專利名稱：一種測定新霉素的螺旋免疫組裝傳感器的構建方法
技術領域：
一種測定新霉素的螺旋免疫組裝傳 感器，屬于材料化學技術領域。
背景技術：
螺旋廣泛存在于自然界中，天然大分子如DNA、蛋白質、膠原等都會呈現出神奇的螺旋結構，科學家們發現螺旋結構是這些分子能夠表現出生物活性的重要因素。被這些神奇的螺旋結構所吸引，科學家們設計合成了一些螺旋聚合物。具有螺旋結構的大分子對高分子科學家有著獨特的吸引力，因為合成的螺旋聚合物有著獨特的性質以及廣泛的用途。 螺旋大分子的潛在用途包括分子識別、手性分離、手性催化、數據存儲、顯示材料等。納米顆粒(nanoparticles，Nas) —般是指尺寸至少有一維在1-100 nm間的粒子。 納米尺度是處在原子簇和宏觀物體交界的過渡區域，處于這個區域的材料具有一些獨特性質，如小尺寸效應、表面、界面效應和量子尺寸效應等。空氣中納米顆粒雖然濃度很低，但具有很高的顆粒物數目。將宏觀物體細分成納米顆粒后，它的光學、熱學、電學、磁學、力學以及化學性質和大體積固體相比將會顯著不同。納米材料的小尺寸、化學成分、表面結構、溶解性、外形和聚集情況決定著它們特殊的物理化學性質，這些性質使得納米材料在將來有著廣泛的用途。隨著納米科技的發展，納米粒子組裝體系的研究變得日益活躍。納米粒子的二維和三維有序組裝結構也因其重要的物理和化學性質近年來受到人們的廣泛重視，它們在許多領域如傳感器、催化劑、磁化材料、表面增強拉曼和光學材料等有著潛在的應用。金納米材料與螺旋聚合物組裝，可通過表面等離子共振介導及手性分子誘導等機理產生圓二色譜(⑶)信號。但通過這種組裝系統結合免疫識別原理用于構建小分子檢測傳感器尚屬空白。
發明內容
本發明的目的是提供一種水溶性螺旋聚合物，通過免疫識別與金納米粒子組裝， 通過組裝后產生的圓二色譜(CD)信號對新霉素進行檢測。本發明的技術方案一種測定新霉素的螺旋免疫組裝傳感器的構建方法，包括 水溶性螺旋聚合物的制備，半抗原修飾螺旋聚合物，金納米粒子偶聯抗體，新霉素傳感器的建立；具體步驟為
(1)水溶性螺旋聚合物的制備 a、4_氨基苯甲酸甲酯的制備
2. 6g 4-溴苯甲酸甲酯，113mg三丁基膦，321g雙(二亞節基丙酮)鈀和3. 75g雙-(三甲基硅基)胺鋰，放入50mL錐形瓶中，氬氣保護，加入26mL無水甲苯。橡膠塞密封錐形瓶， 室溫下攪拌混合物，薄層色譜監控反應物。反應兩天后，粗產物加入IOOmL乙醚稀釋，同時加入少量鹽酸，再加入300mL乙醚攪拌。4-氨基苯甲酸甲酯沉淀用乙醚洗滌，空氣中干燥后，再加入IOOmL 2M NaOH溶液，并將混合物用IOOmL CH2Cl2萃取。再向其中加入IOOmL飽和NH4Cl溶液稀釋。將有機層用MgSO4除水，再蒸干。粗產物用硅膠色譜純化，正己烷乙酸乙酯(1 4 ν/ν )洗脫液，最終得4-氨基苯甲酸甲酯。b、4-甲酸氨苯甲酸甲酯的制備
氮氣保護條件下將1. 02g 4-氨基苯甲酸甲酯溶于3.4mL甲酸和8. 51mL乙酸。在50°C 下攪拌2h后，反應物減壓干燥。產物用乙醚和正己烷洗滌，室溫下真空干燥過夜，得產物 4-甲酸氨苯甲酸甲酯 。c、4-異氰基苯甲酸甲酯的制備
1. 07g 4-甲酸氨苯甲酸甲酯，ImL無水三乙胺和3mL無水CH2Cl2置入帶有回流冷凝氣的三口燒瓶中，溫度維持在-30°C。0. 2mL氯甲酸三氯甲酯溶于CH2Cl2加入反應物中，0°C 攪拌反應lh，再在20V反應0. 5h，加入50mL質量濃度7. 5%碳酸氫鉀水溶液。將有機層用 MgSO4除水，再蒸干。粗產物用硅膠色譜純化，正己烷乙酸乙酯(3:lv/v)洗脫液，最終得 4-異氰基苯甲酸甲酯。d、4-異氰基苯甲酸鈉的制備
4_異氰基苯甲酸甲酯棕色固體0.654g溶解于1.8mL乙醇，再加入8. 3mL IM NaOH溶液，混合物于氮氣保護下0°C反應1.5h。收集沉淀，乙醇洗滌，室溫下真空干燥過夜。最終得4-異氰基苯甲酸鈉。e、聚4-異氰基苯甲酸鈉的制備
4_異氰基苯甲酸鈉l.OOg置于反應瓶中，氮氣保護下加入11.8mL超純水、0. 2mL 0. 3M NiCl2 · 6H20,過夜反應，沉淀用甲醇洗滌，真空干燥，得聚4-異氰基苯甲酸鈉。f、聚4-異氰基苯甲酸的制備
0. 9g聚4-異氰基苯甲酸鈉置于IM HCl溶液中，得聚4-異氰基苯甲酸，即為水溶性螺旋聚合物。(2)半抗原修飾螺旋聚合物
1 μ L碳化二亞胺(EDC)和2. 4mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)加入到0. 5mL 100 mg/mL的步驟(1)合成的聚4-異氰基苯甲酸水溶液中，反應10-15 min左右活化。活化后的聚4-異氰基苯甲酸加入Img新霉素，室溫反應4h，透析除去未反應的藥物小分子。 得聚4-異氰基苯甲酸-新霉素復合物，即為半抗原修飾螺旋聚合物；
(3)金納米粒子偶聯抗體
IOmL 20nM 8nm金納米粒子溶液，加入200 μ L 100 μ g/mL新霉素抗體，0. IM K2CO3調節 PH值為8. 0，反應Ih ；得金納米粒子偶聯抗體；
(4)新霉素傳感器的建立
ImL 20nM步驟(3)合成的金納米粒子偶聯抗體加10 μ L 100mg/mL步驟(2)合成的半抗原修飾螺旋聚合物，加入0. Ι-lOOng/mL新霉素標準品，反應Ih后，取組裝好的體系100 μ L 于比色皿中，用水做空白對照，圓二色譜儀掃描波長200-800nm⑶值。所述8nm金納米粒子的合成用單寧酸和檸檬酸三鈉還原氯金酸合成；8nm金納米粒子的合成方案為潔凈的三口燒瓶中加入69mL超純水，0. 9mL質量濃度1%氯金酸溶液作為A液；取一潔凈的小瓶子，加入3. SmL質量濃度1%檸檬酸三鈉溶液，0. ImL質量濃度1%單寧酸溶液，0. 2mL 25mM碳酸鉀溶液和17. SmL超純水作為B液；A、B液均加熱到60°C，然后在高速攪拌下把B液迅速加入A液中，反應液在60°C下繼續攪拌30min形成深紅色溶液，然后將溶液加熱回流2min形成亮紅色溶液，最后冷卻到室溫形成檸檬酸穩定的金納米粒子， 透射電鏡顯示8nm。本發明的有益效果本發明提供一種水溶性螺旋聚合物聚4-異氰基苯甲酸，通過免疫識別(新霉素半抗原修飾螺旋聚合物)與金納米粒子(偶聯抗體)組裝，通過組裝后產生的圓二色譜(CD)信號對新霉素進行檢測。
圖1新霉素標準曲線
具體實施例方式實施例1
(1)水溶性螺旋聚合物的制備 a、4_氨基苯甲酸甲酯的制備
2. 6g 4-溴苯甲酸甲酯，113mg三丁基膦，321g雙(二亞節基丙酮)鈀和3. 75g雙-(三甲基硅基)胺鋰，放入50mL錐形瓶中，氬氣保護，加入26mL無水甲苯。橡膠塞密封錐形瓶， 室溫下攪拌混合物，薄層色譜監控反應物。反應兩天后，粗產物加入IOOmL乙醚稀釋，同時加入少量鹽酸，再加入300mL乙醚攪拌。4-氨基苯甲酸甲酯沉淀用乙醚洗滌，空氣中干燥后，再加入IOOmL 2M NaOH溶液，并將混合物用IOOmL CH2Cl2萃取。再向其加入IOOmL飽和 NH4Cl溶液稀釋。將有機層用MgSO4除水，再蒸干。粗產物用硅膠色譜純化，正己烷乙酸乙酯(1 4 )洗脫液，最終得4-氨基苯甲酸甲酯。b、4-甲酸氨苯甲酸甲酯的制備
氮氣保護條件下將1. 02g 4-氨基苯甲酸甲酯溶于3.4mL甲酸和8. 51mL乙酸。在50°C 下攪拌2h后，反應物減壓干燥。產物用乙醚和正己烷洗滌，室溫下真空干燥過夜，得產物 4-甲酸氨苯甲酸甲酯。c、4_異氰基苯甲酸甲酯的制備
1. 07g 4-甲酸氨苯甲酸甲酯，ImL無水三乙胺和3mL無水CH2Cl2置入帶有回流冷凝氣的三口燒瓶中，溫度維持在_30°C。0. 2mL氯甲酸三氯甲酯溶于CH2Cl2W入反應物中，0°C攪拌反應lh，再在20°C反應0. 5h，加入50mL7. 5%碳酸氫鉀水溶液。將有機層用MgSO4除水， 再蒸干。粗產物用硅膠色譜純化，正己烷乙酸乙酯(3:1)洗脫液，最終得4-異氰基苯甲酸甲酯。d、4-異氰基苯甲酸鈉的制備
4_異氰基苯甲酸甲酯棕色固體0.654g溶解于1.8mL乙醇，再加入8. 3mL IM NaOH溶液，混合物于氮氣保護下0°C反應1.5h。收集沉淀，乙醇洗滌，室溫下真空干燥過夜。最終得4-異氰基苯甲酸鈉。
e、聚4-異氰基苯甲酸鈉的制備
4_異氰基苯甲酸鈉l.OOg置于反應瓶中，氮氣保護下加入11.8mL超純水、0. 2mL 0. 3M NiCl2 · 6H20,過夜反應，沉淀用甲醇洗滌，真空干燥，得聚4-異氰基苯甲酸鈉。
f、聚4-異氰基苯甲酸的制備
0. 9g聚4-異氰基苯甲酸鈉置于IM HCl溶液中，得聚4-異氰基苯甲酸。
( 2)半抗原修飾螺旋聚合物
IuL EDC和2. 4mg su Ifo-NHS加入到0. 5mL 100 mg/mL的步驟(1)合成的聚4-異氰基苯甲酸水溶液中，反應10-15 min左右活化。活化后的聚4-異氰基苯甲酸加入I mg新霉素，室溫反應4h，透析除去未反應的藥物小分子。(3)金納米粒子偶聯抗體
IOmL 20nM 8nm金納米粒子溶液，加入200 μ L 100 μ g/mL新霉素抗體(購于北京華安麥科生物技術有限公司，北京市昌平區科技園區超前路6號)，0. IM K2CO3調節pH值為8.0， 反應Ih ；
(4)新霉素傳感器的建立
ImL 20nM步驟(3)合成的抗體修飾金納米粒子加10 μ L 100mg/mL步驟(2)合成的半抗原修飾螺旋聚合物，加入0. Ι-lOOng/mL新霉素標準品，反應Ih后，取組裝好的體系100 μ L 于比色皿中，用水做空白對照，圓二色譜儀掃描波長200-800nm⑶值。
權利要求
1.一種測定新霉素的螺旋免疫組裝傳感器的構建方法，其特征在于包括水溶性螺旋聚合物的制備，半抗原修飾螺旋聚合物，金納米粒子偶聯抗體，新霉素傳感器的建立；具體步驟為(1)水溶性螺旋聚合物聚4-異氰基苯甲酸的制備a、4-氨基苯甲酸甲酯的制備b、4-甲酸氨苯甲酸甲酯的制備c、4-異氰基苯甲酸甲酯的制備d、4-異氰基苯甲酸鈉的制備e、聚4-異氰基苯甲酸鈉的制備f、聚4-異氰基苯甲酸的制備(2)半抗原修飾螺旋聚合物(3)金納米粒子偶聯抗體(4)新霉素傳感器的建立。
2.根據權利要求1所述的測定新霉素的螺旋免疫組裝傳感器的構建方法，其特征在于(1)水溶性螺旋聚合物的制備a、4-氨基苯甲酸甲酯的制備2.6g 4-溴苯甲酸甲酯，113mg三丁基膦，321g雙(二亞節基丙酮)鈀和3. 75g雙-(三甲基硅基)胺鋰，放入50mL錐形瓶中，氬氣保護，加入26mL無水甲苯，橡膠塞密封錐形瓶， 室溫下攪拌混合物，薄層色譜監控反應物，反應兩天后，粗產物加入IOOmL乙醚稀釋，同時加入少量鹽酸，再加入300mL乙醚攪拌，4-氨基苯甲酸甲酯沉淀用乙醚洗滌，空氣中干燥后，再加入IOOmL 2M NaOH溶液，并將混合物用IOOmL CH2Cl2萃取，再向其中加入IOOmL飽和NH4Cl溶液稀釋，將有機層用MgSO4除水，再蒸干；粗產物用硅膠色譜純化，正己烷乙酸乙酯體積比1:4的混合溶劑作洗脫液，最終得4-氨基苯甲酸甲酯；b、4-甲酸氨苯甲酸甲酯的制備氮氣保護條件下將1. 02g 4-氨基苯甲酸甲酯溶于3. 4mL甲酸和8. 5ImL乙酸，在50°C 下攪拌2h后，反應物減壓干燥；產物用乙醚和正己烷洗滌，室溫下真空干燥過夜，得產物 4-甲酸氨苯甲酸甲酯；c、4-異氰基苯甲酸甲酯的制備\1. 07g 4-甲酸氨苯甲酸甲酯，ImL無水三乙胺和3mL無水CH2Cl2置入帶有回流冷凝氣的三口燒瓶中，溫度維持在-30°C，0. 2mL氯甲酸三氯甲酯溶于CH2Cl2加入反應物中，0°C 攪拌反應lh，再在20V反應0. 5h，加入50mL質量濃度7. 5%碳酸氫鉀水溶液，將有機層用 MgSO4除水，再蒸干，粗產物用硅膠色譜純化，正己烷乙酸乙酯體積比3:1作洗脫液，最終得4-異氰基苯甲酸甲酯；d、4-異氰基苯甲酸鈉的制備\4_異氰基苯甲酸甲酯棕色固體0.654g溶解于1.8mL乙醇，再加入8. 3mL IM NaOH溶液，混合物于氮氣保護下0°C反應1. 5h，收集沉淀，乙醇洗滌，室溫下真空干燥過夜，最終得 4-異氰基苯甲酸鈉；e、聚4-異氰基苯甲酸鈉的制備·4-異氰基苯甲酸鈉l.OOg置于反應瓶中，氮氣保護下加入11.8mL超純水、0. 2mL 0. 3M NiCl2 · 6H20,過夜反應，沉淀用甲醇洗滌，真空干燥，得聚4-異氰基苯甲酸鈉；f、聚4-異氰基苯甲酸的制備·0. 9g聚4-異氰基苯甲酸鈉置于IM HCl溶液中，得聚4-異氰基苯甲酸；(2)半抗原修飾螺旋聚合物·1 μ L碳化二亞胺EDC和2. 4mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺sulfo-NHS加入到0. 5mL 100 mg/mL的步驟(1)合成的聚4-異氰基苯甲酸水溶液中，反應10-15 min活化，活化后的聚 4-異氰基苯甲酸加入Img新霉素，室溫反應4h，透析除去未反應的藥物小分子；得聚4-異氰基苯甲酸-新霉素復合物，即為半抗原修飾螺旋聚合物；(3)金納米粒子偶聯抗體IOmL 20nM 8nm金納米粒子溶液，加入200 μ L 100 μ g/mL新霉素抗體， 0. IM K2CO3調節 PH值為8. 0，反應Ih ；得金納米粒子偶聯抗體；(4)新霉素傳感器的建立ImL 20nM步驟(3)合成的金納米粒子偶聯抗體加10 μ L 100mg/mL步驟(2)合成的半抗原修飾螺旋聚合物，加入0. Ι-lOOng/mL新霉素標準品，反應Ih后，取組裝好的體系100 μ L 于比色皿中，用水做空白對照，圓二色譜儀掃描波長200-800nm⑶值。
全文摘要
一種測定新霉素的螺旋免疫組裝傳感器的構建方法，屬于材料化學技術領域。本發明包括水溶性螺旋聚合物的制備，半抗原修飾螺旋聚合物，抗體偶聯金納米粒子，新霉素傳感器的建立。本發明提供一種水溶性螺旋聚合物聚4-異氰基苯甲酸，通過免疫識別(新霉素半抗原修飾螺旋聚合物)與金納米粒子(偶聯抗體)組裝，通過組裝后產生的圓二色譜(CD)信號對新霉素進行檢測。
文檔編號G01N33/53GK102435727SQ20111027948
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月20日 優先權日2011年9月20日
發明者王利兵, 胥傳來, 許宙 申請人:王利兵, 胥傳來, 許宙