專利名稱：家蠶creb蛋白在家蠶卵滯育性早期鑒定中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種家蠶CREB蛋白在家蠶卵滯育性早期鑒定中的應用。
背景技術：
家蠶QBombyx mori )是一種典型的完全變態的鱗翅目昆蟲，作為最早被馴化的經濟昆蟲，其滯育性的早期鑒定具有重要意義。滯育是昆蟲為適應環境、維持個體生命活動和確保物種繁衍的生存策略，表現為一種正常的生理活性低下的發育停滯現象。滯育使昆蟲有能力在不利的季節中存活下來， 并能使昆蟲的繁殖階段和世代發生與有利的季節條件同步化，有效利用資源。在自然條件下，群體發育齊一，能增強雌雄個體間交配機率，以利產生更多的后代，保證“種”的繁衍，家蠶滯育性的調節是蠶種生產的重要技術環節。CREB(cAMP response element binding )蛋白是真核生物保守的轉錄因子之一， 我們在研究家蠶滯育調控機制的過程中，已克隆了家蠶CREB基因(徹OSS)，用Western blot方法在家蠶中分別檢測到分子量為34KD和^KD的兩個條帶，分別定名為徹CREBa和
，它們的表達模式與次代卵的滯育相關。
發明內容
本發明的目的在于提供一種家蠶CREB蛋白在家蠶卵滯育性早期鑒定中的應用， 并可應用于蠶業生產。本發明從螺旋絲顯現期的家蠶胚胎中抽提蛋白后，采用SDS-PAGE凝膠電泳和 Western Blot技術，通過軟件分析檢測家蠶胚胎中徹CREBa和徹CRE&量，計算徹CREBb/ 徹CREBa比值。結果發現，徹CREBb/徹CREBa等于或低于0. 04時，家蠶次代卵表現為非滯育； 徹CREBb/徹CREBa等于或大于0. 76時，家蠶次代卵表現為滯育卵。本發明的創新之處在于將徹CREB的表達模式作為快速準確地鑒定家蠶次代卵滯育性的指標。
圖1為不同品種家蠶卵徹CREB蛋白Westernblot的結果。圖2為根據圖1結果，利用分析軟件對條帶進行灰度分析，計算得到ifeOS^/ BmCREBa比值；滯育性根據對所養的蠶產卵后的調查確定，即產卵后在25°C條件下放置20 天，沒有發育孵化的為滯育，發育并孵化的為非滯育。具體實施方法 1.蛋白樣品的制備
1)將發育到螺旋絲發生期的蠶卵的胚胎用生理鹽水清洗后，加入100-150U1蛋白抽提液，用研磨器碾碎；
2)冷凍離心機40C、12000rpm離心30min取上清；3)上清中的蛋白用下述的Bradford法定量
2.標準曲線的制作配制 0. 25 mg/ml、0. 5 mg/ml、0. 75 mg/mlU mg/mlU. 25 mg/ml、 2mg/ml濃度的胎牛血清(BSA)作為標準溶液。在96孔板中各加入200 μ 1考馬斯亮蘭，分別再加入5 μ 1標準蛋白樣品和待測蛋白樣品，室溫黑暗中放置IOmin后，用酶標儀在595nm 檢測吸收值，制作標準曲線計算樣品蛋白濃度。4)蛋白上樣樣品的制備用SDS-PAGE凝膠電泳的上樣緩沖液(RSB)將抽提的蛋白稀釋到濃度為4 μ g/ μ 1，用100°C水煮沸5min后，立即移入冰上冷卻，作為電泳的上樣樣品，置-20°C中保存備用。3. SDS-PAGE 凝膠電泳
1)膠的制備方法如下1.Omm玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上，倒入按下面方法配制的12%分離膠至離上端Icm處，再緩慢加入Iml無菌水覆蓋在膠上，靜止 30min以上，待分離膠凝固。1 分離膠配制
(MH2O3. 3ml
30% Arc-Bic 溶液4. Oml
Tris Buffer (PH=8. 8)2.5ml
10% SDS0. Iml
10% APS0. Iml
TEMED4 μ 1
分離膠凝固后，倒去上面的水后，在分離膠上加入按下面方法配的5%濃縮膠至頂部， 插入1. Omm梳子，靜置30min以上，待濃縮膠凝固后備用。5%濃縮膠配制
(MH2O4. Iml
30% Arc-Bic 溶液1. Oml
Tris Buffer (ρΗ=6· 8)0. 75ml
10% SDS60 μ 1
10% APS60 μ 1
TEMED6 μ 1
2)上樣與電泳待濃縮膠凝固后，在電泳槽中加入足夠的電泳緩沖液，拔出梳子后上樣，上樣量為20 μ g /泳道，電泳電壓，濃縮膠為70V，分離膠為100V，電泳時間約3小時，至指示劑溴酚蘭至膠底邊即停止電泳。4.轉膜及顯影
1)先準備一張與膠大小一樣的PVDF膜和兩張濾紙；
2)PVDF膜先放入甲醇中浸15秒后，放入轉膜緩沖液中平衡30min以上。3)膠從玻璃板上取下后，輕輕刮去濃縮膠，做好標記，在轉膜緩沖液中平衡5min ；
4)轉膜膜置于膠的上面，兩面各放兩層濾紙，夾好后按正負極放入轉膜儀中，用100V 恒壓，在低溫下轉膜75min。5)封閉液與封閉用含0. 5%吐溫的緩沖液(PBST)配制成5%的脫脂奶粉溶液作為封閉液，將轉膜后的PVDF膜放在封閉液室溫下封閉2小時；6)抗體稀釋抗體用封閉液稀釋到目的濃度。市售的CREB作為一抗；
7)封閉后的PVDF膜用PBST清洗3次，每次IOmin；
8)加入一抗，常溫孵育池后，用PBST洗4次，每次lOmin。9)加入二抗，常溫孵育Ih后，用PBST洗4次，每次IOmin ；最后用PBS洗1次， 15min。10)顯色用ECL試劑盒發光
11)將發光的膜放入壓片盒中，用X感光片感光約5-60秒(曝光時間根據發光強弱)。 經顯影、定影和水洗后，晾干。5.定量分析對顯影后的X光片用掃描儀掃描，運用Quantity One軟件(Bio-Rad 公司)對顯影的徹CREBa、徹0 &蛋白條帶進行灰度分析，作為蛋白質含量。結果參見圖1和圖2。結果發現，徹CREBb/徹CREBa等于或低于0. 04時，家蠶次代卵表現為非滯育；徹CREBb/ 徹CREBa等于或大于0. 76時，家蠶次代卵表現為滯育卵。因此徹CREBb/徹CREBa的比值可以作為判定家蠶次代卵滯育性的指標。
權利要求
1. 一種家蠶CREB蛋白在家蠶卵滯育性早期鑒定中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種家蠶CREB蛋白在家蠶卵滯育性早期鑒定中的應用。本發明從螺旋絲顯現期的家蠶胚胎中抽提蛋白后，采用SDS-PAGE凝膠電泳和WesternBlot技術，通過軟件分析檢測家蠶胚胎中BmCREBa和BmCREBb量，計算BmCREBb/BmCREBa比值。結果發現，BmCREBb/BmCREBa等于或低于0.04時，家蠶次代卵表現為非滯育；BmCREBb/BmCREBa等于或大于0.76時，家蠶次代卵表現為滯育卵。
文檔編號G01N33/68GK102445547SQ20111029242
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月29日 優先權日2011年9月29日
發明者劉毅, 宋紅生, 張鴻雁, 徐安英, 鄭增長, 黃延旺 申請人:上海大學