專利名稱：弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種弓形蟲抗體檢測試劑，尤其是涉及一種采用金標免疫層析技術 (immunochromatography)進行的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合快速檢測試劑條及其制備方法。
背景技術：
弓形蟲病(Toxoplasmosis)是剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，其病原體弓形蟲可寄生在人及多種動物的有核細胞內，人群及動物普遍易感。該病廣泛分布于世界各地，據統計全球約有10億人被弓形蟲感染([1]奚琳琳，李威.弓形蟲致病機理，毒力及基因型研究進展[J]. Journal of Pathogen Biology,2009,4(11) :859-861.)。弓形蟲病在我國分布很廣泛，全國各省、市、自治區均有弓形蟲感染的報道，我國正常人群平均感染率在4% 9%左右([2]劉敏，陳曉光.中國人群弓形蟲病的流行特征分析[J]. ACTA PARASITOLOGY ET MEDICA ENT0M0L0GICA SINICA, 2010，17C3).)，特殊人群如腫瘤患者、精神病患者、先天缺陷嬰幼兒、免疫抑制、免疫缺陷患者感染率更高。所幸的是極大多數免疫功能正常的成人或兒童被弓形蟲感染后常無癥狀或僅有輕微癥狀，且多能自愈并獲永久免疫力。但先天感染的胎兒、兒童以及免疫缺陷者被感染后，則預后極為嚴重。是造成艾滋病患者死亡的一個重要并發病。人類免疫缺陷病毒 (HIV)感染者約有20% 80%合并弓形蟲感染，更重要的是它也是造成人類先天畸形、缺陷、智力低下、死胎、早產的重要病原體之一。弓形蟲病的的診斷方法包括直接從臟器、血液、腦脊液等組織分離弓形蟲進行病原學診斷，需要幾天甚至幾周時間，費時費力，在實際應用中價值不大。臨床上常規檢測主要是應用各種血清學方法，檢測其特異IgG和IgM ([3]周彬，張玨，王柯，等.弓形蟲igg和 igm抗體雙標記時間分辨熒光免疫分析的建立及其初步臨床應用[J].中華檢驗醫學雜志， 2010,33(010) :957-959.),血清學方法可以診斷先天性、急性和慢性弓形蟲病，但由于大多數免疫缺陷的人或動物其抗弓形蟲的IgG滴度不會上升或不會出現高的IgM滴度，所以不能有效地用血清學方法對患有免疫缺陷的人或動物診斷弓形蟲病。另外，在抗原消失相當長時間后血清抗體滴度才會逐步下降，所以也不能應用于治療效果評價。目前檢測IgG抗體存在較高的假陽性，而IgM抗體檢測普遍靈敏度差等問題([4]韓靖云，劉倩，郭健.弓形蟲感染實驗室診斷的技術進展[J]. LABORATORY MEDICINE, 2009，24 (5).)。因此，對疾病的早期診斷幫助不大，急需建立一種具有高度敏感性，且價廉、快速、操作簡單、不需特殊設備，更適合于臨床的早期診斷方法。弓形蟲病的診斷與流行病學調查主要依賴于血清學試驗，正常人體感染弓形蟲多為隱性感染，當機體免疫力下降時，蟲體大量繁殖，侵入除紅細胞外的各組織細胞內寄生，造成各種組織的廣泛炎癥，從而出現臨床癥狀。人類感染弓形蟲后能誘導產生特異性抗體。感染早期IgM抗體增高，IgM在感染4個月后逐漸消失，在感染1個月后出現高濃度 IgG 抗體([5]KASPER D C, PRUSA A R, HAYDE Μ, et al. Evaluation of the vitroseciq immunodiagnostic system for detection of anti-toxoplasma immunoglobulin g and immunoglobulin m antibodies for confirmatory testing for acute toxoplasma gondii infection in pregnant women[J]. Journal of clinical microbiology,2009, 47(1) :164. ) 0因此，弓形蟲IgG抗體是弓形蟲病診斷和流行病學調查的一項重要指標。早期的血清學方法使用弓形蟲循環抗原。研究和診斷用的弓形蟲循環抗原是以弓形蟲感染小鼠腹腔獲得，這種方法花費大、獲得的抗原量少且不純(常混有宿主蛋白)， 因此假陽性也時有發生。隨著分子生物學技術的普及及弓形蟲抗原的相繼克隆，將重組抗原應用于弓形蟲實驗已經越來越多。目前研究比較多的弓形蟲的表面抗原(SAG1(P30)、 SAG2(P22)、SAG3(P43)、SAG4(P18))、蟲體棒狀體抗原(R0P1、R0P2)、致密顆粒蛋白(GRA1、 GRA7)等([6]熊美華，王秀珍，劉露霞，等.弓形蟲速殖子抗原的提取及蛋白分析[J]. CHINESE JOURNAL OF PARASITIC DISEASE CONTROL，2001，14 (3) ·)。采用重組 DNA 技術制備的重組抗原可以克服完整弓形蟲抗原的缺點，能快速、經濟地制備無限量特異重組TP抗原。弓形蟲抗體檢測方法包括ELISA、Western-blot等，其特異性均較高。然而，面對嚴峻的防制形式，不但需要特異準確的檢測手段，還需要一種更簡便快捷的試劑來篩查，以便為臨床和疾病防控提供對策。
發明內容
本發明的目的是提供一種弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條及其制備方法。所述弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條設有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜(NC膜)、弓形蟲IgG抗體檢測線、弓形蟲IgM抗體檢測線、對照線和吸收墊；所述加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線、弓形蟲IgM抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在弓形蟲IgM 抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原 SAGl (Ρ30)、SAG2 (Ρ22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體。所述載體板可采用PVC板。所述弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的制備方法，包括以下步驟1)制備弓形蟲重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、R0P2和GRA7 采用基因克隆技術，PCR擴增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原 SAGl(P30)、SAG2(P22)、R0P2 禾口 GRA7 ；2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜上的弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上的弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上的對照線處包被羊抗弓形蟲抗原 SAGl (Ρ30)、SAG2 (Ρ22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體，晾干；3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入1 %檸檬酸三鈉水溶液2. OmL,繼續加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存備用；4)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標記(1)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)的標記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調至 pH5. 4，加 100 μ g SAG1(P30)，混勻，放置 5min，加入 5% BSA Iml 混勻，4°C、10000r/min 離心lh，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀釋至1ml，得膠體金標記的SAGl (P30)抗原；(2)膠體金與弓形蟲抗原SAG2(P22)、R0P2和GRA7的標記方法與步驟(1)相同， 分別得膠體金標記的SAG2 (P22)、R0P2和GRA7抗原；(3)將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)、膠體金標記的 R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體
金墊；5)制備弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線、弓形蟲IgM抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體， 在弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (Ρ30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，用切條機切成條狀，得弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條。在步驟幻中，所述抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體、抗人IgM特異性片段μ 鏈單克隆抗體的濃度為1 ％ig/mL，羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7 的IgG抗體由抗SAGl (P30) -IgG抗體、抗SAG2 (P22) -IgG抗體和抗SAG3 (P43) -IgG抗體按體積比1 :1:1: 1混合，其終濃度為l ^ig/mL;四者點樣量為lyL/cm。在步驟3)中，所述檸檬酸三鈉的百分比濃度可為2%。在步驟4)中，所述將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)、 膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合，最適膠體金標記的膠體金標記的 SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2(P22)、膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7 抗原混合體積比為1 (0.2 5) (0.2 5) (0. 2 5)混合；所述烘干的溫度可為 37 °C。本發明采用弓形蟲重組蛋白作為弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的抗原， 建立弓形蟲IgM與IgG抗體膠體金免疫層析技術聯合快速檢測試劑，實現了特異性IgM和 IgG抗體聯合檢測，不僅具有簡便快速、特異性強、靈敏度高、準確可靠、成本低等優點，而且檢測所需標本量極小，不需要特殊儀器，可肉眼直接判讀結果的，對弓形蟲診斷和防治具有非常重要的社會和經濟價值。弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標本中弓形蟲IgM和IgG抗體的檢測。
圖1為本發明弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條實施例的結構組成示意圖。
圖2為實驗結果模式示意圖。在圖2中，A為使用前的示意圖，B為無效試驗(產品質量問題)，C為陰性結果，D為弓形蟲-IgG陽性結果，E為弓形蟲-IgM陽性結果，F為弓形蟲-IgG和弓形蟲-IgM均陽性結果；5為弓形蟲IgG抗體檢測線，6為弓形蟲IgM抗體檢測線，7為對照線。
具體實施例方式如圖1所示，本發明所述弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條實施例設有載體板1、加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜(NC膜)4、弓形蟲IgG抗體檢測線5、弓形蟲IgM抗體檢測線6、對照線7、吸收墊8。加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜(NC膜)4和吸收墊8依次粘貼在載體板1上表面，加樣墊2的一端設在膠體金墊3的一端上，膠體金墊3的另一端設在硝酸纖維膜(NC膜)4的一端上，吸收墊8的一端設在硝酸纖維膜(NC膜)4的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線5、弓形蟲IgM抗體檢測線6和對照線7從膠體金墊3開始依次設在硝酸纖維膜(NC膜)4上。在弓形蟲IgG抗體檢測線5上包被抗人IgM特異性片段μ 鏈單克隆抗體，在弓形蟲IgM抗體檢測線6上包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體， 在對照線7上包被羊抗弓形蟲抗原(SAG1 (Ρ30)、SAG2 (Ρ22)、R0P2和GRA7) IgG抗體。所述載體板采用PVC板，載體板的長度為6 10cm，載體板的寬度為2 4mm，載體板的厚度為1 2mm。加樣墊的材料為玻璃纖維，膠體金墊的材料是涂布膠體金結合物的玻璃纖維，所述吸收墊的長度為1 2cm，吸收墊可采用吸液紙。實施例1本發明所述弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的制備方法，包括以下步驟
1)制備弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7 采用基因克隆技術，PCR擴增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原 SAGl(P30)、SAG2(P22)、R0P2和 GRA7。2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜(NC膜)上的弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜(NC膜)上的弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜(NC膜)上的對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (Ρ30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，室溫晾干，密封室溫保存備用；所述抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體、抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體的濃度為1 ％ig/mL，羊抗弓形蟲抗原(SAG1 (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7) IgG抗體由抗SAGl (P30) -IgG抗體、抗SAG2 (P22) -IgG抗體、抗R0P2_IgG抗體和抗GRA7_IgG抗體按體積比1 :1:1: 1混合，其終濃度為l ^ig/mL;四者點樣量為lyL/cm。3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取1 %氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存備用；所述檸檬酸三鈉的濃度可為2%。4)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標記(1)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)的標記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調至 pH5. 4，加 100 μ g SAG1(P30)，混勻，放置 5min，加入 5% BSA Iml 混勻，4°C、10000r/min 離心lh，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀釋至1ml，得膠體金標記的SAGl (P30)抗原；(2)膠體金與弓形蟲抗原SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標記方法與步驟(1)相同， 分別得膠體金標記的SAG2 (P22)、R0P2和GRA7抗原；(3)將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)、膠體金標記的 R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體
金墊；將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)、膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原以體積比(0 5) (0 5) (0 5) (0 5)混合后， 均勻地涂于玻璃纖維膜上，在37°C烘干，制備成膠體金墊，密封備用。5)制備弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜(NC膜)和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜(NC膜)的一端上， 吸收墊的一端設在硝酸纖維膜(NC膜)的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線、弓形蟲IgM抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜(NC膜)上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人 IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，在弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ 鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (Ρ30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG 抗體，用切條機切成條狀，得弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條。取待檢標本血清10 μ 1，加樣于免疫層析檢測條加樣區，同時滴加100 μ 1生理鹽水，靜置20min觀察結果。只在檢測條對照區有一紫紅色條帶出現，則判為陰性；在檢測區及對照區均有一紫紅色條帶出現，則判為陽性；加樣檢測后，檢測區和對照區均不出現紫紅色條帶，為無效結果(見圖2)。實施例2與實施例1相似，區別在于金結合物墊僅由SAGl (P30)、R0P2和GRA7組成，不含有 SAG2 (P22)。結果判斷與實施例1相同。實施例3與實施例1相似，區別在于金結合物墊僅由SAG2 (P22)、R0P2和GRA7組成，不含有 SAGl (P30)。結果判斷與實施例1相同。實施例4與實施例1相似，區別在于待檢標本為腦脊液標本，結果判斷與實施例1相同。實施例5性能驗證試驗按實施例1的方案制備弓形蟲IgM與IgG抗體聯合快速檢測試劑， 然后進行性能驗證。1)外觀檢查白色包被反應膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，試劑條寬度在3 士 0. 1mm，無切斜現象。2)陽性標本符合率50份經ELISA(德國歐蒙公司)檢測確定的弓形蟲-IgM陽性參比血清，采用發明的試劑條檢出弓形蟲-IgM陽性50份，陽性標本符合率100% ；而50份經ELISA(德國歐蒙公司)檢測確定的弓形蟲-IgG陽性參比血清，采用發明的試劑條檢出弓形蟲-IgG陽性49份，陽性標本符合率98%。3)陰性標本符合率50份弓形蟲抗體陰性參比血清，采用發明的試劑條檢測未檢出陽性標本，陰性標本符合率100%。4)靈敏度檢測用衛生部室內質控血清(批號200902001)檢測，最低檢出限度 4NCU/mL。5)批內差異同一批次試劑條，用特征性陽性血清(FTA_ABS(德國歐蒙公司)檢測確定的臨床標本陽性弓形蟲-IgG、弓形蟲-IgM參比高、中、低血清)檢測，相同滴度檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。6)批間差異不同批次試劑條，用特征性陽性血清(FTA_ABS(德國歐蒙公司)檢測確定的臨床標本陽性弓形蟲-IgG、弓形蟲-IgM參比高、中、低血清)檢測，相同滴度檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。7)干擾試驗檢測結果不受標本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。8)交叉反應采用本試劑條，進行系統性紅斑狼瘡(n = 30)、類風濕病(n = 38)、 免疫性肝炎(n = 40)等自身免疫系統疾病的檢測，未發現交叉反應。9)穩定性檢測將試劑條放置37°C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化。
權利要求
1.弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條，其特征在于設有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、弓形蟲IgG抗體檢測線、弓形蟲IgM抗體檢測線、對照線和吸收墊；所述加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線、弓形蟲IgM抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在弓形蟲IgM 抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原 SAGl (Ρ30)、SAG2 (Ρ22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體。
2.如權利要求1所述的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條，其特征在于所述載體板為PVC板。
3.如權利要求1所述的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)制備弓形蟲重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、R0P2*GRA7采用基因克隆技術，PCR 擴增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、 SAG2(P22)、R0P2 禾口 GRA7 ；2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜上的弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人 IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上的弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上的對照線處包被羊抗弓形蟲抗原 SAGl (Ρ30)、SAG2 (Ρ22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體，晾干；3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存備用；4)膠體金與弓形蟲抗原SAGl(P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標記(1)膠體金與弓形蟲抗原SAGl(P30)的標記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調至 pH5. 4，加 100 μ g SAG1(P30)，混勻，放置 5min，加入 5% BSA Iml 混勻，4°C、10000r/min 離心lh，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用 TBS稀釋至1ml，得膠體金標記的SAGl (P30)抗原；(2)膠體金與弓形蟲抗原SAG2(P22)、R0P2和GRA7的標記方法與步驟⑴相同，得膠體金標記的SAG2 (P22)、R0P2和GRA7抗原；(3)將膠體金標記的SAGl(P30)抗原、膠體金標記SAG2 (P22)、R0P2和GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；5)制備弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線、弓形蟲IgM抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (Ρ30)、SAG2 (Ρ22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，用切條機切成條狀，得弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條。
4.如權利要求3所述的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟幻中，所述抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體、抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體的濃度為1 ％ig/mL。
5.如權利要求3所述的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體由抗SAGl (P30) -IgG抗體、抗SAG2 (P22) -IgG抗體、抗R0P2_IgG抗體與抗GRA7_IgG按體積比 1:1:1: 1混合，其終濃度為l ^ig/mL;四者點樣量為lyL/cm。
6.如權利要求3所述的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟幻中，所述檸檬酸三鈉的百分比濃度為2%。
7.如權利要求3所述的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2(P22)抗原、膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合，膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2(P2》抗原膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原以體積比 1 (0. 2 5) (0. 2 5) (0. 2 5)混合。
8.如權利要求3所述的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述烘干的溫度為37°C。
全文摘要
弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條及其制備方法，涉及一種弓形蟲抗體檢測試劑。提供一種弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條及其制備方法。試劑條設有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、弓形蟲IgG抗體檢測線、弓形蟲IgM抗體檢測線、對照線和吸收墊。制備弓形蟲重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7；硝酸纖維素膜的點樣；制備膠體金；膠體金與弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的標記；制備弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條。
文檔編號G01N33/544GK102305861SQ20111027805
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月19日 優先權日2011年9月19日
發明者劉莉莉, 張忠英, 張長弓, 楊天賜, 林麗蓉 申請人:廈門大學附屬中山醫院