專利名稱：一種與雄激素產生下降相關的基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及男性生殖醫學領域；更具體地，本發明涉及一種與雄激素產生下降相關的基因，以及雄激素合成下降的雄性小鼠模型的建立方法。
背景技術：
隨著醫學科學的飛速發展，醫療水平不斷提高，全世界范圍內的人口平均壽命普遍延長，老年人比例在上升，世界正在步入老齡化時代。估計世界上60歲以上的人口將從 1999年的5. 93億(約占總人口的10% )增加到2050年的19. 7億(約占總人口的22%)。 老齡化時代使更多的男性有機會經歷更年期階段，給他們的身體和生活帶來諸多煩惱和不適。目前全世界有4. 08億，亞洲有2億，美國有2. 5千萬中老年男性正經歷著雄激素缺乏問題的困擾，再過30年，該數字可能會增加一倍。因此關注中老年男性雄激素缺乏，提高老年人生活質量，已成為全球關注的醫學重要課題。
目前，對于中老年男性雄激素缺乏的發病機制和治療方面的研究尚無理想的動物模型。國內有人采用自然衰老動物作為模型研究，存在飼養時間長，成本高等問題。因此， 目前還沒有非常成熟的雄激素缺乏或衰老的動物模型。
中老年雄激素缺乏發病機制仍不清楚，雄激素因何原因出現不同程度的下降，該領域的研究引起很多學者廣泛的興趣。有研究結果顯示，由脂類代謝紊亂導致的男性肥胖患者體內雄激素水平存在不同程度的下降，在脂類代謝恢復體重減輕后會有所提升，可以提示脂類代謝紊亂可能與雄激素缺乏有關。PLIN在參與脂類代謝的過程中發揮全局性的調控作用，主要包括調控膽固醇代謝和甘油三酯代謝兩個方面。
膽固醇是合成雄激素的前體物質，其在睪丸間質細胞膽固醇側鏈裂解酶 (P450scc)的作用下轉化成孕烯醇酮，孕烯醇酮在各種類固醇激素合酶的作用下合成雄激素，PLIN可能通過影響膽固醇代謝來干擾雄激素合成。有研究結果顯示，PLIN基因 rsl052700*A變異型可以提高總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平以及13041A/14995A亞型能夠降低高密度脂蛋白膽固醇的含量。除此之外，研究顯示雄激素可以降低總膽固醇和低密 度脂蛋白膽固醇水平，進而有利于膽固醇代謝。
目前，現有技術中對于PLIN基因是否可以影響動物雄激素的水平還沒有研究和報導。有必要進一步關注PLIN基因與雄激素之間的關系。發明內容
本發明公開了一種雄性小鼠雄激素產生下降新的相關基因PLIN。
本發明還公開了一種雄激素產生下降的雄性大鼠模型的建立方法。
在本發明的第一方面，提供一種脂粒外周蛋白(Perilipin，或PLIN)或其編碼基因的用途，用于制備檢測雄激素缺乏疾病的試劑。
在一個優選例中，所述的試劑是特異性識別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。
在另一優選例中，所述的試劑是特異性擴增脂粒外周蛋白的編碼基因的引物對；或是特異性識別脂粒外周蛋白的抗體。在另一優選例中，所述的抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。在本發明的另一方面，提供一種用于檢測雄激素缺乏疾病的試劑，其是特異性識 別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。在一個優選例中，所述的試劑是特異性擴增脂粒外周蛋白的編碼基因的引物對； 或是特異性識別脂粒外周蛋白的抗體。在另一優選例中，所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所 示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示。在本發明的另一方面，提供一種檢測用于檢測雄激素缺乏疾病的試劑盒，其中包 括容器，以及位于容器中的特異性識別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。在一個優選例中，所述的試劑盒中包括容器，以及位于容器中的引物對；所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
圖1、各組大鼠血清總睪酮水平柱狀圖。與對照組比較，模型組(低劑量組和高劑 量組)血清總睪酮(TT)濃度顯著下降，差異有統計學意義(P = 0.039)。圖2、各組大鼠血清超氧化物歧化酶活力柱狀圖。與對照組比較，模型組(低劑量 組和高劑量組)血清超氧化物歧化酶(S0D)活力下降，且隨染毒劑量增加，超氧化物歧化酶 (S0D)活力下降幅度加大，差異有統計學意義(P < 0. 0001)。圖3、各組大鼠血清丙二醛含量柱狀圖。與對照組比較，模型組(低劑量組和高劑 量組)血清丙二醛(MDA)含量升高，且隨染毒劑量增加，丙二醛(MDA)含量升高幅度加大， 差異有統計學意義(P = 0. 008)。圖4、PLIN-A和PLIN-B在模型組和對照組的差異表達。M Marker I ；H :模型組； C :對照組。PLIN-A和PLIN-B在模型組的表達水平與對照組相比，明顯下調。
具體實施例方式本發明人經過深入的研究，首次發現脂粒外周蛋白(perilipin，或PLIN)基因是 一種與雄激素產生下降相關的基因，可以該基因為標志物，來確定待測對象的雄激素產生 情況。PLIN基因及其用途PLIN基因是一種參與脂類代謝過程的基因，其編碼的蛋白質在脂類代謝中發揮重要的調控作用，其高度保守地存在于哺乳動物中。人PLIN基因的核苷酸序列參見GenBank 登錄號MM : 170290所示，編碼513aa的蛋白質；大鼠的PLIN基因的核苷酸序列參見 GenBank登錄號NM_013094.1所示，編碼517aa的蛋白質。
本發明人通過分析雄激素缺乏模型的基因表達情況，發現PLIN基因與雄性激素的產生下降密切相關。在雄激素缺乏動物模型中，PLIN基因及其亞型發生顯著的下調。
基于本發明人的新發現，可以以PLIN基因作為檢測(確定、鑒定或診斷)哺乳動物雄激素缺乏的標志物(標記物)。通過分析PLIN基因的表達情況(包括基因水平上或蛋白水平上)，從而得知受試者的雄激素產生情況，為疾病的診斷或預后提供依據，或可早期評估受試者罹患雄激素缺乏相關疾病(如更年期)的可能性。
可采用各種技術來檢測PLIN基因或其編碼的蛋白的表達情況，這些技術均包含在本發明中。基因水平上，檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA，或針對mRNA ;可用等已有技術如(但不限于)聚合酶鏈反應(PCR)、Southern印跡法、DNA序列分析等。蛋白水平上，可用的已有技術如(但不限于)=Western印跡法、酶聯免疫反應(ELISA)、SDS-PAGE 等，從而實現蛋白水平上的定性或定量。
作為本發明的一種優選方式，通過定量或半定量的聚合酶鏈反應(PCR)法來分析樣品中PLIN基因或其編碼的蛋白的表達情況以及表達量，從而可作出判斷。
較佳地，還設置正常的對照組，以確定PLIN基因或其編碼的蛋白在正常動物體中的表達情況。
試劑和試劑盒
本發明還提供了用于在分析物中檢測PLIN基因的表達情況的試劑。所述的試劑是特異性識別PLIN蛋白或其編碼基因的試劑。包括但不限于抗PLIN蛋白的抗體、特異性擴增PLIN基因的引物。
作為本發明的一種選擇方式，所述的試劑例如是特異性擴增PLIN基因的引物對。 作為本發明的優選方式，所述的引物對具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列(用于擴增PLIN基因)；或者所述的引物對具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的序列(用于擴增PLIN-A基因)；所述的引物對具有SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示的序列(用于擴增PLIN-B基因)。上述引物對擴增獲得的擴增產物具有合適的長度，且特異性高，對于復雜體系的擴增也具有良好的特異性，特別適合用于定量或半定量地檢測PLIN基因的表達情況。
本發明還提供了用于在分析物中檢測PLIN基因的表達情況的試劑盒，該試劑盒包括容器，以及位于容器中的引物對；所述的引物對具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列(用于擴增PLIN基因)；或者所述的引物對具有SEQ ID NO :3和SEQ ID N0:4所示的序列(用于擴增PLIN-A基因)；所述的引物對具有SEQ ID NO :5和SEQ ID N0:6所示的序列(用于擴增PLIN-B基因)。
此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑， 包括但不限于抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、洗液等。或者，所述的試劑盒中還可包括酶聯免疫試劑，二抗，顯色液等。
此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或核酸序列分析軟件等。
雄激素缺乏動物模型
本發明中，所述的“非人哺乳動物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猿猴。所述的非人哺乳動物在基因組的組成、器官解剖、個體的發育、代謝方式、疾病發病機制等方面和人類接近，可良好地應用于人類疾病發病機制、藥物藥理學研究等方面。優選的，所述的非人哺乳動物是鼠，如大鼠。
為了解決現有技術中沒有典型的雄激素缺乏動物模型的問題，本發明人經過廣泛的試驗，最終發現D-半乳糖是一種良好的動物亞急性衰老雄激素缺乏動物模型的造模試劑。D-半乳糖可以有效地模擬代謝紊亂造成的衰老，而衰老伴隨著性腺功能減退，血清睪酮水平下降。本發明在一定時間內連續給動物注射大劑量的D-半乳糖，使機體細胞內半乳糖濃度增高，在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇，這種物質不能被細胞進一步代謝而堆積在細胞內，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹、功能喪失和代謝紊亂，使機體內氧自由基增加，抗氧化能力減弱，最終導致衰老的發生。性腺衰老是生物衰老的一個重要方面，在衰老過程中，伴隨下丘腦-垂體功能減退，睪丸間質細胞(Leydig)合成雄激素的功能下降及其數目逐漸減少，導致中老年男子血清總睪酮(TT)平均每年下降約1%，游離睪酮(FT)下降 1.2%。所以，用一定劑量的D-半乳糖導致雄性動物睪丸功能減退，雄激素水平下降，氧自由基增加，該模型用以模擬自然衰老導致的雄激素缺乏具有可行性。
本發明的動物模型是采用D-半乳糖施用于非人哺乳動物而制備的。一種施用的方法是非人哺乳動物腹腔注射D-半乳糖。
更佳地，所述的非人哺乳動物是大鼠，所述方法包括給大鼠腹腔注射 200-1000mg/kg.天(較佳地300-500mg/kg.天)的D-半乳糖，持續1-3個月(較佳地為2 個月)。
本發明的動物模型，可用于研究和闡述動物雄激素水平下降的發生機制，為篩選和開發緩解雄激素水平下降的藥物提供途徑。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1、大鼠亞急性衰老雄激素缺乏動物建模方法及模型評價
I)實驗動物清潔級3月齡雄性SD大鼠，300±20g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司；
2)動物隨機分組分為對照組、低劑量模型組和高劑量模型組3組，每組8只大鼠；
3)實驗試劑D_半乳糖,購于Sigma公司，貨號G0625 ；
4) D-半乳糖溶液配制以生理鹽水為溶劑，低劑量模型組配制150mg/mlD-半乳糖生理鹽水溶液，高劑量模型組配制250mg/ml D-半乳糖生理鹽水溶液；
5)建模方法按O. 2ml/100g體積注射；對照組注射相應體積生理鹽水，低劑量模型組注射D-半乳糖300mg/kg.天，高劑量模型組注射D-半乳糖500mg/kg.天；腹腔注射2個月進行大鼠雄激素缺乏造模；
6)模型評價方法2個月后大鼠尾尖取血，分離血清，按試劑盒說明書操作，測定血清總睪酮水平、超氧化物歧化酶活力、丙二醛含量，評價造模結果。
結果見圖1-圖3，可見，給予D-半乳糖的大鼠，血清中總睪酮水平顯著下降、超氧化物歧化酶活力顯著下降、丙二醛含量顯著上升，且這種變化都是劑量依賴性的。
綜合上述結果，本發明人建立了一個典型的血清游離雄激素水平下降的、衰老的大鼠模型。
實施例2、PLIN及其兩個亞型(PLIN-A和PLIN-B)在雄激素缺 乏模型組和對照組的差異表達
對于造模成功的大鼠，采用Percoll非連續密度梯度離心法分離純化、3 β -HSD染色法鑒定睪丸間質細胞(Leydig),經原代培養72h后Trizol試劑法提取大鼠Leydig細胞總RNA，進一步采用基因芯片篩選相關脂類代謝差異表達基因，最后采用半定量RT-PCR的方法進行結果驗證。
進行RT-PCR的引物如下
PLIN
正向(SEQIDNO1)CAGGACGGCAAAAGACGC ；
反向(SEQIDNO2)CCACACCACCCAGGAAGC ；
PLIN-A
正向(SEQIDNO3)CGCAAGAAGAGCTGAGTAGCC ；
反向(SEQIDNO4)TGCCTTAGAAATGATGTGGGTC ；
PLIN-B
正向(SEQIDNO5)TTACGGATAACGTGGTAGACACT
反向(SEQIDNO6):AGGCACAAGTCGGAGGGT。
結果如圖4，顯示PLIN及其兩個亞型(PLIN-A和PLIN-B)在雄激素缺乏模型組和對照組的差異表達，與對照組相比，表達水平明顯下調。因此可見，PLIN及其兩個亞型 (PLIN-A和PLIN-B)的表達下調指示雄激素的下調。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范
權利要求
1.一種脂粒外周蛋白或其編碼基因的用途，用于制備檢測雄激素缺乏疾病的試劑。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的試劑是特異性識別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的試劑是特異性擴增脂粒外周蛋白的編碼基因的引物對；或是特異性識別脂粒外周蛋白的抗體。
4.一種用于檢測雄激素缺乏疾病的試劑，其是特異性識別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。
5.如權利要求4所述的試劑，其特征在于，所述的試劑是特異性擴增脂粒外周蛋白的編碼基因的引物對；或是特異性識別脂粒外周蛋白的抗體。
6.如權利要求5所述的試劑，其特征在于，所述的引物對的核苷酸序列如SEQID NO:1和SEQ ID NO 2所示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO :5和SEQ ID N0:6所示。
7.—種檢測用于檢測雄激素缺乏疾病的試劑盒，其中包括容器，以及位于容器中的特異性識別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，其中包括容器，以及位于容器中的引物對；所述的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO1和SEQIDNO:2所示;或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO4所示;或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO6所示()
全文摘要
本發明涉及一種與雄激素產生下降相關的基因。本發明人首次發現脂粒外周蛋白(perilipin，或PLIN)基因是一種與雄激素產生下降相關的基因，可以該基因為標志物，來確定待測對象的雄激素產生情況。
文檔編號G01N33/68GK103014143SQ20111029821
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者李潤生, 袁偉, 何華, 王健, 劉媛媛, 李玉華 申請人:上海市計劃生育科學研究所