專利名稱：一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法
技術領域：
本發明涉及一種生物體顯微和超微結構研究中的制片方法，尤其是一種大型海藻 離體染色表皮片層的快速制片方法。
背景技術：
顯微和超微結構研究是揭示生命現象和過程的必需手段，從荷蘭科學家虎克發明 顯微鏡以來已經有300多年，取得了許多進步，但該領域的研究往往受到樣品處理過程中 制片技術的好壞所影響。
大型海藻，是海洋中的大型低等植物，其長度從幾毫米至幾十米，常見的一般大多 屬于厘米級，粗度一般也就幾毫米長，常見的大型海藻體積都比較小。那么，開展其顯微和 超微結構研究已成了對其進行精確鑒定、分類和生命活動等研究必不可少的一個環節。然 而，針對多數如此小的生物，進行其顯微和超微結構研究在制片上存在很大難度，特別是針 對其表皮細胞的難度更大，因此目前現有的制片方法大多都是直接來源于高等植物。過去 該領域的學者主要從兩個方面進行染色觀察1.制作切片后染色觀察；2.樣品表面直接 觀察。這些方法存在明顯的不足1.切片只能觀察到部分組織和結構，不能顯現觀察對象 的全貌；2.通過表面直接觀察，由于其內部有其它組織細胞，導致觀察結果往往受到干擾； 3.無論是切片還是表面觀察，其超微觀察結果通常不好，無法獲得所需組織結構的清晳照 片等圖像信息。
我們在開展大型海藻的研究過程中，經常碰到此類問題，也曾尋找文獻，都未能解 決這個問題。如何有效地分離大型海藻的表皮層，成為了學科發展的一個難題。迄今為止， 尚未見到任何有關利用試劑特性來解離大型海藻表皮制片的報道。發明內容
針對現有技術中存在的不足，本發明提供一種大型海藻離體染色表皮片層的快速 制片方法。
一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，包括如下步驟(1)配制苯胺藍染色混合試劑母液配制比例為乳酸苯酚甘油水=1:1 :1 :1，然后以母液為基礎配制O. 5%(w/v)苯胺藍染色混合試劑；(2)選取樣品選擇目標樣品并進行清潔，去除藻體表面的雜質和雜藻，切成長約I一1. 5cm的樣品段；(3)染色及表皮細胞層解離取多數樣品，加入步驟(I)制得的混合試劑，一般4一8根 樣品加入混合試劑I滴，正常處理樣品的處理時間為10 —12分鐘，幼嫩組織的處理時間為 3— 4分鐘，讓樣品表皮細胞層與內皮層細胞間充分解離并染色；(4)染色表皮片層的分離切開表皮層，移去內部組織，可制成面積可達Icm2的染色表 皮細胞片層；(5)染色表皮片層制片染色表皮片層移置預先準備的載玻片，加保濕防腐劑，封片。
在步驟(I)中，先將苯酚、乳酸、甘油和水的混合過程中進行加熱。
在步驟(2)中，在超聲波清洗儀中處理樣品8-10分鐘，幼嫩組織處理3-4分鐘，用 潔凈海水沖洗樣品，鏡檢清洗效果。
在步驟(3)中，挑選藻體表面干凈、均勻的樣品，置于凹形玻片中，加入1-2滴苯胺 藍溶液，翻動樣品，使之均勻著色；針對樣品表皮細胞與內皮層細胞質地和致密性差異，利 用苯酚的腐蝕性特點，解離表皮與內皮層細胞間的粘質和胞間連結。
在步驟(4)中，左手用尖鑷子輕壓樣品內部組織部分，右手用解剖針輕輕從左至右 劃開表皮細胞層，用軟毛筆移去內部組織，可制成面積可達I Cm2的染色表皮細胞片層。
本發明的優點和積極效果如下I)能精確分離出表皮細胞層。
2)所制備的表皮片層面積大,適合多種用途。
3)制片速度快，花費極少，經濟適用。
4)表皮細胞不變形。
5)染色效果好，不易退色。
6)具有殺菌防腐作用，能較長時間保存。
本發明是一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制備方法，通過此種方法制備的 大型海藻表皮片層不但具有明顯的結構特征一超微結構清皙，細胞不變形，而且可展現連 續的形態結構差異，在形態學、解剖學、發育學及進化研究方面具有重要的應用價值。
具體實施方式
下面對本發明作進一步詳述，但不構成對本發明保護范圍的限制。本發明一方面 是通過混合試劑中苯胺藍對樣品進行染色，另一方面根據大型海藻表皮層和內皮層質地和 致密性存在差異的特性，利用苯酚的腐蝕性解離胞間粘質及其連結，達到表皮層和內皮層 分離的目的。
實施例1 :大型海藻成熟表皮片層的制備(I)選取樣品的成體部分，用毛刷和超聲波清洗儀清潔藻體表面2-3次，超聲波清洗儀 處理樣品一般每次8-10分鐘,去除藻體表面的雜質和雜藻,切成長約1-1. 5 cm左右的樣品 段，挑選其中生長均勻、粗細適中、分枝較少的樣品用于后續操作。
(2)把清潔、切段的樣品轉入載玻片凹槽中或小的培養皿或小燒杯中，一般按4根 樣品加入混合試劑I滴，處理樣品10-12分鐘，每隔3-4分鐘翻動樣品一次，讓樣品表皮細 胞層與內皮層細胞間充分解離并染色。
(3)染色及解離的樣品轉入小燒杯中，用蒸餾水清洗樣品3-4次，去除樣品表面混 合試劑，左手用尖鑷子輕壓樣品內部組織部分，右手用解剖針輕輕從一端至另一端劃開表 皮層，然后用鑷子輕輕固定樣品一端，再用細毛筆移去解離的內部組織，根據觀察需要制成 染色表皮細胞片層，較大的面積可達I cm2。
(4)用吸管吸取染色表皮細胞片層，轉移到載玻片凹槽中，用蒸餾水清洗2-3次。 準備干凈的載玻片，用吸管吸取一個染色表皮片層置于其上，慢慢用鑷子和解剖針展開片 層，使之單層平鋪于載玻片上。滴加1-2滴封片液,封片。
本實施例說明由于成熟藻體生長時間長，其表面附著的雜質和雜藻多且附著比較牢固，因此前處理需要的強度比幼藻體的大，其組織結構致密，所需要進行的染色和解離 時間也較長。由其制成的表皮片層韌性好，利于后續操作和永久封存。
實施例2 :大型海藻幼嫩表皮片層的制備(I)選取樣品的成體部分，用超聲波清洗儀清潔藻體表面I次，處理時間一般3-4分鐘， 去除藻體表面的雜質，切成長約1-1.5 cm左右的樣品段，挑選其中生長均勻、粗細適中、分 枝較少的樣品用于后續操作。
(2)把清潔、切段的樣品轉入載玻片凹槽中或小的培養皿或小燒杯中，一般按8根 樣品加入混合試劑I滴，處理樣品10分鐘，每隔3-4分鐘翻動樣品一次，讓樣品表皮細胞層 與內皮層細胞間充分解離并染色。
(3)染色及解離的樣品轉入小燒杯中，用蒸餾水清洗樣品2-3次，去除樣品表面混 合試劑，左手用尖鑷子輕壓樣品內部組織部分，右手用解剖針輕輕從一端至另一端劃開表 皮層，然后用鑷子輕輕固定樣品一端，再用細毛筆移去解離的內部組織，根據觀察需要制成 染色表皮細胞片層。
(4)用吸管吸取染色表皮細胞片層，轉移到載玻片凹槽中，用蒸餾水清洗1-2次。 準備干凈的載玻片，用吸管吸取一個染色表皮片層置于其上，慢慢用鑷子和解剖針展開片 層，使之單層平鋪于載玻片上。滴加1-2滴封片液,封片。
本實施例說明由于幼嫩藻體生長時間短，其表面組織幼嫩，附著的雜質較少，雜 藻一般沒有或很少且附著不牢固，因此前處理的強度要小，其組織致密性不夠強，所需要進 行的染色和解離時間也稍短，各類操作也應更輕緩，以免樣品組織過度解離而導致表皮層 小片狀脫落，不易制得較大面積的表皮片層。
權利要求
1.一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，包括如下步驟 (1)配制苯胺藍染色混合試劑母液配比為乳酸苯酚甘油水=1:1 :1 : 1，然后以母液為基礎配制O. 5% (w/v)苯胺藍染色混合試劑； (2)選取樣品選擇目標樣品并進行清潔，去除藻體表面的雜質和雜藻，切成長約I一1.5cm的樣品段； (3)染色及表皮細胞層解離取多數樣品，加入步驟(I)制得的混合試劑，一般4一8根樣品加入混合試劑I滴，處理正常樣品的處理時間為10 —12分鐘，幼嫩組織的處理時間為3— 4分鐘，讓樣品表皮細胞層與內皮層細胞間充分解離并染色； (4)染色表皮片層的分離切開表皮層，移去內部組織，可制成面積可達Icm2的染色表皮細胞片層； (5)染色表皮片層制片染色表皮片層移置預先準備的載玻片，加保濕防腐劑，封片。
2.根據權利要求1所述的大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，其特征是在步驟(I)中先將苯酚、乳酸、甘油和水的混合過程中進行加熱。
3.根據權利要求1所述的大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，其特征是在步驟(2)中，在超聲波清洗儀中處理樣品8-10分鐘，幼嫩組織處理3-4分鐘，用潔凈海水沖洗樣品，鏡檢清洗效果。
4.根據權利要求1所述的大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，其特征是在步驟(3)中，挑選藻體表面干凈、均勻的樣品，置于凹形玻片中，加入1-2滴苯胺藍溶液，翻動樣品，使之均勻著色；針對樣品表皮細胞與內皮層細胞質地和致密性差異，利用苯酚的腐蝕性特點，解離表皮與內皮層細胞間的粘質和胞間連結。
5.根據權利要求1所述的大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，其特征是在步驟(4)中，左手用尖鑷子輕壓樣品內部組織部分，右手用解剖針輕輕從左至右劃開表皮細胞層，用軟毛筆移去內部組織，可制成面積可達I cm2的染色表皮細胞片層。
6.根據權利要求1至5的任一權利要求所述一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制備方法，其制片速度快，經濟適用，表皮細胞不變形，染色穩定，具有殺菌防腐作用，能較長時間保存。
全文摘要
一種大型海藻離體染色表皮片層的快速制片方法，步驟包括混合試劑配制、一步完成離解并染色大型海藻表皮細胞層，人工操作快速制成面積可達1cm2的表皮細胞片層。本發明操作簡便、制作速度快、顯色效果和穩定性好，適用于顯微鏡和電鏡觀測以及表皮細胞超微結構觀察與研究。
文檔編號G01N1/30GK103033401SQ20111029660
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者丁蘭平, 黃冰心 申請人:汕頭大學