專利名稱：適用于高溫和強酸環境的生物敏感多層膜及其制備方法
技術領域：
本發明屬于電化學生物傳感器技術領域，特別是涉及一種適用于高溫和強酸環境的生物敏感多層膜及其制備方法。
背景技術：
電化學生物傳感器具有體積小、成本低、準確、靈敏、易操作、可現場檢測等優點， 因此國內外對電化學生物傳感器開展了廣泛深入的研究。其中利用氧化還原蛋白或氧化還原酶與電極間的直接電子傳遞進行檢測的第三代電化學生物傳感器更是備受人們關注，是當前電化學生物傳感器研究領域的熱點。溫度和pH值是影響氧化還原蛋白和氧化還原酶生物活性的重要因素，因此溫度和pH值對相應電化學生物傳感器的性能也有重要影響，當前電化學生物傳感器多難以在高于室溫的較高溫度或強酸堿等苛刻條件下使用。目前提升蛋白或酶的耐高溫或耐酸堿性能，大多采用較復雜的生物方法，如對蛋白或酶進行改性等，以提高其活性適應范圍。如在文獻(I)Talanta, 2009, 79 :1412-1417 中，Melek Ozkan等人通過復制耐熱細菌熱纖梭菌得到了熱纖梭菌_乳酸脫氫酶，再利用聚吡咯和三磷酸甘油酸的聚合物，將酶固定到金電極表面上，用于在較高溫度下檢測人血清中的乳酸含量。這種改性后的乳酸脫氫酶在50°C時線性范圍最寬，60°C時靈敏度最高，為 25°C時靈敏度的70倍以上。但是這種生物改性方法過程繁瑣，對酶的要求苛刻，難以廣泛應用。層狀二維納米材料具有可插層性、良好的生物相容性和化學穩定性，將其用于蛋白或酶的固定，構建化學修飾電極也受到電化學工作者的廣泛關注。在文獻(2) Adv. Funct. Mater, 2007,17 :1958-1965中，Ling Zhang等人將肌紅蛋白插入二氧化鈦納米片層間構建蛋白質修飾電極并對其直接電化學行為進行了研究。該電極對過氧化氫具有良好的電催化活性，同時具有一定的熱穩定性。但此方法提升蛋白質耐高溫性能的效果有限，只是隨著溫度升高蛋白質活性減少幅度較小。
發明內容
本發明的目的在于提供一種適用于高溫和強酸環境的生物敏感多層膜及其制備方法，即含磷酸鋯納米片、氧化還原蛋白或氧化還原酶、脫氧核糖核酸，且適用于高溫和強酸環境的生物敏感多層膜及其層層組裝。本發明生物敏感多層膜由磷酸鋯納米片層與復合生物活性物質層重復疊加構成， 其組成可描述為(磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)n。其中磷酸鋯納米片帶負電，厚度為1 20nm，徑向尺寸為300 1500nm ；復合生物活性物質帶正電，由氧化還原蛋白或氧化還原酶與脫氧核糖核酸復合而成，氧化還原蛋白或氧化還原酶為肌紅蛋白、血紅蛋白、細胞色素C、辣根過氧化物酶中的一種，脫氧核糖核酸為市售脫氧核糖核酸，如鯡魚精脫氧核糖核酸等，氧化還原蛋白或氧化還原酶與脫氧核糖核酸的質量比為4 1 2 l;n為組裝的(磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)膜的層數，取值范圍為1 6。本發明制備生物敏感多層膜的方法是利用帶相反電荷的磷酸鋯納米片和復合生物活性物質間的靜電作用，依次層層組裝到玻碳電極表面，具體工藝步驟為將玻碳電極清洗干凈，然后用隊吹干；將該電極浸入到濃度為20 30g/L的聚苯乙烯硫酸鈉水溶液或聚苯乙烯基磺酸鈉水溶液中，15 30分鐘后取出，用隊吹干；將該電極浸入濃度為0. 5 2. Og/L的磷酸鋯納米片溶膠中，15 30分鐘后取出，用蒸餾水沖洗干凈，用N2吹干；再將該電極浸入濃度為2. 5 6. Og/L的復合生物活性物質水溶液中，10 30分鐘后取出，用蒸餾水沖洗干凈，用隊吹干，完成一層(磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)膜的制備；重復以上步驟，制備出(磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)n多層膜修飾電極。其中濃度為0. 5 2. Og/L的磷酸鋯納米片溶膠的制備方法為將&0C12 · SH2O, 質量分數為36 38%的濃鹽酸加入到去離子水中配成溶液I ；將質量分數為85%的濃磷酸、質量分數為36 38%的濃鹽酸加入到去離子水中配成溶液II ；將溶液I與溶液II在室溫下同時加入到轉速為3000 5000轉/分鐘的膠體磨中，反應1 2分鐘后懸濁液脫離膠體磨，按照兩種溶液混合后的總體積計算，各反應物料濃度分別為&0C12 · SH2O濃度為0. 044 0. 22mol/L,磷酸濃度為2. 0 10mol/L,鹽酸濃度為0. 50 2. Omol/L ；將所得懸濁液轉移到聚四氟乙烯容器中，懸濁液體積占聚四氟乙烯容器體積的40 80%，將聚四氟乙烯容器密封于水熱反應釜中，在180 240°C水熱處理48 192小時，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗滌濾餅至濾液PH值為6 7，將濾餅在50 60°C空氣氣氛中干燥后得到層狀α-磷酸鋯顆粒；按照固/液比為0.5 2. 0g/L的比例將層狀α-磷酸鋯顆粒加入到體積分數為0. 2 0. 4%的四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌8 20 小時，所得澄清溶膠即為剝離的磷酸鋯納米片溶膠，濃度為0. 5 2. 0g/L。濃度為2. 5 6. 0g/L的復合生物活性物質水溶液的制備方法為將肌紅蛋白、血紅蛋白、細胞色素C、辣根過氧化物酶等氧化還原蛋白或氧化還原酶中的一種用去離子水配制成濃度為2 4g/L的水溶液，按氧化還原蛋白或氧化還原酶脫氧核糖核酸的質量比為 4 1 2 1比例與脫氧核糖核酸混合，攪拌8 12小時，得到濃度為2. 5 6. 0g/L的復合生物活性物質水溶液。本發明生物敏感多層膜的組裝過程可采用日本島津UV-2501PC型紫外-可見分光光度計進行監測，不同組裝層數的(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸) 多層膜的紫外-可見測試結果如圖1所示。多層膜中肌紅蛋白的Soret吸收帶出現在408. 5nm處， 與肌紅蛋白溶液的吸收帶位置十分接近，并且該吸收帶強度隨組裝層數的增加線性增長， 表明多層膜的組裝過程是連續均勻的。本發明的實施效果可以從本發明生物敏感多層膜修飾電極制作的電化學生物傳感器看出。將本發明生物敏感多層膜修飾的玻碳電極作為工作電極，鉬絲為對電極，Ag/ AgCl電極為參比電極，組成電化學生物傳感器。將該電化學生物傳感器的三電極體系置于 0. lmol/L pH = 6. 5的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，采用上海辰華儀器公司CHI660B型電化學工作站對其進行電化學性能的表征。(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)n多層膜修飾玻碳電極的電化學循環伏安測試結果如圖2所示，隨著組裝層數的增加，循環伏安曲線中氧化峰與還原峰強度增大，當組裝層數超過2層時，峰強基本保持不變。
將(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾玻碳電極作為工作電極，鉬絲為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，構筑電化學傳感器，以HA為底物進行催化活性檢測檢測。在含有20ymol/L H2O2 的 0. lmol/L pH = 6. 5PBS 中，在 20 90°C溫度區間內， 溫度對(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2電極活性的影響如圖3所示。從圖中可以看出隨著溫度的升高，電極活性均保持在較高的水平在90°C仍保持了 30°C時92% 的活性，而在40 60°C溫度范圍內，活性均高于30°C時的活性。(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2電極在0.lmol/L pH = 6. 5PBS中， 在不同溫度下催化還原不同濃度H2O2的催化電流-濃度曲線如圖4所示。修飾電極在30°C 催化H2O2的靈敏度為0. 0314A · L/(mol · cm2)，相關系數為0. 9994 ；修飾電極在40°C催化 H2O2的靈敏度為0. 0357A-L/(mol · cm2)，相關系數為0. 9992 ；修飾電極在90°C催化H2O2的靈敏度為0.0247A*L/(mol*Cm2)，相關系數為0.9994。這說明本發明(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)n多層膜修飾電極在高溫條件下對H2A具有靈敏的響應和高效的催化能力，可應用于高溫下對H2A的檢測。在含有20ymol/L H2O2 的 0. lmol/L PBS 中，在 pH 值為 2. 0 7. 0 的范圍內，pH 值對(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2電極活性的影響如圖5所示。從圖中可以看出隨著底液酸度的增加，電極活性均保持在較高的水平在pH = 2. 0時仍保持了最適pH = 6. 5時86%的活性，而在pH = 3 4的條件下，活性均高于pH = 6. 5時的活性。(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2電極在pH= 3. 0和pH = 6. 5的 0. lmol/LPBS中催化還原不同濃度H2A的循環伏安曲線以及相應的催化電流-濃度曲線如圖6 9所示。修飾電極在pH = 3. 0的底液中催化H2A的線性范圍為0. 5 221 μ mol/L, 相關系數為0. 9992 ；修飾電極在pH = 6. 5的底液中催化H2A的線性范圍為1 121 μ mol/ L，相關系數為0.9991。這說明本發明(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)n多層膜修飾電極在強酸條件下對H2A具有靈敏的響應和高效的催化能力，可應用于強酸條件下對H2A的檢測。本發明的特點及效果在于本發明將脫氧核糖核酸與氧化還原蛋白或氧化還原酶復合，借助脫氧核糖核酸的耐高溫和耐酸性能提高了復合生物活性物質的耐高溫和耐酸性能；將復合生物活性物質與磷酸鋯納米片層層組裝，可以利用磷酸鋯納米片形成限域空間， 避免脫氧核糖核酸及氧化還原蛋白或氧化還原酶的流失，而且磷酸鋯納米片具有的熱穩定性、酸穩定性可以進一步提高復合生物活性物質的耐高溫和耐酸性能。因此本發明生物敏感多層復合膜適用于高溫和強酸環境，利用本發明生物敏感多層復合膜構建的電化學生物傳感器可以在高溫及強酸條件下對底物進行檢測，并具有靈敏的信號響應、較寬的線性范圍及良好的操作穩定性。
圖1是不同組裝層數(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)n多層膜的紫外-可見光譜圖。其中，橫坐標-波長，單位為納米(nm)；縱坐標-吸光度，無單位。圖2是不同組裝層數(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)n多層膜修飾的玻碳電極的循環伏安曲線。其中，橫坐標-電壓，單位為伏特(V)，相對于Ag/AgCl電極；縱坐標-電流，單位為微安(μ A)。圖3是在含有20 μ mol/L H2O2的0. lmol/L pH = 6. 5PBS中，溫度對(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2修飾電極活性的影響曲線。其中，橫坐標-溫度，單位為攝氏度CC )；縱坐標-活性百分數，單位為百分數(％ )。圖4是(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2修飾的玻碳電極在0. Imol/ LpH = 6. 5PBS中，在不同溫度下催化電流與H2A濃度的關系曲線。其中，橫坐標_過氧化氫的濃度，單位為微摩爾/升(μ mol/L)；縱坐標-電流，單位為微安(μΑ)。圖5是在含有20 μ mol/L H2O2的0. lmol/L PBS中，pH值對(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2修飾電極活性的影響曲線。其中橫坐標-PH值，無單位；縱坐標-活性百分數，單位為百分數(％)。圖6是(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾的玻碳電極在含有濃度分別為(a)0，(b)0.5, (c)l, (d)3，(e)7, (f) 13, (g)21，(h)31，(i)51，(j)81，(k)121， (1)171和(m) 221 μ mol/L的H2O2的0. lmol/L pH = 3. OPBS中的循環伏安曲線。其中，橫坐標-電壓，單位為伏特(V)，相對于Ag/AgCl電極；縱坐標-電流，單位為微安(μ A)。圖7是(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾的玻碳電極在 0. lmol/L pH = 3. OPBS中，催化電流與H2O2濃度的關系曲線。其中，橫坐標-過氧化氫的濃度，單位為微摩爾/升(μ mol/L)；縱坐標-電流，單位為微安(μ A)。圖8是(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾的玻碳電極在含有濃度分別為(a)0，(b)l，(c) 3，(d)7，(e)13, (f)21, (g)31，(h)51，⑴ 81 和(j)121ymol/ L的H2O2的0. lmol/L pH = 6. 5PBS中的循環伏安曲線。其中，橫坐標-電壓，單位為伏特 (V)，相對于AgAgCl電極；縱坐標-電流，單位為微安(μ A)。圖9是(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾玻碳電極在 0. Imol/LpH = 6. 5PBS中，催化電流與H2O2濃度的關系曲線。其中，橫坐標_過氧化氫的濃度，單位為微摩爾/升(μ mol/L)；縱坐標-電流，單位為微安(μ A)。
具體實施例方式實施例1 Α.磷酸鋯納米片溶膠的制備將3. 4g的&0C12 ·8Η20、IOmL質量分數為36%的濃鹽酸加入到IOmL去離子水中配成溶液I ；將86mL質量分數為85%的濃磷酸、5mL質量分數為36%的濃鹽酸加入到90mL去離子水中配成溶液II ；將溶液I與溶液II在室溫下同時加入到轉速為3000轉/分鐘的膠體磨中，反應2分鐘后懸濁液迅速脫離膠體磨；將所得懸濁液轉移到聚四氟乙烯容器中，懸濁液占聚四氟乙烯容器體積的40%，將聚四氟乙烯容器密封于水熱反應釜中，在180°C水熱處理192小時，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗滌濾餅至濾液PH值為6，將濾餅在50°C空氣氣氛中干燥后得到α-磷酸鋯顆粒； 將0. Ig α-磷酸鋯加入到50mL體積分數為0. 4%的四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫攪拌 20小時后得到澄清的磷酸鋯納米片溶膠。B.復合生物活性物質水溶液的制備將肌紅蛋白溶于去離子水配制成濃度為4g/ L的溶液，然后取2mg鯡魚精脫氧核糖核酸與ImL上述肌紅蛋白水溶液混合，攪拌12小時， 得到復合生物活性物質水溶液。
C.(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)n多層膜修飾玻碳電極的制備 將玻碳電極清洗干凈，然后用隊吹干；將該電極浸入到30g/L的聚苯乙烯硫酸鈉水溶液中 15分鐘后取出，用隊吹干；將該處理后的電極浸入肌紅蛋白-脫氧核糖核酸復合生物活性物質水溶液中15分鐘后取出，用去離子水沖洗干凈，用N2吹干；再將該電極浸入到濃度為 2. Og/L的磷酸鋯納米片水溶液中15分鐘后取出，用蒸餾水沖洗干凈，用隊吹干，完成一層 (磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)膜的制備；重復以上步驟，制備出(磷酸鋯納米片 /復合生物活性物質)n(n = 1，2，3，4，5，6)多層膜修飾電極。用日本島津UV-2501PC型紫外-可見分光光度計對多層膜的組裝過程進行監測，測試結果如圖1所示，多層膜中肌紅蛋白的Soret吸收帶出現在408. 5nm處，與肌紅蛋白溶液的吸收帶位置十分接近，并且該吸收帶強度隨組裝層數的增加線性增長，表明多層膜的組裝過程是連續均勻的。將本發明制備的(磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)n(n= 1，2，3，4，5，6)多層膜修飾電極作為工作電極，鉬絲為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，組成電化學生物傳感器。將該電化學生物傳感器的三電極體系置于0. lmol/L pH = 6. 5的磷酸鹽緩沖溶液(PBS) 中進行電化學性能表征，循環伏安測試結果如圖2所示，隨著組裝層數的增加，循環伏安曲線中氧化峰與還原峰強度增大，當組裝層數超過2層時，峰強基本保持不變，因此下面的測試均采用組裝兩層的(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2膜。將(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2膜修飾玻碳電極作為工作電極， 鉬絲為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，構筑電化學傳感器，以H2A為底物進行催化活性檢測檢測。在含有20ymol/L H2O2 的 0. lmol/L pH = 6. 5PBS 中，在 20 90°C溫度區間內， 溫度對(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2電極活性的影響如圖3所示。從圖中可以看出隨著溫度的升高，電極活性均保持在較高的水平在90°C仍保持了 30°C時92% 的活性，而在40 60°C溫度范圍內，活性均高于30°C時的活性。(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2電極在0.lmol/L pH = 6. 5PBS中， 在不同溫度下催化還原不同濃度H2O2的催化電流-濃度曲線如圖4所示。修飾電極在30°C 催化H2O2的靈敏度為0. 0314A · L/(mol · cm2)，相關系數為0. 9994 ；修飾電極在40°C催化 H2O2的靈敏度為0. 0357A-L/(mol · cm2)，相關系數為0. 9992 ；修飾電極在90°C催化H2O2的靈敏度為0. 0247A · L/(mol · cm2)，相關系數為0. 9994。這說明本發明生物敏感多層膜修飾電極在高溫條件下對H2A具有高效的催化能力、靈敏的響應和較寬的線性范圍，可應用于高溫下對H2A等底物的檢測。對同一批制備的5支電極，其催化20 μ mol/L H2O2的響應電流的相對標準偏差為 1.7%，表明生物敏感多層膜修飾電極具有良好的重現性，層層組裝法制備生物敏感多層膜的過程穩定可靠。實施例2 A.磷酸鋯納米片溶膠的制備將13. 6g的&0C12 · 8H20、20mL質量分數為38%的濃鹽酸加入到20mL去離子水中配成溶液I ；將130mL質量分數為85%的濃磷酸、IOmL質量分數為38%的濃鹽酸加入到20mL去離子水中配成溶液II ；將溶液I與溶液II在室溫下同時加入到轉速為5000轉/分鐘的膠體磨中，反應1分鐘后懸濁液迅速脫離膠體磨；將所得懸濁液轉移到聚四氟乙烯容器中，懸濁液占聚四氟乙烯容器體積的80%，將聚四氟乙烯容器密封于水熱反應釜中，在水熱處理48小時，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾， 用去離子水洗滌濾餅至濾液PH值為7，將濾餅在60°C空氣氣氛中干燥后得到α-磷酸鋯顆粒；將0.化0-磷酸鋯加入到200!^體積分數為0.2%的四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫攪拌8小時后得到澄清的磷酸鋯納米片溶膠。B.復合生物活性物質水溶液的制備將肌紅蛋白溶于去離子水配制成濃度為2g/ L的溶液，然后取0. 5mg鯡魚精脫氧核糖核酸與ImL上述肌紅蛋白水溶液混合，攪拌8小時， 得到復合生物活性物質水溶液。C.(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾玻碳電極的制備 將玻碳電極清洗干凈，然后用隊吹干；將該電極浸入到20g/L的聚苯乙烯硫酸鈉水溶液中 30分鐘后取出，用隊吹干；將該處理后的電極浸入肌紅蛋白-脫氧核糖核酸復合生物活性物質水溶液中30分鐘后取出，用去離子水沖洗干凈，用隊吹干；再將該電極浸入到濃度為 0. 5g/L的磷酸鋯納米片水溶液中30分鐘后取出，用蒸餾水沖洗干凈，用隊吹干，完成一層 (磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)膜的制備；重復以上步驟，制備出(磷酸鋯納米片/ 復合生物活性物質)2膜修飾電極。將(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2膜修飾玻碳電極作為工作電極， 鉬絲為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，構筑電化學傳感器，以H2A為底物進行催化活性檢測檢測。在含有20ymol/L H2O2 的 0. lmol/L PBS 中，在 pH 值為 2. 0 7. 0 的范圍內，pH 值對(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2電極活性的影響如圖5所示。從圖中可以看出隨著底液酸度的增加，電極活性均保持在較高的水平在pH = 2. 0時仍保持了最適pH = 6. 5時86%的活性，而在pH = 3 4的條件下，活性均高于pH = 6. 5時的活性。(磷酸鋯納米片/肌紅蛋白-脫氧核糖核酸)2電極在pH= 3. 0和pH = 6. 5的 0. lmol/LPBS中催化還原不同濃度H2A的循環伏安曲線以及相應的催化電流-濃度曲線如圖6 9所示。修飾電極在pH = 3. 0的底液中催化H2A的線性范圍為0. 5 221 μ mol/L, 相關系數為0. 9992 ；修飾電極在pH = 6. 5的底液中催化H2A的線性范圍為1 121 μ mol/ L，相關系數為0. 9991。這說明本發明生物敏感多層膜修飾電極在強酸條件下對H2O2具有高效的催化能力、靈敏的響應和較寬的線性范圍，可應用于強酸條件下對H2A等底物的檢測。對同一批制備的5支電極，其催化20 μ mol/L的H2A的響應電流的相對標準偏差為1. 5%，表明本發明生物敏感多層膜修飾電極具有良好的重現性，層層組裝法制備生物敏感多層膜的過程穩定可靠。實施例3 A.磷酸鋯納米片溶膠的制備將6. 8g的&0C12 · 8H20、5mL質量分數為36%的濃鹽酸加入到40mL去離子水中配成溶液I ；將30mL質量分數為85%的濃磷酸、5mL質量分數為36%的濃鹽酸加入到120mL去離子水中配成溶液II ；將溶液I與溶液II在室溫下同時加入到轉速為4000轉/分鐘的膠體磨中，反應1分鐘后懸濁液迅速脫離膠體磨；將所得懸濁液轉移到聚四氟乙烯容器中，懸濁液占聚四氟乙烯容器體積的60%，將聚四氟乙烯容器密封于水熱反應釜中，在200°C水熱處理96小時，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗滌濾餅至濾液PH值為6，將濾餅在55°C空氣氣氛中干燥后得到α -磷酸鋯顆粒；將0. Iga -磷酸鋯加入到IOOmL體積分數為0. 3%的四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫攪拌15小時后得到澄清的磷酸鋯納米片溶膠。B.復合生物活性物質水溶液的制備將血紅蛋白溶于去離子水配制成濃度為3g/ L的溶液，然后取Img鯡魚精脫氧核糖核酸與ImL上述血紅蛋白水溶液混合，攪拌10小時， 得到復合生物活性物質水溶液。C.(磷酸鋯納米片/血紅蛋白-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾玻碳電極的制備將玻碳電極清洗干凈，然后用隊吹干；將該電極浸入到20g/L的聚苯乙烯基磺酸鈉水溶液中 20分鐘后取出，用隊吹干；將該處理后的電極浸入血紅蛋白-脫氧核糖核酸復合生物活性物質水溶液中20分鐘后取出，用去離子水沖洗干凈，用N2吹干；再將該電極浸入到濃度為 1. Og/L的磷酸鋯納米片水溶液中20分鐘后取出，用蒸餾水沖洗干凈，用隊吹干，完成一層 (磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)膜的制備；重復以上步驟，制備出(磷酸鋯納米片/ 復合生物活性物質)2膜修飾電極。將本發明(磷酸鋯納米片/血紅蛋白-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾的玻碳電極作為工作電極，鉬絲為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，組成電化學生物傳感器進行電化學性能測試，結果表明血紅蛋白在多層膜中實現了良好的直接電化學行為，并且具有良好的耐高溫及耐酸性的能力，(磷酸鋯納米片/血紅蛋白-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾的玻碳電極在高溫及強酸條件下對H2A具有高效的催化能力、靈敏的響應和較寬的線性范圍， 可應用于高溫或強酸條件下對H2A等底物的檢測。對同一批制備的5支電極，其催化20 μ mol/L的H2A的響應電流的相對標準偏差為1. 8%，表明本發明生物敏感多層膜修飾電極具有良好的重現性，層層組裝法制備生物敏感多層膜的過程穩定可靠。實施例4 A.磷酸鋯納米片溶膠的制備方法同實施例3。B.復合生物活性物質水溶液的制備將辣根過氧化物酶溶于去離子水配制成濃度為4g/L的溶液，然后取2mg鯡魚精脫氧核糖核酸與ImL上述辣根過氧化物酶水溶液混合，攪拌10小時，得到復合生物活性物質水溶液。C.(磷酸鋯納米片/辣根過氧化物酶-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾玻碳電極的制備將玻碳電極清洗干凈，然后用隊吹干；將該電極浸入到30g/L的聚苯乙烯基磺酸鈉水溶液中20分鐘后取出，用隊吹干；將該處理后的電極浸入辣根過氧化物酶-脫氧核糖核酸復合生物活性物質水溶液中20分鐘后取出，用去離子水沖洗干凈，用隊吹干；再將該電極浸入到濃度為1. Og/L的磷酸鋯納米片水溶液中20分鐘后取出，用蒸餾水沖洗干凈，用N2吹干，完成一層(磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)膜的制備；重復以上步驟，制備出(磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)2膜修飾電極。將本發明(磷酸鋯納米片/辣根過氧化物酶-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾的玻碳電極作為工作電極，鉬絲為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，組成電化學生物傳感器進行電化學性能測試，結果表明辣根過氧化物酶在多層膜中實現了良好的直接電化學行為， 并且具有良好的耐高溫及耐酸性的能力，(磷酸鋯納米片/辣根過氧化物酶-脫氧核糖核酸)2多層膜修飾的玻碳電極在高溫及強酸條件下對H2A具有高效的催化能力、靈敏的響應和較寬的線性范圍，可應用于高溫或強酸條件下對H2A等底物的檢測。對同一批制備的5支電極，其催化20 μ mol/L的H2A的響應電流的相對標準偏差為1. 6%，表明本發明生物敏感多層膜修飾電極具有良好的重現性，層層組裝法制備生物敏感多層膜的過程穩定可靠。
權利要求
1.一種適用于高溫和強酸環境的生物敏感多層膜，其特征在于該生物敏感多層膜由磷酸鋯納米片層與復合生物活性物質層重復疊加構成，其組成為(磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)n，其中磷酸鋯納米片帶負電，復合生物活性物質帶正電，η為組裝的(磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)膜的層數，取值范圍為1 6。
2.如權利要求1所述的生物敏感多層膜，其特征在于，所述磷酸鋯納米片厚度為1 20nm，徑向尺寸為300 1500nm。
3.如權利要求1所述的生物敏感多層膜，其特征在于，所述的復合生物活性物質由氧化還原蛋白或氧化還原酶與脫氧核糖核酸復合而成；氧化還原蛋白或氧化還原酶為肌紅蛋白、血紅蛋白、細胞色素C、辣根過氧化物酶中的一種；脫氧核糖核酸為鯡魚精脫氧核糖核酸；氧化還原蛋白或氧化還原酶與脫氧核糖核酸的質量比為4 1 2 1。
4.一種制備如權利要求1 3所述的生物敏感多層膜的方法，利用帶相反電荷的磷酸鋯納米片和復合生物活性物質間的靜電作用，依次層層組裝到玻碳電極表面，其特征在于 工藝步驟為將玻碳電極清洗干凈，然后用隊吹干；將該電極浸入到濃度為20 30g/L的聚苯乙烯硫酸鈉水溶液或聚苯乙烯基磺酸鈉水溶液中，15 30分鐘后取出，用隊吹干；將該電極浸入濃度為0. 5 2. Og/L的磷酸鋯納米片溶膠中，15 30分鐘后取出，用蒸餾水沖洗干凈， 用N2吹干；再將該電極浸入濃度為2. 5 6. Og/L的復合生物活性物質水溶液中，10 30 分鐘后取出，用蒸餾水沖洗干凈，用隊吹干，完成一層(磷酸鋯納米片/復合生物活性物質) 膜的制備；重復以上步驟，制備出(磷酸鋯納米片/復合生物活性物質)n多層膜修飾電極。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述濃度為0.5 2. Og/L的磷酸鋯納米片溶膠的制備方法為將&0C12 · 8H20、質量分數為36 38%的濃鹽酸加入到去離子水中配成溶液I ；將質量分數為85%的濃磷酸、質量分數為36 38%的濃鹽酸加入到去離子水中配成溶液II ；將溶液I與溶液II在室溫下同時加入到轉速為3000 5000轉/分鐘的膠體磨中，反應1 2分鐘后懸濁液脫離膠體磨。按照兩種溶液混合后的總體積計算，各反應物料濃度分別為JrOCl2 ·8Η20濃度為0. 044 0. 22mol/L，磷酸濃度為2. 0 IOmol/ L，鹽酸濃度為0. 50 2. Omol/L ；將所得懸濁液轉移到聚四氟乙烯容器中，懸濁液體積占聚四氟乙烯容器體積的40 80%，將聚四氟乙烯容器密封于水熱反應釜中，在180 240°C 水熱處理48 192小時，將水熱釜自然冷卻至室溫，開釜抽濾，用去離子水洗滌濾餅至濾液 PH值為6 7，將濾餅在50 60°C空氣氣氛中干燥后得到層狀α -磷酸鋯顆粒；按照固/ 液比為0. 5 2. 0g/L的比例將層狀α -磷酸鋯顆粒加入到體積分數為0. 2 0. 4%的四甲基氫氧化銨水溶液中，室溫下攪拌8 20小時，所得澄清溶膠即為剝離的磷酸鋯納米片溶膠，濃度為0.5 2. 0g/L。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述濃度為2.5 6. 0g/L的復合生物活性物質水溶液的制備方法為將肌紅蛋白、血紅蛋白、細胞色素C、辣根過氧化物酶等氧化還原蛋白或氧化還原酶中的一種用去離子水配制成濃度為2 4g/L的水溶液，按氧化還原蛋白或氧化還原酶脫氧核糖核酸的質量比為41 21比例與脫氧核糖核酸混合，攪拌8 12小時，得到濃度為2. 5 6. 0g/L的復合生物活性物質水溶液。
全文摘要
一種適用于高溫和強酸環境的生物敏感多層膜及其制備方法，屬于電化學生物傳感器技術領域。該生物敏感多層膜由磷酸鋯納米片層與氧化還原蛋白或氧化還原酶-脫氧核糖核酸形成的復合生物活性物質層重復疊加構成。制備方法是先制備出磷酸鋯納米片和復合生物活性物質，然后利用帶相反電荷的磷酸鋯納米片和復合生物活性物質間的靜電作用，依次層層組裝到玻碳電極表面。優點在于，利用層層組裝方法制備生物敏感多層膜，不受需固載的生物活性物質分子大小的限制；這種生物敏感多層膜修飾電極將脫氧核糖核酸的生物相容性與磷酸鋯納米片的穩定性相結合，在高溫和強酸條件下具有靈敏的信號響應、較寬的線性范圍及良好的操作穩定性。
文檔編號G01N27/327GK102507687SQ20111030554
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月11日 優先權日2011年10月11日
發明者楊文勝, 海波 申請人:北京化工大學