生了烷化損傷。實施例6(1)稱取40mg小牛胸腺DNA,溶于IOmL濃度為5mmol/L Tris-HCl溶液中,配制成濃度為6mg/mL的DNA溶液,pH值為8,將碘乙烷(iodo ethane, EtI)液體15 μ L稀釋于485 μ L乙醇中,配制成摩爾濃度為100mmol/L的EtI乙醇溶液,向ImL DNA溶液中加入 10 μ L EtI乙醇溶液,此時反應體系中EtI的摩爾濃度為2mmol/L,在37°C下反應IOh ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定設定掃描范圍4000 400cm—1,分辨率2cm—1,掃描次數160次,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將所配制濃度為5mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)同實施例1中步驟(3),經處理的與EtI反應的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 7所示;(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較, 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1,表明鳥嘌呤發生了烷化損傷;(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1,表明腺嘌呤發生了烷化損傷; (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團特征峰的峰強比I1088A1228由1. 879減小為1. 322,表明磷酸基團發生了烷化損傷。實施例7(1)稱取90mg小牛胸腺DNA,溶于IOmL濃度為lmmol/L Tris-HCl溶液中,配制成濃度為9mg/mL的DNA溶液,pH值為7,將硫酸二甲酯(dimethyl sulfate, DMS)液體15 μ L 稀釋于485 μ L乙醇中,配制成摩爾濃度為150mmol/L的DMS乙醇溶液,向ImL DNA溶液中加入10 μ L DMS乙醇溶液,此時反應體系中DMS的摩爾濃度為3mmol/L,在37°C下反應6h ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定設定掃描范圍4000 400cm—1,分辨率4cm—1,掃描次數320次,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將所配制濃度為lmmol/L的Tris-HCl溶液滴于AgBr窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于AgBr窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)同實施例1中步驟(3),經處理的與DMS反應的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 8所示;(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較, 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1,表明鳥嘌呤發生了烷化損傷;(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1,表明腺嘌呤發生了烷化損傷; (c) 1088cm—1處和1228cm—1處磷酸基團特征峰的峰強比I1088A1228由1. 879減小為1. 355,表明磷酸基團發生了烷化損傷。實施例8(1)稱取90mg小牛胸腺DNA,溶于IOmL濃度為15mmol/L Tris-HCl溶液中,配制成濃度為9mg/mL的DNA溶液,pH值為7. 5,將硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)液體10 μ L 稀釋于1. 5mL乙醇中,配制成摩爾濃度為75mmol/L的DES乙醇溶液,向ImL DNA溶液中加入10 μ L DES乙醇溶液,此時反應體系中DES的摩爾濃度為0. 5mmol/L,在37°C下反應4h ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定設定掃描范圍4000 400cm—1,分辨率4cm—1,掃描次數320次,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將所配制濃度為15mmol/L的Tris-HCl溶液滴于AgBr 窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于AgBr窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)同實施例1中步驟(3),經處理的與DES反應的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 9所示;(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較, 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1,表明鳥嘌呤發生了烷化損傷;(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1,表明腺嘌呤發生了烷化損傷; (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團特征峰的峰強比I1088A1228由1. 879減小為1. 559,表明磷酸基團發生了烷化損傷。實施例9(1)稱取80mg小牛胸腺DNA,溶于IOmL濃度為15mmol/L Tris-HCl溶液中,配制成濃度為8mg/mL的DNA溶液,pH值為7. 2,將甲基亞硝基胍(N-methyl-N,-nitro-N-nitr oso-guanidine, MNNG)固體3mg溶于100 μ L乙醇中,配制成摩爾濃度為20mmol/L的MNNG 乙醇溶液,向ImL DNA溶液中加入25 μ L MNNG乙醇溶液,此時反應體系中MNNG的摩爾濃度為5mmol/L,在37°C下反應9h ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定設定掃描范圍4000 400cm—1,分辨率2cm—1,掃描次數326次,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將所配制濃度為15mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe 窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)同實施例1中步驟(3),經處理的與MNNG反應的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖10所示;(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較, 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1,表明鳥嘌呤發生了烷化損傷;(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1,表明腺嘌呤發生了烷化損傷; (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團特征峰的峰強比I1088A1228由1. 879減小為1. 523,表明磷酸基團發生了烷化損傷。實施例10(1)稱取40mg小牛胸腺DNA,溶于IOmL濃度為5mmol/L Tris-HCl溶液中,配制成濃度為8mg/mL的DNA溶液,pH值為7. 7,將丙基亞硝基胍(N-propyl-N,-nitro-N-nitrosoguanidine,PNNG)固體9mg溶于2mL乙醇中,配制成摩爾濃度為125mmol/L的PNNG乙醇溶液, 向ImL DNA溶液中加入4 μ LPNNG乙醇溶液,此時反應體系中PNNG的摩爾濃度為0. 25mmol/ L,在37°C下反應8h ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定設定掃描范圍4000 400cm—1,分辨率2cm—1,掃描次數326次,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將所配制濃度為5mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)同實施例1中步驟(3),經處理的與PNNG反應的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖11所示;(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較, 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1,表明鳥嘌呤發生了烷化損傷;(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1,表明腺嘌呤發生了烷化損傷; (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團特征峰的峰強比I1088A1228由1. 879減小為1. 596,表明磷酸基團發生了烷化損傷。
權利要求
1.一種DNA烷化損傷的紅外光譜快速檢測方法,包括以下步驟(1)稱取小牛胸腺DNA,溶于1 20mmol/LTris-HCl溶液中,配制成濃度為4 IOmg/ mL的DNA溶液,pH值為7 8,向DNA溶液中加入烷化劑乙醇溶液,烷化劑的摩爾濃度為 0. 25 15mmol/L,在 37°C下反應 4 IOh ;(2)采用液膜法進行紅外光譜測定設定掃描范圍4000 400cm-1,分辨率2 4cm—1,掃描次數100 500,采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器,首先將Tris-HCl溶液滴于非水溶性窗片上,干燥后作為背景掃描,再將DNA空白溶液滴于非水溶性窗片上,采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA 空白溶液的紅外光譜圖,重復測定三次取平均值;(3)將與烷化劑反應后的DNA樣品采用與步驟(2)中DNA空白溶液相同的方法進行測定,得到DNA樣品溶液的紅外光譜圖,將得到的所有紅外譜圖使用大氣補償將空氣中CO2和 H2O的吸收峰扣除,最后進行基線校正;(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進行比較,根據峰位和峰強比的變化確定DNA烷化損傷的位點和程度。
2.根據權利要求1的方法,其特征在于步驟(1)中所述烷化劑為甲基亞硝基脲、乙基亞硝基脲、甲烷磺酸甲酯、甲烷磺酸乙酯、碘甲烷、碘乙烷、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、甲基亞硝基胍或丙基亞硝基胍。
3.根據權利要求1的方法,其特征在于步驟(2)中所述非水溶性窗片為AgBr、CaF2, ZnSe 或 KRS-5。
全文摘要
本發明涉及一種DNA烷化損傷的紅外光譜快速檢測方法。該方法是利用紅外光譜法檢測DNA與烷化劑反應后的紅外光譜圖,并與空白DNA溶液的紅外光譜圖進行比較,得到峰位和峰強比發生變化的特征基團,從而確定DNA烷化損傷位點及程度。本發明方法具有操作方法簡單且樣品便于回收、專屬性強、靈敏度高、檢測速度快以及安全環保等突出特點,可直接對DNA損傷進行快速檢測。
文檔編號G01N21/35GK102353647SQ20111030678
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月11日 優先權日2011年10月11日
發明者李莉莉, 趙麗嬌, 鄭大威, 鐘儒剛 申請人:北京工業大學