專利名稱：一種檢測蛋白質和金屬離子的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體的說是涉及一種檢測蛋白質和金屬離子的方法。
背景技術：
蛋白質是人體中重要的生物大分子，它不僅對于維持生命是十分重要和必不可少的，同時，它對于生命遺傳密碼的翻譯、信息的轉錄、DNA的復制等都有密切關系。蛋白質在體液中的含量可作為人體營養健康、疾病診斷的重要指標，如尿蛋白的含量是診斷腎炎和糖尿病的依據之一，正常人24h尿中蛋白質的含量在20 80mg，超過了這一限度為不正常值，是發病的征兆。如血清蛋白是人體內的一種重要生命物質，它在體液中的含量可作為人體營養健康、疾病診斷等的重要指標。又如Alzheimer病(AD)是一組原因不明的中樞神經系統原發性變性疾病，目前仍是一種不可治愈的疾病，量化測定腦脊液中的Tau蛋白可能成為AD早期診斷的一項有用指標，生物學測定，如腦脊液Tau蛋白測定，可能幫助臨床醫生達到早期診斷和預防AD的目的。因此，對特定蛋白質的痕量檢測可以實現疾病的早期診斷，從而提早治療、延長病人生命。金屬離子在環境、生物和醫學領域扮演著重要的角色，其濃度、種類以及價態對生命活動和環境都有重要影響。比如鉀、鐵、鋅等金屬離子是生命體維持正常生理活動的必需元素。而一些重金屬離子，由于在環境中不能分解并會通過食物鏈逐漸在生物鏈上層富集， 易造成慢性中毒。據《北京青年報》報道自1974年以來，陜西華縣龍嶺村共死亡58人，死于癌癥的四人，死于肺心病、腦血管病的22人，僅1人屬于自然死亡。經查該地土壤主要受到鉛和砷的污染，而當地村民食用的面粉則受到鉛、砷、鋅、鉻4種元素的嚴重污染，豆角中鎘、鉛的含量分別為標準值的5. 3倍及2. 55倍，屬嚴重污染的蔬菜。因此，對金屬離子的檢測在環境監測和疾病診斷等方面具有重要的意義。目前，對于金屬離子檢測主要使用原子發光和吸收光譜，該方法雖然具有靈敏度高、準確度高等優點，但是需要使用大型儀器， 檢測成本較高，不利于廣泛推廣。因此，需要開發一種簡單、快速、高選擇性、高靈敏度的金屬離子檢測方法。
發明內容
有鑒于此，本發明目的是針對現有的檢測方法的缺陷，提供一種操作簡單，靈敏度高、選擇性強的檢測蛋白質和金屬離子的方法。為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案一種檢測蛋白質和金屬離子的方法，提供帶報告熒光基團的可以與靶目標特異性結合的探針分子；將所述探針分子與富含π電子的納米材料溶液混合，然后加入待測樣品，檢測熒光；其中，所述靶目標為蛋白質和金屬離子，所述富含π電子的納米材料選自單體為苯二胺、3，4_乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共軛聚合物，銀(1)-4，4’_聯吡啶、銅(11)-4，4’_聯吡啶、氯鉬酸_3，3’，5，5’ -四甲基聯苯二胺、氯鉬酸-對苯二胺或四氯合金酸_4，4’ -聯吡啶配位聚合物、嚇啉簇集體、介孔碳和納米C6(1。隨著DNA體外進化技術的發展，探針DNA分子序列的篩選和合成的成本越來越低，因此基于DNA分子的檢測平臺具有廣闊的應用前景。DNA分子與蛋白質的特異性識別作用是近年來的研究熱點，廣泛的用于特定蛋白的識別和檢測，如瑞典烏普薩拉生物醫學中心的Landegren等人用DNA作為探針實現了對PDGF蛋白的高靈敏度和高選擇性檢測， 其最低檢測濃度為 40Xl(T21mol[Fredriksson，S. Gullberg, Μ. Jarvius, J. ；Olsson, C.； Pietras,K. ；Gustafsdottir, S. Μ. ；Ostman,Α. ；Landegren,U. , Nat.Biotechnol,2002,20, 473-477]。特殊篩選的DNA序列能夠與金屬離子形成穩定的配合物，表現出作用的特異性， 如一種Hg2+離子的比色檢測方法，利用Hg2+離子與DNA序列AGR0100中T堿基的作用，檢測限為 50nM[Li, Τ. ；Dong, S. J. ；Wang，Ε. K.，Anal Chem，2009，81，2144-2149]。經過體外進化篩選的DNA分子，能夠與有機小分子發生特異性識別作用，從而誘導DNA分子構象的變換，如新加坡國立大學的Liu等人利用熒光標記的DNA與ATP的選擇作用，實現了對ATP的選擇性檢測，其檢測限為 20 μ M[Wang, Y. ；Liu, B.，Analyst，2008，133，1593-1598]。本發明檢測蛋白質和金屬離子的方法利用π-π相互作用，將與靶目標特異性結合的探針分子吸附在富含η電子的納米材料表面，淬滅探針分子的熒光，然后探針分子與待測樣品混合，探針分子與靶目標結合，使探針分子從納米材料表面脫離，熒光淬滅作用消失，通過檢測熒光信號實現對待測樣品的檢測。而且根據熒光強度變化，還可確定待測樣品中靶目標的含量。本發明所述檢測蛋白質和金屬離子的方法成本低廉，所述富含η電子的納米材料制備方法簡單，原材料價格低廉，且能大規模制備；操作簡單，檢測過程中只需要將富含η電子的納米材料、探針分子和待測樣品混合，使用簡單的熒光檢測儀器檢測熒光，不需要使用價格昂貴的大型分析儀器；檢測性能優異，檢測時間短、靈敏度高，是一種簡便、快速、成本低、應用范圍廣的檢測蛋白質和金屬離子的方法。
圖1示本發明所述檢測方法的原理示意圖，其中，球形只代表富含π電子的納米材料，并不表明材料本身為球形，靶目標包含蛋白質和金屬離子；探針DNA折疊代表其構象發生改變，但不僅限于折疊；圖2示聚間苯二胺納米棒檢測凝血酶蛋白的結果圖。a為探針DNAQOiiMTa)的熒光發射譜；b為探針DNAQOnM Ta)+目標蛋白(IOOnM Tb)的熒光發射譜；c為探針DNAQOnM Ta)+目標蛋白(IOOnM TB)+PMPD納米棒的熒光發射譜；d為探針DNA QOnM TA)+PMPD納米棒的熒光發射譜；e為PMPD納米棒自身的熒光發射譜；圖3示聚間苯二胺納米棒對凝血酶的特異性選擇結果圖；另外兩種干擾蛋白分別為牛血清白蛋白(BSA)和人的免疫球蛋白(IgG)，濃度均為ΙΟΟηΜ。圖4示介孔碳微粒檢測人血清樣本中凝血酶的結果；圖5示納米C6Q(nan0-C6Q)對金屬離子Hg2+的檢測結果圖，探針DNAOV IOOnM)在不同條件下的熒光發射譜(a) PH, (b) PH+Hg2+ (8 μ Μ), (c) PH+nano-C60, (d) PH+nano-C60+Hg2+ (8 μ Μ)；圖6示Iian0-C6tl對金屬離子Hg2+的選擇性結果圖。其中，Hg2+濃度為8 μ M圖A中其它干擾離子的濃度為5 μ M，圖B中其它干擾離子的濃度為50 μ M ；圖7示Iian0-C6tl檢測湖水中金屬離子Hg2+的結果圖。a為湖水的熒光發射譜，b為湖水+30nM Hg2+的熒光發射譜。
具體實施例方式本發明實施例公開了一種檢測蛋白質和金屬離子的方法。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案提供帶報告熒光基團的可以與靶目標特異性結合的探針分子；將所述探針分子與富含π電子的納米材料溶液混合，然后加入待測樣品，檢測熒光；其中，所述靶目標為蛋白質和金屬離子，所述富含π電子的納米材料選自單體為苯二胺、3，4_乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共軛聚合物，銀(1)-4，4’_聯吡啶、銅(11)-4，4’_聯吡啶、氯鉬酸_3，3’，5，5’ -四甲基聯苯二胺、氯鉬酸-對苯二胺或四氯合金酸_4，4’ -聯吡啶配位聚合物、嚇啉簇集體、介孔碳和納米C6(1。本發明所述檢測蛋白質和金屬離子的方法將與靶目標特異性結合的探針分子與富含η電子的納米材料混合，由于η-η相互作用，探針分子吸附在材料表面，之后探針分子上報告熒光基團同富含η電子的納米材料間發生能量轉移可將熒光基團發射的熒光淬滅。加入待測樣品后，待測樣品中的靶目標與探針分子結合，使探針分子從納米材料表面脫離，熒光淬滅作用消失，探針分子恢復熒光，通過檢測熒光信號實現對待測樣品的檢測。而且根據熒光強度變化，還可確定待測樣品中靶目標的含量。本發明所述探針分子帶有報告熒光基團，可以在探針分子3’端或5’端標記報告熒光基團，也可以在3’端和5’端同時標記報告熒光基團，以提高熒光強度，提高檢測的靈敏度。探針標記的報告熒光基團包括但不限于以下熒光物質FAM、TET、J0E、VIC、HEX、R0X、 TAMRA, CY3、CY3. 5、CY5、CY5. 5、Oregon Green、CAL Red、Red640 和 iTexas Red。本發明所述富含π電子的納米材料選自單體為苯二胺、3，4_乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共軛聚合物。其中，所述共軛聚合物的制備方法為將單體和氧化劑的溶液按照摩爾比1 0.1 20混合，放置Imin Mh，制得。所述單體為苯二胺、3，4-乙烯二氧噻吩或苯乙烯，所述氧化劑優選為過硫酸銨或三氯化鐵。本發明所述配位聚合物為銀(1)-4，4’_聯吡啶、銅(11)-4，4’_聯吡啶、氯鉬酸-3， 3’，5，5’-四甲基聯苯二胺、氯鉬酸-對苯二胺或四氯合金酸_4，4’-聯吡啶配位聚合物，由含η電子的4，4’_聯吡啶和四甲基聯苯二胺分子作為單體，過渡金屬離子銀、銅、鉬或金作為引發劑，聚合而成。所述配位聚合物的制備方法為將過渡金屬離子和含η電子的有機分子的溶液按照摩爾比1 0. 1 20混合，放置Imin Mh，制得。有機分子簇集體是在水或水與有機溶劑的混合體系中，有機分子在疏水親脂作用驅動下，相互靠近形成的簡單分子集合體。本發明所述卟啉簇集體是由含η電子的卟啉分子在水與有機溶劑的混合溶液中相互靠近簇集而成。其中，所述卟啉簇集體的制備方法為含η電子的卟啉分子溶解在有機溶劑中獲得濃度為lmmol/L 0.5mol/L的溶液，然后按照體積比為0. 001 1 1與水混合，放置Imin Mh，制得。其中，所述有機溶劑優選為甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、二甲基亞砜、四氫呋喃或N-甲基吡咯烷酮。本發明所述介孔碳和納米C6tl均屬于碳材料，其中，所述介孔碳的制備方法為通過浸漬法將碳源前驅物引入介孔氧化硅的孔道中，在酸催化下使前驅物熱分解并沉積在模板介孔材料的孔道內，煅燒碳化制得碳硅復合物，然后移除硅模板，制得介孔碳。其中，所述碳源前驅物優選為葡萄糖、蔗糖乙炔、中間相浙青、呋喃甲醇、苯酚/甲醛樹脂。本發明所述納米C6tl的制備方法為將C6tl粉末溶解在丙酮中，然后與乙腈混合，收集土黃色沉淀，然后均勻分散在水中制得。為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明進行詳細說明。其中，本發明在實施例中以人凝血酶蛋白為檢測的目標蛋白(TB)，將熒光團(FAM) 修飾的對人凝血酶蛋白有特異性識別能力的單鏈DNA序列作為熒光檢測蛋白的熒光探針 (TA)。在實施例中以Hg2+和Ag+分別作為檢測的目標金屬離子，將熒光團(FAM)修飾的富含 T堿基的對Hg2+有特異性結合能力的單鏈DNA序列作為熒光檢測Hg2+的探針DNA (Ph)，將熒光團(FAM)修飾的富含C堿基的對Ag+有特異性結合能力的單鏈DNA序列作為熒光檢測Ag+ 的探針DNA (PAg)。各探針序列詳見表1。表1相關探針序列
權利要求
1. 一種檢測蛋白質和金屬離子的方法，其特征在于， 提供帶報告熒光基團的可以與靶目標特異性結合的探針分子； 將所述探針分子與富含η電子的納米材料溶液混合，然后加入待測樣品，檢測熒光； 其中，所述靶目標為蛋白質和金屬離子，所述富含η電子的納米材料選自單體為苯二胺、3，4-乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共軛聚合物，銀(I)-4，4’ -聯吡啶、銅(II)-4，4’ -聯吡啶、氯鉬酸_3，3’，5，5’ -四甲基聯苯二胺、氯鉬酸-對苯二胺或四氯合金酸_4，4’ -聯吡啶配位聚合物、嚇啉簇集體、介孔碳和納米C6(1。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，公開了一種檢測蛋白質和金屬離子的方法，該方法為提供帶報告熒光基團的可以與靶目標特異性結合的探針分子；將所述探針分子與富含π電子的納米材料溶液混合，然后加入待測樣品，檢測熒光；其中，所述富含π電子的納米材料選自單體為苯二胺、3，4-乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共軛聚合物，銀(I)-4，4’-聯吡啶、銅(II)-4，4’-聯吡啶、氯鉑酸-3，3’，5，5’-四甲基聯苯二胺、氯鉑酸-對苯二胺或四氯合金酸-4，4’-聯吡啶配位聚合物、卟啉簇集體、介孔碳和納米C60。本發明所述檢測方法成本低廉，操作簡單，檢測時間短、靈敏度高，應用范圍廣。
文檔編號G01N21/64GK102507952SQ20111030663
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月11日 優先權日2011年10月11日
發明者孫旭平, 張瑛洧, 王磊 申請人:中國科學院長春應用化學研究所