專利名稱：一種人乳頭瘤病毒的分型方法
技術領域：
本發明涉及一種人乳頭瘤病毒的分型方法，利用寡核苷酸探針的溶解曲線和特定的熒光標記實現HPV亞型的分型檢測。
背景技術：
宮頸癌是婦女高發的惡性腫瘤之一，幾乎所有的宮頸癌標本中可檢出HPV DNA, HPV陰性者幾乎無罹子宮頸癌之憂，因此，HPV被確認為子宮頸癌發生的必要條件。人乳頭狀瘤病毒(HPV)型別有80多種，按其感染部位分為皮膚型和生殖道型HPV。大約有35種型別與生殖道感染有關，約20種與腫瘤相關。依據與癌發生關系,分為低危型HPV(如6、11、42,43和44型等可引起外生殖器濕疣、宮頸上皮內低度病變等)和高危型HPV(如HPV16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型與子宮頸癌及宮頸上皮內高度病變的發生相關)。而HPV16和18型感染率最高，即HPV16占所有型別的50%，其病理類型主要為子宮頸癌鱗狀上皮細胞癌；HPV18占14%，在子宮頸腺上皮細胞癌占主要地位；HPV45占8% ; HPV31占5% ;其他型別占23%。所以針對HPV分型的檢測對于宮頸癌的預防十分有必要。 由于目前尚無有效的技術手段能夠在體外培養HPV，所以目前為止沒有有效的HPV血清學分型方法。傳統的診斷方法主要是形態學檢查方法，包括巴氏涂片、液基薄層細胞檢查、陰道鏡等；免疫學檢查，主要是酶聯免疫反應。這些傳統的技術手段，存在較高假陽性和假陰性率，由于這些不足，分子生物學技術被引入HPV的臨床檢測，它們包括，原位雜交、雜交捕獲、PCR、PCR反向點雜交等技術，其中雜交捕獲是目前美國FDA唯一批準可用于臨床檢測的試劑盒，但這些方法有個共同的缺點就是操作復雜，耗時長大大制約了臨床的應用。
熒光定量PCR檢測技術是1990年誕生的技術，從一開始就受到廣泛的關注和應用，以熒光定量PCR儀為平臺，給種革新的技術層出不窮，主要包括，sybrgreen染料法、 Taqman探針法、分子信標、FRET等技術，他們各有優缺點和各自不同的應用領域。隨著熒光定量PCR技術越來越普及，熒光定量PCR儀成為了醫院檢驗科室不可缺少的儀器。
熒光定量PCR技術中，有一個大的技術類型，稱為溶解曲線分析。原理簡述如下 熒光定量PCR儀通過對反應體系逐漸增加溫度，同時監測每一個溫度變化中的熒光信號的強弱，得出曲線。對于染料法的熒光定量PCR實驗(例如采用sybrgreen)因為隨著反應體系中雙鏈DNA變性，熒光染料或者又回復到游離狀態導致熒光信號降低，用熒光信號改變的負的一次導數與溫度作圖，在擴增產物的溶解溫度上有一特征峰(Tm，DNA雙鏈解鏈50% 的溫度)；對于基于熒光標記的探針的熒光定量PCR實驗(例如分子信標，FRET，Eclipse探針)，探針上標記了不同熒光和粹滅基團，當這些探針與其互補的DNA鏈隨著反應體系溫度的改變，發生變性和復性的過程，從而使熒光強度發生變化，同樣用熒光信號改變的一次導數與溫度作圖，反應了探針與模板雜交時的特征峰，反應了探針的Tm值。
由于臨床常見HPV亞型超過20種，有些亞型與宮頸癌關系不大例如6、11型，有的與宮頸癌關系密切，例如16、18型，有些亞型與宮頸癌關系還不確切，例如53亞型。所以對患者進行HPV亞型分型的診斷很有必要，目前可用于HPV亞型的分型試劑盒大都采用PCR反向點雜交技術，但是這個方法操作時間長，過程繁瑣，需要在PCR擴增完畢后，打開PCR 反應管進行操作，所以極易造成PCR污染，而且結果通過顯示反應表示，帶有很大的主觀因素。熒光定量PCR技術可以解決這些問題，但是由于熒光通道受局限，目前常用熒光定量 PCR儀最為常用的檢測通道是FAM和Vic熒光通道，所以最為常用的Taqman探針的熒光定量PCR技術，對于HPV亞型分型檢測不是非常合適，應為一個亞型就需要一種熒光，如果僅用Fam和Vic這兩個通道，完成23個常見的HPV亞型檢測，就需要12個PCR反應管，這顯然不利于臨床的應用。我們利用熒光定量PCR技術中探針的溶解曲線這一技術途徑，因為探針可以根據各個亞型的序列人工設計，所以探針的Tm值也可認為設定，根據不同的Tm值， 也可以區分不同的亞型，即使只使用Fam和Vic這兩個檢測通道，也可以實現一個PCR反應管中最少4個HPV亞型的檢測。
我們在實驗中選用的是Quenched FRET技術，它是FRET技術的一個衍生，傳統的 FRET技術又稱為雙雜交探針，或者LightCycle探針。FRET探針由兩條和模版互補、且相鄰的特異探針組成(距離l_5bp)，上游探針的3'端標記供體熒光基團，相鄰下游探針的5'端標記受體熒光基團。當復性時，兩探針同時結合在模板上，供體基團和受體基團緊密相鄰， 激發供體產生的熒光能量被受體熒光基團吸收，使得檢測探頭可以檢測到受體熒光基團的熒光。當變性時，兩探針游離，兩基團距離遠，不能檢測到受體熒光基團的熒光。FRET探針檢測的信號是退火時的實時信號，每次檢測信號始終嚴格對應模版的數量，非累積信號，可以用于做Tm曲線和SNP檢測。Quenched FRET技術利用粹滅性基團，例如BHQ (Black Hole Quenchor)系列、Tamra Dabcyl> Eclipse等,標記在一條探針的3'端,突光基團標記在另一條探針的5,端。當探針同時雜交與模板時，粹滅基團與熒光基團互相靠近導致反應體系中的熒光減弱，當變性時兩探針游離導致熒光恢復。利用quenched FRET的方法可避免傳統FRET的方法對熒光染料選擇的局限，理論上各種熒光定量PCR常有的探針標記用的有機染料都可以使用。
探針由各自的TM值(DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結構降解一半時的溫度)。 所以Quenched FRET的數據是由熒光強度和TM值組成的。
發明內容
為解決上述技術問題，本發明提供一種人乳頭瘤病毒的分型方法，檢測結果準確。
本發明是通過以下的技術方案實現的
一種人乳頭瘤病毒的分型方法
(I)擴增樣品選用通用HPV擴增引物，上游引物是MY11、PGMY11或上述混合引物組，GP5、GP5+、SPF1或上述混合引物組；下游引物是MY09、PGMY09或上述混合引物組，GP6、 GP6+、SPF2或上述混合引物組；
(2)溶解曲線分析在HPV的DNA或者上一步的PCR產物中加入需要檢測亞型的探針，可選用的濃度范圍是10-500nM，在熒光定量PCR儀上需要相應的熒光檢測通道，設置的溶解曲線程序是溫度為20-95°C，溫度上升或下降梯度O. 1-5°C，每個梯度保持時間 O.5-60S。
所述步驟(I)中上游引物濃度50-1000nM，下游引物濃度50_1000nM，反應體系中鎂離子濃度的可選范圍1. 5-5mM。
本發明的有益效果為可以利用探針不同的熒光標記，和探針Tm值對HPV分型檢測，這樣可以用一種熒光通道檢測不同亞型的HPV。
圖1是本發明HPV18FAM檢測結果圖
圖2是本發明HPV33FAM檢測結果圖
圖3是本發明HPV35FAM檢測結果圖
圖4是本發明HPV53FAM檢測結果圖
圖5是本發明HPV58FAM檢測結果圖
圖6是本發明HPV39FAM檢測結果圖
圖7是本發明HPV43FAM檢測結果圖
圖8是本發明HPV45FAM檢測結果圖
圖9是本發明HPV56FAM檢測結果圖
圖10是本發明HPV59FAM檢測結果圖
圖11是本發明HPV66FAM檢測結果圖
圖12是本發明HPV68FAM檢測結果圖
圖13是本發明HPV73FAM檢測結果圖
圖14是本發明HPV83FAM檢測結果圖
圖15是本發明HPVMM4FAM檢測結果圖
圖16是本發明HPVB-globinFAM檢測結果圖
圖17是本發明HPV6FAM檢測結果圖
圖18是本發明HPV11FAM檢測結果圖
圖19是本發明HPV16FAM檢測結果圖
圖20是本發明HPV44FAM檢測結果圖
圖21是本發明HPV51FAM檢測結果圖
圖22是本發明HPV52FAM檢測結果圖
圖23是本發明HPV42FAM檢測結果圖
圖24是本發明HPV18FAM檢測結果圖具體實施方式
以下結合附圖，對本發明做進一步說明。
第一擴增樣品(如果病毒有足夠的拷貝數，或者實驗要求對靈敏度不高這步可省略)，選用通用HPV擴增引物，上游引物可以是MY11、PGMYll (混合引物組)、GP5、GP5+、 SPFl (混合引物組);下游引物可以是MY09、PGMY09 (混合引物組)、GP6、GP6+、SPF2 (混合引物組)。這些引物核酸序列已被相關文獻發表證實，它們可以很好的擴增HPV LI區域的 MY11/09區間。相關引物序列參見相關文獻。上下游引物可以組合使用，選取擴增效率符合要求的引物對使用，申請人利用評價了各種組合，認為使用MYll和PGMY09時擴增效率最高。擴增反應條件是
權利要求
1.一種人乳頭瘤病毒的分型方法，其特征在于是通過以下的步驟實現的(1)擴增樣品選用通用HPV擴增引物，上游引物是MY11、PGMYll或上述混合引物組， GP5、GP5+、SPFl或上述混合引物組；下游引物是MY09、PGMY09或上述混合引物組，GP6、 GP6+、SPF2或上述混合引物組；(2)溶解曲線分析在HPV的DNA或者上一步的PCR產物中加入需要檢測亞型的探針， 可選用的濃度范圍是10-500nM，在熒光定量PCR儀上需要相應的熒光檢測通道，設置的溶解曲線程序是溫度為20-95°C，溫度上升或下降梯度O. 1_5°C，每個梯度保持時間O. 5-60S。
2.如權利要求1所述的一種人乳頭瘤病毒的分型方法，其特征在于所述步驟(I)中上游引物濃度50-1000nM,下游引物濃度50_1000nM,反應體系中鎂離子濃度的可選范圍1.5_5mM0
全文摘要
本發明公開了一種人乳頭瘤病毒的分型方法，首先進行樣品擴增，選用通用HPV擴增引物，上游引物可以是MY11和PGMY11混合引物組，GP5、GP5+、SPF1的混合引物組；下游引物可以是MY09、PGMY09的混合引物組，GP6、GP6+、SPF2的混合引物組；然后進行溶解曲線分析，在HPV的DNA或者上一步的PCR產物中加入，需要檢測亞型的探針，可選用的濃度范圍是(10-500nM)，在熒光定量PCR儀上需要相應的熒光檢測通道，設置的溶解曲線程序進行分析。本發明可以用一種熒光通道檢測不同亞型的HPV，我們的附圖中提供了一個熒光檢測通道檢測3個HPV亞型的實例。
文檔編號G01N21/64GK102994645SQ20111027822
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月19日 優先權日2011年9月19日
發明者潘振華, 孫朝輝 申請人:潘振華