專利名稱：一種ev71抗原酶聯反應檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說是涉及一種病毒抗原含量檢測試劑盒及其制備方法，更具體地說是涉及一種對EV71病毒抗原含量進行定性和定量的酶聯反應免疫試劑盒及其制備方法。
背景技術：
(一)EV71病毒及其疫苗的研究進展I、概述及致病機制腸道病毒71型(英文名為Human enterovirus 71),簡稱EV71 :EV71病毒屬于小RNA病毒科，病毒顆粒為典型的正二十面體結構。由于EV71引起的手足口病(hand-footand mouth disease ;HFMD)影響范圍的廣泛性、危害的嚴重性,該病在中國已納入丙類傳染·病管理。鑒于此，世界各國學者、生物公司正致力于EV71病毒疫苗的研究。EV71病毒屬于小RNA病毒科，病毒顆粒為典型的正二十面體結構。其基因組為單股正鏈RNA,長度約為7，408個核苷酸，編碼開放讀碼框(open-reading frame, 0RF)。EV71基因組編碼的多聚蛋白(polyprotein)約含2,193個氨基酸,該多聚蛋白可進一步被水解成P1、P2、P3三個前體蛋白(圖I)。經過進一步的剪切，Pl前體蛋白可以進一步成熟為VP1、VP2、VP3和VP4四個病毒結構蛋白，負責病毒顆粒的裝配和穩定；P2前體蛋白則進一步成熟為非結構蛋白(non-structural protein, nsp) 2A(特異性蛋白酶)、2B和2C ;P3前體蛋白則用以形成非結構蛋白3A、3B(VPg，5’末端結合蛋白)、3C(特異性蛋白酶)和3D(RNA-dependent RNApolymerase, RdRp)。腸病毒的流行與季節轉換、環境變異有著極大的關聯性，腸病毒只在夏季及初秋流行，每年六 九月為高峰期，氣溫過低的地區并不利于腸病毒生存。根據流行病學調查，腸病毒之傳染途徑主為糞一口傳染(stool-oral)，感染腸病毒的患者會經由糞便排出病毒，這些含有高濃度腸病毒的糞便會污染環境甚至地下水源，在公共衛生條件不佳的地區，極易經由污染的水源而散播該病毒。EV71對于中樞神經系統有極高的感染性，故臨床上出現之癥狀包括腦炎(encephalitis)、無菌性腦膜炎(aseptic meningitis)、急性無力肢體麻痹(acute flaccid paralysis)、手足口癥(hand-foot-mouth disease)、泡疫性咽峽炎(herpangina)、急性出血性結膜炎(acute hemorrhagic conjuctivitis)、肌肉僵直(myoclonicjerk)、頭痛(headache)、發燒(fever)及嘔吐(vomoting)等,而其中以手足口癥及泡疹性咽峽炎最為常見。一般而言，感染腸病毒多為無癥狀(約50 80%)或出現輕微類似感冒的癥狀，病人會自然痊愈而產生抗體，但因感染腸病毒且轉成重癥之患者卻有極高的機率死于心肺衰竭及廣泛性的腦干傷害，實不容小覷。3、流行病學人類腸病毒71型于1969年首次從加利福尼亞患有中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離出來的，這些病毒可被培養在恒河猴腎臟細胞(rhesus monkey kidneycell ；RhMK)及人胚二倍體細胞(human fetal diploid cell)中。若檢體取自病人糞便及組織即以人胚腎二倍體細胞(diploid strain of human fetal kidney cell ；HFDK)培養；若為咽喉拭子檢體則選用人胚肺二倍體細胞(diploid strain of human fetal lungcell)培養。經由這些細胞培養后純株化病毒分析，發現會出現典型由腸病毒所致的細胞病變(cytopathetic effect ；CPE)現象，由電子顯微鏡下觀察其形態(morphology)及物理化學(physicochemical)特性都與當時已知的其他腸病毒類似,但進行中和抗體試驗(neutralization test)或免疫擴散試驗(immunodiffusion test)后，卻發現其彼此間并不會有交互作用的現象，因此推測當時所發現的病毒為一種新型的腸病毒，故將該病毒株命名為腸病毒71型。手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區均有此病流行的報道。1957年新西蘭首次報道該病，1958年分離出柯薩奇病毒(Coxsackieviruses), 1959年提出手足口病名稱。手足口病的早期病原體主要為Cox A16型，但1969年美國在中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離出EV71病毒并被首次確認。此后EV71感染與Cox A16感染交替出現，成為手足口病的主要病原體。 3、產品研發加強對EV71型感染病患的防控工作，已成為我國病毒性傳染病管理工作的目標之一。而相關疫苗的研究開發和病毒抗原的快速檢測試劑盒是預防控制此傳染病的關鍵。在EV71病毒所編碼的四個結構蛋白中，VP1、VP2和VP3主要用來形成包裝病毒顆粒的衣殼(capsid)，而VP4則被包埋在病毒衣殼的內部，負責與核心(core)相互作用，用以穩定病毒的基因組，因此VP1、VP2和VP3形成了 EV71病毒的主要抗原決定簇，其中又以VPl的抗原性最強，而成為目前抗體研究與設計開發的主要靶點。同時，研究表明腸道病毒存在著眾多的型內、型間的交叉反應性，并且存在著較高的重組性。其中EV71與Cox A16的相似性達到了 80%，擁有很多共同表位，許多克隆抗體EV71的單抗具有了與Cox A16的交叉反應性。成為EV71抗原檢測方法建立的一項制約。常規的針對EV71病毒的診斷方法主要通過分離病毒，中和抗體檢測和免疫組織化學法來進行。但這些方法費時、費力，無法滿足疾病流行期間同時大量處理大量標本的需要。同時，鑒于EV71病毒的危害性,有必要開發一種簡單快速易行的檢測EV71病毒抗原表位含量的檢測方法。該研究使用的特異性識別EV71病毒Vpl中保守區域基因的單克隆抗體具有高效的EV71病毒的中和效果，同時與Cox A16交叉反應性，有效避免了抗原檢測中與EV7180%相似性的Cox A16的假陽性干擾。因此，所述方法的成功開發對于疫苗的研發中抗原表位這一有效組分的檢測有著重要的意義，同時該方法也為EV71疾病的防治、早期篩查、診斷工作提供了準確、簡便、有效的監測手段，具有廣泛的應用范圍和社會需求。(二)手足口病的研究進展I、概述及發病機制手足口病(Hand-foot-and-mouth disease)是由腸道病毒引起的傳染病，多發生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發癥。個別重癥患兒如果病情發展快，導致死亡。引發手足口病的腸道病毒有20多種(型)，柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B組的2、5型，以及腸道病毒71型均為手足口病較常見的病原體，其中以柯薩奇病毒A16型(Cox A16)和腸道病毒71型(EV71)最為常見。
2、流行病學手足口病是世界性傳染病，世界各地均有發生。1957年新西蘭首次報道該病，1958年分離出柯薩奇病毒，1959年提出手足口病名稱。手足口病的早期病原體主要為Cox A16型，但1969年美國在中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離出EV71病毒并被首次確認。此后EV71感染與Cox A16感染交替出現，成為手足口病的主要病原體。在國外，20世紀70年代中期，保加利亞、匈牙利相繼爆發以中樞神經系統感染為主要特征的EV71流行，僅保加利亞就有超過750例病例，149人致癱，44人死亡。20世紀90年代后期，EV71開始在東亞地區傳播。1997年馬拉西亞發生了主要由EV71引起的手足口病流行，4-8月共發生了2628例病例，僅4-6月就有29例病人死亡。死者平均年齡I. 5歲，病程僅2天。在我國分布也很廣泛，從南方的臺灣、福建、廣東、深圳、上海，到北方的山東、北京、天津直到吉林大約近20個省市均有發病報道。早在26年前上海就發現此病，1983年和1986年兩次在天津發生柯薩奇病毒A16型引起的手足口病暴發流行。1983年5月至10月間發生了 7000余病例。1995年武漢病毒研究所從手足口病患者中分離出腸道病毒71型毒 株。2008年3-5月在安徽省阜陽市出現的EV71感染暴發流行中，三個月內功出現了 69538人的感染，而死亡人數達到了 39人。從而引起的社會的恐慌。隨后該疾病被納入丙類傳染病管理。截至2009年4月17日全國31人死于手足口病其中安徽22例，廣東3例，浙江I例，廣西2例,湖南I例,海南2例。3、發展趨勢由于無疫苗、藥物等特異性的防控手段，該病存在隱性感染和輕癥病例多，傳染源難以發現和控制，兒童普遍易感，傳播途徑多，難以有效阻斷等原因，預防控制EV71帶來的手足口病難度較大。由于EV71引起的手足口病影響范圍的廣泛性、危害的嚴重性，該病在我國已納入丙類傳染病管理。鑒于此，國內外學者、生物公司正致力于EV71病毒疫苗的研究。由于腸道病毒分型多，且手口足病發病快且兇猛，目前對于此類疾病的診斷試劑盒多采用多種腸道病毒抗原的多克隆抗體或單克隆抗體，普遍生產成本較高，對生產工藝要求也較高，該研究采用的雙抗體酶聯反應檢測試劑盒及其制備方法具有特異性好、靈敏度高、方便快捷且經濟等特點。經文獻檢索等，到目前為止，尚未發現有新的針對EV71病毒Vpl中保守區域基因的單克隆抗體及相應的酶聯反應檢測試劑盒及其制備方法方面的報道。
發明內容
本發明所需要解決的技術問題是提供了新的EV71病毒檢測試劑盒及其制備方法，即一種新的EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒及其制備方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。也就是說，本發明針對現有技術的不足，通過大量生物技術實驗等實踐研究以及文獻檢索和理論研究，目的之一意在提供一類EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒，即提供一類用于檢測EV71病毒的檢測試劑盒，特別是可以進行定性與定量的EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒。本發明的目的之二是提供一種檢測EV71抗原含量的試劑盒或試劑，其包含特異性識別EV71病毒Vpl中保守區域基因的單克隆抗體或其保守性突變體或活性片段。本發明的目的之三是一種含有所述的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段的試劑盒或試劑的制備方法。本發明的目的之四是提供一種定量和定性檢測EV71抗原的方法，其中包括使用本發明所述的試劑盒或試劑。本發明的目的之五是提供所述的試劑盒或試劑在定量或定性檢測EV71抗原中的用途。(一)技術構思常規的針對EV71病毒的診斷方法主要通過分離病毒、中和抗體檢測和免疫組織化學法來進行。但這些方法費時、費力，無法滿足疾病流行期間同時大量處理大量標本的需要。迄今為止，現有的研究表明腸道病毒存在著眾多的型內、型間的交叉反應性，并且存在著較高的重組性。其中EV71與Cox A16的相似性達到了 80%，擁有很多共同表位，許多克隆抗體EV71的單抗具有了與Cox A16的交叉反應性，成為EV71抗原檢測方法建立的一項制約。同時，鑒于EV71病毒的危害性，有必要開發一種簡單快速易行的檢測EV71病毒抗原表位含量的檢測方法。本發明從抗EV71單克隆抗體具有高效的EV71病毒Vpl中保守區域基因的角度出發，希望能夠有效避免抗原檢測中與EV71具有80%相似性的Cox A16的假陽性干擾。因此，結合現有的單克隆抗體技術，進行改進和完善，特別是從EV71抗原酶聯反 應檢測試劑盒及其制備方法等方面進行探索，具有非常重要的意義。根據此想法和思路，發明人通過反復的實驗研究與分析和理論探索，已成功得到預期的研究結果和應用產品EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒。(二)EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒內設有陽性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液、特異性識別EV71病毒Vpl中保守區域基因的單克隆抗體或其保守性突變體或活性片段；所述的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段是生物標記或化學標記的；所述的標記是辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶、堿性磷酸酶標記或葡萄糖氧化酶標記或是熒光素、生物素、膠體金離子標記的；所述的單克隆抗體為特異性識別EV71病毒Vpl中保守區域基因的單克隆抗體或其保守性突變體或活性片段；所述的針對EV71的單克隆抗體是通過不同的表達系統進行EV71病毒結構蛋白Vpl中的保守區域基因克隆表達而得的抗原后獲得；所述的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段是生物標記或化學標記的；所述的生物標記是優選酶標記；所述的化學標記是優選熒光標記；所述的酶標記是包括辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶、葡萄糖氧化酶標記或堿性磷酸酶標記等中的一種或多種；進一步優選是采用過碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化物酶(簡稱HRP)；所述的熒光標記是包括熒光素標記、生物素或膠體金離子標記等中的一種或多種；進一步優選是采用過碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化物酶(簡稱HRP)；該EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒還可以包含針對EV71的單克隆抗體和/或包被有針對EV71的單克隆抗體的包被板。(三)EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒的制備方法EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟(I)抗原參考品的制備；(2)單克隆抗體的制備； (3)抗EV71單抗包被板的制備；(4)酶標抗體的制備；(5)樣品稀釋液、濃縮洗液、終止液的配置；(6)顯色液的配置；其中，所述的EV71抗原檢測方法是雙抗體夾心酶聯免疫法；(I)所述的抗原參考品制備方法如下將通過基因工程方法制備的EV71病毒Vpl純化液配制為含有抗原的溶液，然后向該溶液添加牛血清白蛋白作為保護劑。對其進行分裝，即制得EV71抗原參考品；(2)所述的單克隆抗體制備方法如下①采用制備的EV71純化液免疫小鼠.效價測定后，采用效價最高的小鼠取脾臟細胞與骨髓瘤細胞按比例進行融合，在培養液上培養融合雜交的瘤細胞；②進行三次亞克隆，每次亞克隆時，檢測各細胞孔的效價，對于OD值大于O. 6的孔的細胞進行克隆化，獲得高效價的針對不同位點的單克隆抗體的細胞株；③通過對獲得的細胞株進行大規模培養，并將培養后的細胞注射到小鼠腹腔，制備抗EV71單克隆抗體腹水，即得所述的單克隆抗體；(3)所述的抗EV71單抗包被板的制備方法如下使用制備的純化的抗EV71克單隆抗體作為包被抗體，以最佳包被抗體濃度加于酶標板反應孔內，并于低溫下放置。棄去包被液，用洗液洗板多次，拍干；加入封閉液于孔中，封閉，棄去封閉液，拍干，干燥，真空封裝，最后將封裝后的包被板于低溫下保存；(4)所述的酶標抗體的制備方法如下；將獲得的純化抗EV71單克隆抗體BE2采用過碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化物酶(HRP)，標記后加等體積甘油分裝，-20°C放置。其中所述的酶標抗體使用前采用方陣滴定法確定最適工作濃度；(5)所述的樣品稀釋液、濃縮洗液、終止液配置方法如下I)樣品稀釋液取牛血潰白蛋白10g，加入O. OlM PBS 1000ml，混合生物素防腐劑O. 5ml即得樣品
稀釋液。2)濃縮洗液取NaH2PO4. 2H20 2. 96g,Na2HPO4. 12H20 29. 0g,NaCl 234g 和 Tween_2020ml 加純化水至1000ml即得。
3)終止液取濃硫酸112ml加入純化水888ml即得。(6)所述的顯色液配置方法如下I)顯色液A取醋酸鈉27. 2g、檸檬酸3. 2g,30% H2O2O. 6ml加入雙蒸水至IOOOml即得。2)顯色液B取ΤΜΒ0. 4g、EDTA-Na2O. 4g、檸檬酸 I. 9g、甘油 IOOml 加入雙蒸水至 1000ml。 (四)EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒的使用方法EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒的使用方法，即EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒的檢測操作程序或檢測方法。本發明所述的檢測方法是通過ELISA方法來實現的；本發明的試劑盒或實際是通過ELISA進行對EV71抗原進行定量的。EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒的檢測操作程序如下A.定性檢測(I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做高倍數稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，加檢樣品、陽性對照；(3)恒溫水浴箱避光孵育，用洗液洗滌，拍干；(4)將標記抗體用加入各反應孔；(5)恒溫水浴箱避光孵育；(6)用洗滌液洗滌，拍干；(7)加入顯色液A于孔中，再加入顯色液B，震蕩將其混勻；(8)恒溫水浴箱避光孵育；(9)滴加終止液于孔中，震蕩混勻；(10)用酶標儀于450nm波長下讀數；(11)結果判定；Cut off值=2. I X N (N為陰性對照平均A值)a陰性對照平均A值應小于O. 3，否則實驗不成立。b標本A值小于Cut off值為陰性，大于等于Cut off值為陽性。B.定量檢測(I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做高倍數稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，將抗原標準品稀釋為不同年度，每稀釋度各加一孔；(3)加待檢樣品、標準品、樣品；(4)恒溫水浴箱避光孵育，用洗液洗滌，拍干；(5)將標記抗體用加入各反應孔；(6)恒溫水浴箱避光孵育；(7)用洗滌液洗滌，拍干；(8)加入顯色液A、顯色液B，震蕩將其混勻；(9)恒溫水浴箱避光孵育；
(10)滴加終止液，震蕩混勻；(11)用酶標儀于450nm波長下讀數；(12)結果判定；Cut off值=2· 1XN(N為陰性對照平均A值)a陰性對照平均A值應小于O. 3，否則實驗不成立。b采用直線回歸法計算樣品抗原滴度，R2值應大于O. 97。(五)主要用途與技術特長本發明為醫藥等行業提供了一種新的EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒及其制備方法，從而拓展了手足口病新診斷產品的應用。 本發明EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒是安全的，能夠用于醫療、診斷等工業和行業的大規模生產和應用。與現有的手足口病新診斷產品相比，本發明EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒在實際應用等方面，具有以下顯著特點(I)本試劑盒檢測的是EV71病毒結構蛋白Vpl，靈敏度更高，特異性更強。(2)本試劑盒采用BEl單克隆抗體包被，且采用BE2單克隆抗體作為酶標記第二抗體，有效的保證了試劑盒的特異性。(3)該試劑盒可用于EV71病毒各種基因型抗原的檢測，具有廣泛適用性，即廣譜性。(4)腸道病毒存在著眾多的型內、型間的交叉反應性，并且存在著較高的重組性，其中EV71與Cox A16的相似性達到了 80%。該方法與Cox A16無交叉反應，說明該HD6單克隆抗體與Cox A16無交叉反應，避免了許多克隆抗體EV71單抗具有與Cox A16的交叉反應性對EV71抗原檢測方法建立的制約因素；更加有利于EV71疾病的篩查、手足口病的疾病調查；對于EV71疫苗與Cox A16疫苗的區別、分析、比較至關重要。(5)本發明EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒價廉、安全、不含重金屬成分，提高了產品的應用面，安全有效，適用范圍更加廣泛，賦予了其更高的實用性，是一種有良好應用前景的EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒；(6)本發明EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒穩定、經濟，采用雙抗體ELISA檢測，降低了其生產成本；制備工藝簡單，質量控制簡便，便于企業大規模生產和醫藥商業應用；研制和改進該EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒具有顯著的社會效益、經濟效益。因此，本發明所述方法的成功開發對于疫苗的研發中抗原表位這一有效組分的檢測有著重要的意義，同時該方法也為EV71疾病的防治、早期篩查、診斷工作提供了準確、簡便、有效的監測手段，具有廣泛的應用范圍和社會需求。總之，本發明積極適應了現代生物、預防保健、臨床診斷等領域的工作需要和人性化服務的需要，本發明為研究開發該EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒，對改進和提高現有的該EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒具有重要價值。
具體實施例方式本發明研究了現有的手足口病診斷技術，提供了一種新的EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒，便于現代生物、預防保健、臨床診斷等領域的安全使用。
現就本發明EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒的制備方法，具體闡述如下(I)抗原參考品的制備；(2)單克隆抗體的制備；(3)抗EV71單抗包被板的制備；(4)酶標抗體的制備；(5)樣品稀釋液、濃縮洗液、終止液的配置；(6)顯色液的配置；其中，所述的EV71抗原檢測方法是雙抗體夾心酶聯免疫法；(I)所述的抗原參考品制備方法如下將通過基因工程方法制備的EV71病毒Vpl純化液配制為含有抗原的溶液，然后向該溶液添加牛血清白蛋白作為保護劑。對其進行分裝，即制得EV71抗原參考品；(2)所述的單克隆抗體制備方法如下①采用制備的EV71純化液免疫小鼠.效價測定后，采用效價最高的小鼠取脾臟細胞與骨髓瘤細胞按比例進行融合，在培養液上培養融合雜交的瘤細胞；②進行三次亞克隆，每次亞克隆時，檢測各細胞孔的效價，對于OD值大于O. 6的孔的細胞進行克隆化，獲得高效價的針對不同位點的單克隆抗體的細胞株；③通過對獲得的細胞株進行大規模培養，并將培養后的細胞注射到小鼠腹腔，制備抗EV71單克隆抗體腹水，即得所述的單克隆抗體；(3)所述的抗EV71單抗包被板的制備方法如下使用制備的純化的抗EV71克單隆抗體作為包被抗體，以最佳包被抗體濃度加于酶標板反應孔內，并于低溫下放置。棄去包被液，用洗液洗板多次，拍干；加入封閉液于孔中，封閉，棄去封閉液，拍干，干燥，真空封裝，最后將封裝后的包被板于低溫下保存；(4)所述的酶標抗體的制備方法如下；將獲得的純化抗EV71單克隆抗體BE2采用過碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化物酶(HRP)，標記后加等體積甘油分裝，-20°C放置。其中所述的酶標抗體使用前采用方陣滴定法確定最適工作濃度；(5)所述的樣品稀釋液、濃縮洗液、終止液配置方法如下4)樣品稀釋液取牛血潰白蛋白10g，加入O. OlM PBS 1000ml，混合生物素防腐劑O. 5ml即得樣品
稀釋液。5)濃縮洗液取NaH2PO4. 2H20 2. 96g,Na2HPO4. 12H20 29. 0g,NaCl 234g 和 Tween_2020ml 加純化水至1000ml即得。6)終止液取濃硫酸112ml加入純化水888ml即得。(6)所述的顯色液配置方法如下I)顯色液A取醋酸鈉27. 2g、檸檬酸3. 2g,30% H2O2O. 6ml加入雙蒸水至IOOOml即得。2)顯色液B
取TMBO. 4g、EDTA-Na20. 4g、檸檬酸 I. 9g、甘油 IOOml 加入雙蒸水至 1000ml。現就本發明EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒的使用方法，具體闡述如下試劑盒檢測操作程序A.定性檢測(I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做10 40倍稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，加用樣品稀釋液適當稀釋的待檢樣品、已稀釋的陽性對照，各兩孔，50 200ul/孔，加樣過程須在規定的時間內完成；(3) 37°C恒溫水浴箱避光孵育20 50分鐘，用洗液洗滌多次，拍干；(4)將標記抗體用加入各反應孔，20 80 μ I/孔。·(5) 37 °C恒溫水浴箱避光孵育20 50分鐘；(6)用洗滌液洗滌多次，拍干；(7)加入顯色液A20 80ul/孔，再加入顯色液B 20 80ul/孔，輕柔震蕩5 20秒將其混勻；(8) 37 °C恒溫水浴箱避光孵育5 10分鐘。(9)滴加終止液兩滴/孔,輕柔震蕩10 40秒混勻；(10)5 20分鐘內用酶標儀于450nm波長下讀數；(11)結果判定Cut off值=2. I XN(N為陰性對照平均A值，如小于O. 05按O. 05計)a陰性對照平均A值應小于O. 3，否則實驗不成立；b標本A值小于Cut off值為陰性，大于等于Cut off值為陽性。B.定量檢測(I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做10 40倍稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，將抗原標準品稀釋為 200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml。每稀釋度各加 I 孔，每孔 50 200 μ I ；(3)加用樣品稀釋液適當稀釋的待檢樣品，50 200ul/孔；標準品、樣品加樣過程須在5 30分鐘內完成；(4) 37°C恒溫水浴箱避光孵育10 60分鐘，用洗液洗滌多次，拍干；(5)將標記抗體用加入各反應孔，20 100 μ I/孔；(6) 37 °C恒溫水浴箱避光孵育20 40分鐘；(7)用洗滌液洗滌多次，拍干；(8)加入顯色液A20 150ul/孔，再加入顯色液B 20 150ul/孔，輕柔震蕩5 30秒將其混勻；(9) 37 °C恒溫水浴箱避光孵育5 10分鐘；(10)滴加終止液兩滴/孔，輕柔震蕩10 60秒混勻；(11)5 30分鐘內用酶標儀于450nm波長下讀數；(12)結果判定Cut off值=2. I XN(N為陰性對照平均A值，如小于O. 05按O. 05計)
a陰性對照平均A值應小于O. 3，否則實驗不成立；b采用直線回歸法計算樣品抗原滴度，R2值應大于O. 97。現就本發明EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒的試劑盒線性范圍、線性、特異性、靈敏性、準確性、精密性、重復性的檢測方法，具體闡述如下A.特異性特異性評價組裝的EV71病毒ELISA檢測試劑盒用于檢測腸道病毒以及其它病毒，結果表明該試劑盒的特異性很高。結果表明該檢測試劑盒的特異性高，與HSV、腺病毒、RSV、麻疹病毒、HAV等多種病毒沒有交叉。 B、靈敏度、線性、線性范圍靈敏度檢測的Vpl范圍5ng 1000ng/ml。病毒定量檢測(原液TCID50 = 107/IOOul)培養的EV71病毒原液檢測的TCID50為107/100ul，可以檢測100倍稀釋的培養病
毒上清。本發明最終需要制備成EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒進行應用，下面將列舉實施例進行進一步說明。如有問題，可以與發明人直接聯系。上述提供的一些實驗數據以及下列實施例中按前述發明內容給出幾種EV71抗原酶聯反應檢測試劑盒及其使用方法及一些試驗研究內容，但應該理解本發明并不僅限于此處所列出的研究內容，還應該理解此處所使用的術語僅用于描述特定的實施例，而并不是對本發明的限定。也就是說，在本發明中，以上所述的具體實施方式
和以下所述的實施例均是為了更好地闡述本發明，特別是這些實施例僅僅是對本發明的示例性描述，不能解釋為了對本申請的限制或者用來限制本發明的保護范圍。為了更清楚地說明本發明，下面結合如下實施例對本發明作詳細描述。實施例I、EV71抗原參考品的制備根據多年來發明人對全國不同疫區的腸道病毒EV71研究，對不同毒株的基因和蛋白序列進行分析，發明人選取EV71病毒結構蛋白Vpl中的保守區域基因進行克隆，采用不同的表達系統進行表達以制備抗原。表達過程中采用原核或真核的表達系統，以使制備的抗原具備更加天然的成分，以保證制備抗體的特異性。將通過基因工程方法制備的EV71病毒Vpl純化液配制為抗原含量為1000ng/ml的溶液，然后向該溶液添加1%牛血清白蛋白作為保護劑。對其進行分裝，I. Oml/瓶，制備EV71抗原參考品。實施例2、識別EV71抗原的單克隆抗體的制備采用制備的EV71純化液免疫BALB/c小鼠。用間接ELISA法進行效價測定，采用效價最高的BALB/c小鼠取脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按比例進行融合，在HAT培養液上培養融合雜交的瘤細胞。進行三次亞克隆，每次亞克隆時，檢測各細胞孔的間接ELISA法效價，對于OD值大于O. 6的孔的細胞進行克隆化，獲得高效價的針對不同位點的單克隆抗體的細胞株。通過對獲得的細胞株進行大規模培養，并將培養后的細胞注射BALB/c小鼠腹腔，制備抗EV71單克隆抗體腹水。通過ELISA(競爭法)與天然病毒裂解的反應證實所得抗體的位點特異性。所得兩株抗體分別命名為BEl和BE2。
實施例3、抗EV71單抗包被板的制備(或EV71抗原包被板的制備)使用制備的純化的抗EV71克單隆抗體BEl作為包被抗體，以最佳包被抗體濃度(10mg/ml，用O. 05M pH9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋)每孔IOOul加于酶標板反應孔內，并于4°C下放置14 20小時。棄去包被液，用洗液洗板3次，拍干；加入封閉液(1%牛血清白蛋白，O. OlM PBS)150ul/孔，于37°C下封閉I小時，棄去封閉液，拍干，37°C干燥I小時，真空封裝，最后將封裝后的包被板于2 8°C下保存。實施例4、酶標抗體的制備將獲得的純化抗EV71單克隆抗體BE2采用過碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化物酶(HRP)，標記后加等體積甘油分裝，-20°C放置，使用前采用方陣滴定法確定最適工作濃度。實施例5、樣品稀釋液、濃縮洗液、終止液的配置
(I)樣品稀釋液牛血潰白蛋白 IOgO. OlM PBSIOOOml生物素防腐劑 0.5ml⑵濃縮洗液
NaH2PO4.2H202.96g
Na2HPO4. 12H20 29. OgNaCl234g
Tween-2020ml
加純化水至I OOOml⑶終止液濃硫酸112ml純化水888ml實施例6、顯色液的配置(I)顯色液 A
醋酸鈉27. 2g
檸檬酸3.2g
30%H2020.6ml
雙蒸水至IOOOml(2)顯色液 B
TMB0.4g
EDTA-Na20.4g
檸檬酸1.9g
甘油IOOml
雙蒸水至IOOOml實施例7、試劑盒檢測操作程序之一
A.定性檢測(I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做30倍稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，加待檢樣品(用樣品稀釋液適當稀釋)、陽性對照(已稀釋)，各兩孔，60ul/孔，加樣過程在30分鐘內完成；(3)37°C恒溫水浴箱避光孵育40分鐘，用洗液洗滌四遍，拍干；(4)將標記抗體用加入各反應孔，70 μ I/孔；
(5) 37 °C恒溫水浴箱避光孵育45分鐘；(6)用洗滌液洗滌四遍，拍干；(7)加入顯色液A 80ul/孔，再加入顯色液B 80ul/孔，輕柔震蕩15秒將其混勻；(8) 37°C恒溫水浴箱避光孵育15 20分鐘；(9)滴加終止液兩滴/孔，輕柔震蕩40秒混勻；(10) 20分鐘內用酶標儀于450nm波長下讀數；(11)結果判定Cut off值=2. I XN(N為陰性對照平均A值，如小于O. 05按O. 05計)a陰性對照平均A值應小于O. 3，否則實驗不成立；b標本A值小于Cut off值為陰性，大于等于Cut off值為陽性。B.定量檢測(I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做20倍稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，將抗原標準品稀釋為100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml,每稀釋度各加 I 孔，每孔 150 μ I ；(3)加用樣品稀釋液適當稀釋的待檢樣品，IOOul/孔。標準品、樣品加樣過程在45分鐘內完成；(4) 37°C恒溫水浴箱避光孵育45分鐘，用洗液洗滌四遍，拍干；(5)將標記抗體用加入各反應孔，80 μ I/孔；(6) 37 °C恒溫水浴箱避光孵育45分鐘；(7)用洗滌液洗滌四遍，拍干；(8)加入顯色液A 80ul/孔，再加入顯色液B 80ul/孔，輕柔震蕩20秒將其混勻；(9) 37°C恒溫水浴箱避光孵育15 20分鐘；(10)滴加終止液兩滴/孔,輕柔震蕩40秒混勻；(11) 30分鐘內用酶標儀于450nm波長下讀數；(12)結果判定Cut off 值=2. IXN(N為陰性對照平均A值，如小于O. 05按O. 05計)a陰性對照平均A值應小于O. 3，否則實驗不成立；b采用直線回歸法計算樣品抗原滴度，R2值應大于O. 97。實施例8、試劑盒檢測操作程序之二A.定性檢測(I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做20倍稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，加待檢樣品(用樣品稀釋液適當稀釋)、陽性對照(已稀釋)，各兩孔，IOOul/孔，加樣過程須在15分鐘內完成；(3)37°C恒溫水浴箱避光孵育30分鐘，用洗液洗滌四遍，拍干；(4)將標記抗體用加入各反應孔，50 μ I/孔；(5) 37 °C恒溫水浴箱避光孵育30分鐘；(6)用洗滌液洗滌四遍，拍干；(7)加入顯色液A 50ul/孔，再加入顯色液B 50ul/孔，輕柔震蕩5秒將其混勻；
(8) 37 °C恒溫水浴箱避光孵育5 10分鐘；
(9)滴加終止液兩滴/孔,輕柔震蕩20秒混勻；(10) 10分鐘內用酶標儀于450nm波長下讀數；(11)結果判定Cut off值=2. IXN (N為陰性對照平均A值，如小于O. 05按O. 05計)a陰性對照平均A值應小于O. 3，否則實驗不成立；b標本A值小于Cut off值為陰性，大于等于Cut off值為陽性。B.定量檢測(I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做20倍稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，將抗原標準品稀釋為200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml,每稀釋度各加 I 孔，每孔 100 μ I ；(3)加用樣品稀釋液適當稀釋的待檢樣品，IOOul/孔。標準品、樣品加樣過程須在15分鐘內完成；(4)37°C恒溫水浴箱避光孵育30分鐘，用洗液洗滌四遍，拍干；(5)將標記抗體用加入各反應孔，50 μ I/孔；(6) 37 °C恒溫水浴箱避光孵育30分鐘；(7)用洗滌液洗滌四遍，拍干；(8)加入顯色液A 50ul/孔，再加入顯色液B 50ul/孔，輕柔震蕩5秒將其混勻；(9) 37 °C恒溫水浴箱避光孵育5 10分鐘；(10)滴加終止液兩滴/孔,輕柔震蕩20秒混勻；(11) 10分鐘內用酶標儀于450nm波長下讀數；(12)結果判定Cut off 值=2. IXN(N為陰性對照平均A值，如小于0. 05按0. 05計)a陰性對照平均A值應小于0. 3，否則實驗不成立；b采用直線回歸法計算樣品抗原滴度，R2值應大于0. 97。實施例9、試劑盒線性范圍、線性、特異性、靈敏性、準確性、精密性、重復性的檢測(I)特異性特異性評價組裝的EV71病毒ELISA檢測試劑盒用于檢測腸道病毒以及其它病毒，結果表明該試劑盒的特異性很高。表I檢測EV71病毒抗原含量方法特異性試驗450nm吸光度結果
權利要求
1.一種檢測EV71抗原的酶聯反應試劑盒，試劑盒內設有陽性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液，還裝有特異性識別EV71病毒Vpl中保守區域基因的單克隆抗體或其保守性突變體或活性片段。
2.根據權利要求I所述的試劑盒或試劑，其中所述的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段是生物標記或化學標記的。
3.根據權利要求2所述的試劑盒或試劑，其中所述的標記是辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶、堿性磷酸酶標記或葡萄糖氧化酶標記或是熒光素、生物素、膠體金離子標記的。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的試劑盒或試劑，其進一步包含針對EV71的單克隆抗體和/或包被有針對EV71的單克隆抗體的包被板。
5.一種檢測EV71抗原的方法，包括 A.制備抗原參考品； B.制備單克隆抗體； C.抗EV71單抗包被板的制備； D.酶標抗體的制備； E.樣品稀釋液、濃縮洗液、終止液的配置； F.顯色液的配置； 其中所述的單克隆抗體為特異性識別EV71病毒Vpl中保守區域基因的單克隆抗體或其保守性突變體或活性片段。
6.根據權利要求5的方法，其是通過雙抗體夾心酶聯免疫法進行的。
7.權利要求5的方法，其特征在于所述單克隆抗體采用過碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化物酶(HRP)。
8.權利要求5的方法，其特征在于所述的抗原參考品的制備方法為將通過基因工程方法制備的EV71病毒Vpl純化液配制為抗原含量為1000ng/ml的溶液，然后向該溶液添加1%牛血清白蛋白作為保護劑。對其進行分裝，I. Oml/瓶，制備EV71抗原參考品
9.權利要求5的方法，其特征在于所述單克隆抗體的制備方法為 A.采用制備的EV71純化液免疫BALB/c小鼠.用間接ELISA法進行效價測定，采用效價最高的BALB/c小鼠取脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按比例進行融合，在HAT培養液上培養融合雜交的瘤細胞； B.進行三次亞克隆，每次亞克隆時，檢測各細胞孔的間接ELISA法效價，對于OD值大于O.6的孔的細胞進行克隆化，獲得高效價的針對不同位點的單克隆抗體的細胞株； C.通過對獲得的細胞株進行大規模培養，并將培養后的細胞注射BALB/c小鼠腹腔，制備抗EV71單克隆抗體腹水。
10.權利要求5的方法，其特征在于所述抗EV71單抗包被板的制備方法為使用制備的純化的抗EV71克單隆抗體BEl作為包被抗體，以最佳包被抗體濃度(10mg/ml，用O. 05MPH9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋)每孔IOOul加于酶標板反應孔內，并于4°C下放置14-20小時。棄去包被液，用洗液洗板3次，拍干；加入封閉液(1%牛血清白蛋白，O. OlM PBS)150ul/孔，于37°C下封閉I小時，棄去封閉液，拍干，37°C干燥I小時，真空封裝，最后將封裝后的包被板于2-8 °C下保存。
11.權利要求5的方法，其特征在于在所述酶標抗體使用前采用方陣滴定法確定最適工作濃度。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體地說是涉及一種病毒抗原含量檢測試劑盒及其制備方法，更具體地說是涉及一種對EV71病毒抗原含量進行定性和定量的酶聯反應免疫試劑盒及其制備方法。本發明采用的雙抗體酶聯反應檢測試劑盒及其制備方法具有特異性好、靈敏度高、方便快捷且經濟等特點。
文檔編號G01N33/569GK102854317SQ201110289669
公開日2013年1月2日 申請日期2011年9月27日 優先權日2011年9月27日
發明者史晉, 劉昊智, 鮑路偉, 王文灝, 程超, 張愛暉 申請人:上海博沃生物科技有限公司