專利名稱：弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種弓形蟲總抗體檢測免疫印跡試劑盒及其制備方法。
背景技術：
弓形蟲病(Toxoplasmosis)是剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，其病原體弓形蟲可寄生在人及多種動物的有核細胞內，人群及動物普遍易感。該病廣泛分布于世界各地，據統計全球約有10億人被弓形蟲感染([1]奚琳琳，李威.弓形蟲致病機理，毒力及基因型研究進展[J].中國病原生物學雜志，2009,4(11) :859-861.)。弓形蟲病在我國分布很廣泛，全國各省、市、自治區均有弓形蟲感染的報道，我國正常人群平均感染率在4% 9%左右([2]劉敏，陳曉光.中國人群弓形蟲病的流行特征分析[J].寄生蟲與醫學昆蟲學報，2010，17(3) :131-134.),特殊人群如腫瘤患者、精神病患者、先天缺陷嬰幼兒、免疫抑制、免疫缺陷患者感染率更高。所幸的是極大多數免疫功能正常的成人或兒童被弓形蟲感染后常無癥狀或僅有輕微癥狀，且多能自愈并獲永久免疫力。但先天感染的胎兒、兒童以及免疫缺陷者被感染后，則預后極為嚴重。是造成艾滋病患者死亡的一個重要并發病。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者約有20% 80% 合并弓形蟲感染，更重要的是它也是造成人類先天畸形、缺陷、智力低下、死胎、早產的重要病原體之一。現有的弓形蟲病的診斷方法包括直接從臟器、血液、腦脊液等組織分離弓形蟲進行病原學診斷，需要幾天甚至幾周時間，費時費力，在實際應用中價值不大。臨床上常規檢測主要是應用各種血清學方法，檢測其特異IgG和IgM([3]周彬，張玨，王柯，等.弓形蟲 IgG和IgM抗體雙標記時間分辨熒光免疫分析的建立及其初步臨床應用[J].中華檢驗醫學雜志，2010，33 (010) :957-959.),血清學方法可以診斷先天性、急性和慢性弓形蟲病，但由于大多數免疫缺陷的人或動物其抗弓形蟲的IgG滴度不會上升或不會出現高的IgM滴度，所以不能有效地用血清學方法對患有免疫缺陷的人或動物診斷弓形蟲病。另外，在抗原消失相當長時間后血清抗體滴度才會逐步下降，所以也不能應用于治療效果評價。目前檢測IgG抗體存在較高的假陽性，而IgM抗體檢測普遍靈敏度差等問題([4]韓靖云，劉倩，郭健.弓形蟲感染實驗室診斷的技術進展[J].檢驗醫學，2009，M (5) :393-395.)。因此，對疾病的早期診斷幫助不大，急需建立一種具有高度敏感性，且價廉、快速、操作簡單、不需特殊設備，更適合于臨床的早期診斷方法。弓形蟲病的診斷與流行病學調查主要依賴于血清學試驗，正常人體感染弓形蟲多為隱性感染，當機體免疫力下降時，蟲體大量繁殖，侵入除紅細胞外的各組織細胞內寄生，造成各種組織的廣泛炎癥，從而出現臨床癥狀。人類感染弓形蟲后能誘導產生特異性抗體。感染早期IgM抗體增高，IgM在感染4個月后逐漸消失，在感染1個月后出現高濃度 IgG 抗體([5]KASPER D C, PRUSA A R, HAYDE Μ, et al. Evaluation of the vitros eciq immunodiagnostic system for detection of anti-toxoplasma immunoglobulin gand immunoglobulin m antibodies for confirmatory testing for acute toxoplasma gondii infection in pregnant women[J]. Journal of clinical microbiology,2009, 47(1) :164-168.)。因此，弓形蟲IgG抗體是弓形蟲病診斷和流行病學調查的一項重要指標。早期的血清學方法使用弓形蟲循環抗原。研究和診斷用的弓形蟲循環抗原是以弓形蟲感染小鼠腹腔獲得，這種方法花費大、獲得的抗原量少且不純(常混有宿主蛋白)， 因此假陽性也時有發生。隨著分子生物學技術的普及及弓形蟲抗原的相繼克隆，將重組抗原應用于弓形蟲實驗已經越來越多。目前研究比較多的弓形蟲的表面抗原(SAG1(P30)、 SAG2(P22)、SAG3(P43)、SAG4(P18))、蟲體棒狀體抗原(R0P1、R0P2)、致密顆粒蛋白(GRA1、 GRA7)等([6]熊美華，王秀珍，劉露霞，等.弓形蟲速殖子抗原的提取及蛋白分析[J].中國寄生蟲病防治雜志，2001，14(3) :237-238.)。采用重組DNA技術制備的重組抗原可以克服完整弓形蟲抗原的缺點，能快速、經濟地制備無限量特異重組弓形蟲抗原。現有的弓形蟲抗體檢測方法包括ELISA、WeStern-bl0t等，其特異性均較高。采用 Western-blot方法制成的試劑盒，一般常規實驗室均可完成，不需要特殊設備，判讀也簡單明了。現市售的Western-blot試劑均為進口試劑，價格昂貴。面對嚴峻的防制形式，不但需要特異準確的檢測手段，還需要一種更經濟實用的試劑來篩查，以便為臨床和疾病防控提供對策。
發明內容
本發明的目的是提供一種弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒及其制備方法。所述弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒設有載體板、硝酸纖維膜、弓形蟲總抗體檢測線和對照線；所述弓形蟲總抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲總抗體檢測線處包被弓形蟲重組抗原，在對照線處包被人Ig抗體；辣根過氧化物酶標記抗人Ig抗體。所述弓形蟲重組抗原為SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2、GRA7重組抗原。所述載體板可采用PVC板。所述弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)制備弓形蟲重組抗原采用基因克隆技術，PCR擴增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原；2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜總抗體檢測線上包被弓形蟲重組抗原，在對照線處包被人Ig抗體，晾干；3)制備抗人Ig單克隆抗體以人Ig為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得穩定分泌抗人Ig單克隆抗體的雜交瘤細胞株；4)抗人Ig單克隆抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標記采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶(HRP)標記；5)制備免疫印跡試劑盒
將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，弓形蟲總抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上，在弓形蟲總抗體檢測線處包被弓形蟲重組抗原，在對照線處包被人Ig抗體，用切條機切成條狀，與酶標記的抗人Ig單克隆抗體及其底物共同組裝成弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒。在步驟1)、2)、5)中，所述弓形蟲重組抗原為 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2、GRA7等。在步驟2)中，所述弓形蟲重組抗原和人Ig抗體的濃度可為1 ％ig/mL ；點樣量可為 1 μ L/cm。在步驟3)中，采用ELISA的方法鑒定McAb效價在1 IO7以上。在步驟4)中，所述辣根過氧化物酶的底物由0. 03% (W/V)的過氧化氫和0. 07% (W/V)的二氨基聯苯胺組成。本發明提供了一種采用免疫印跡技術建立弓形蟲總抗體檢測試劑條，可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標本中弓形蟲總抗體的檢測。該檢測方法所需的標本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結果，且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低，應用廣泛。
圖1為本發明所述弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒中膜條實施例的結構組成示意圖。圖2為實驗結果模式示意圖。在圖2中，H為使用前的示意圖，G為無效試驗(產品質量問題)，F為陰性結果，A E為弓形蟲總抗體陽性結果；2為弓形蟲SAGl (P30)總抗體檢測線，3為弓形蟲SAG2(P22)總抗體檢測線，4為弓形蟲R0P2總抗體檢測線，5為弓形蟲 GRA7總抗體檢測線，6為對照線。
具體實施例方式以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。參見圖1，本發明所述弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒實施例設有載體板1、弓形蟲總抗體檢測線2 5，對照線6和硝酸纖維膜(NC膜)7。硝酸纖維膜7粘貼在載體板1上表面，弓形蟲總抗體檢測線2 5和對照線6依次設在硝酸纖維膜7上；在弓形蟲總抗體檢測線處分別包被弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、 SAG2 (P22)、R0P2、GRA7，在對照線6處包被人Ig抗體。所述載體板采用PVC板。所述弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)制備 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 弓形蟲重組抗原采用基因克隆技術，PCR擴增編碼弓形蟲螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2、GRA7。2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜總抗體檢測線上包被SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7弓形蟲重組抗原，在對照線處包被人Ig抗體，晾干。
3)制備抗人Ig單克隆抗體以人Ig為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得穩定分泌抗人Ig單克隆抗體的雜交瘤細胞株；4)抗人Ig單克隆抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標記采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶(HRP)標記。5)制備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，弓形蟲總抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲總抗體檢測線處包被弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和 GRA7，在對照線處包被人Ig抗體，用切條機切成條狀，和酶標記的抗人Ig單克隆抗體及其底物共同組裝成弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒。以下給出采用弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒檢測患者的臨床標本1)標本采用0. Olmol/LPBS緩沖液進行1 50稀釋。2)封閉采用5%脫脂奶粉(0. 01mol/L PBST緩沖液配制)作為封閉液，于室溫 (18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。3)血清溫育取出所需的膜條，將其放入溫育槽內，并編號。在溫育槽中分別加入 1. 5ml已稀釋樣本。于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。4)清洗吸去槽內液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。5)加酶結合物在溫育槽中加入1. 5ml已稀釋的酶結合物(采用辣根過氧化物酶標記的抗人Ig單克隆抗體為檢測抗體)，于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。6)清洗吸去槽內液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。7)底物溫育在溫育槽中分別加入1. 5ml底物液(DAB)，于室溫(18 25V )在搖擺搖床上溫育IOmin。8)終止吸去槽內液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次lmin。結果判斷將檢測膜條放置在結果判定模板中，風干后判斷結果。任何蛋白靶標出現的特異性條帶，均可判斷為陽性，可輔助診斷弓形蟲病(見圖2)。以下給出弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒的性能檢定1)外觀檢查試劑盒無破損，包被反應膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，無切斜現象。2)陽性標本符合率用弓形蟲總陽性的不同滴度的陽性參比血清各50份采用弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒檢定，計算陽性符合率。陽性參比血清的確定采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。3)陰性標本符合率用50份陰性參比血清檢定，計算陰性符合率。陰性參比血清的確定采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。4)批內差異同一批次弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。5)批間差異不同批次弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。
6)干擾試驗檢測結果不受標本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。7)交叉反應采用本弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒，進行系統性紅斑狼瘡(n = 30)、類風濕病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統疾病的檢測，未發現交叉反應。8)穩定性檢測應用Arrhenius法則，將弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒放置 370C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為 18個月。以下給出具體實施例。實施例1將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，弓形蟲總抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲總抗體檢測線處包被弓形蟲重組抗原SAGl (Ρ30)、SAG2 (Ρ22)、R0P2和 GRA7，在對照線處包被人Ig抗體，用切條機切成條狀，和酶標記的抗人Ig單克隆抗體及其底物共同組裝成弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒。1)標本采用0. Olmol/LPBS緩沖液進行1 50稀釋。2)封閉采用5%脫脂奶粉(0. 01mol/L PBST緩沖液配制)作為封閉液，于室溫 (18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。3)血清溫育取出所需的膜條，將其放入溫育槽內，并編號。在溫育槽中分別加入 1. 5ml已稀釋樣本。于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。4)清洗吸去槽內液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。5)加酶結合物在溫育槽中加入1. 5ml已稀釋的酶結合物(采用辣根過氧化物酶標記的抗人Ig單克隆抗體為檢測抗體)，于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。6)清洗吸去槽內液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。7)底物溫育在溫育槽中分別加入1. 5ml底物液(DAB)，于室溫(18 25V )在搖擺搖床上溫育IOmin。8)終止吸去槽內液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次lmin。結果判斷將檢測膜條放置在結果判定模板中，風干后判斷結果。任何蛋白靶標出現的特異性條帶，均可判斷為陽性，可輔助診斷弓形蟲病(見圖2)。實施例2與實施例1相似，其區別在于硝酸纖維膜檢測線僅由SAG2 (P22)、R0P2和GRA7弓形蟲重組抗原組成，不含有SAGl (P30)弓形蟲重組抗原。結果判斷與實施例1相同。實施例3與實施例1相似，其區別在于硝酸纖維膜檢測線僅由SAGl (P30)、R0P2和GRA7弓形蟲重組抗原組成，不含有SAG2(P22)弓形蟲重組抗原。結果判斷與實施例1相同。實施例4與實施例1相似，其區別在于硝酸纖維膜檢測線僅由SAG1(P30)、SAG2(P22)和 GRA7重組抗原組成，不含有R0P2重組抗原。結果判斷與實施例1相同。
實施例5與實施例1相似，其區別在于硝酸纖維膜檢測線僅由SAG1(P30)、SAG2(P22)和 R0P2弓形蟲重組抗原組成，不含有GRA7弓形蟲重組抗原。結果判斷與實施例1相同。實施例6與實施例1相似，其區別在于待檢標本為腦脊液標本，結果判斷與實施例1相同。實施例7性能驗證試驗按實施例1的方案制備弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒，然后進行性能驗證。1)外觀檢查試劑盒無破損，包被反應膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，無切斜現象。2)陽性標本符合率用弓形蟲總陽性的不同滴度的陽性參比標本各50份采用弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒檢定，計算陽性符合率。陽性參比標本的確定采用ELISA(進品試劑)法確定的臨床標本。3)陰性標本符合率用50份陰性參比標本檢定，計算陰性符合率。陰性參比標本的確定采用ELISA(進品試劑)法確定的臨床標本。4)批內差異同一批次弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒，用特征性標本檢測，要求陽性標本檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性標本檢測的結果陰性。5)批間差異不同批次弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒，用特征性標本檢測，要求陽性標本檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性標本檢測的結果陰性。6)交叉反應采用本弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒，進行系統性紅斑狼瘡(n = 30)、類風濕病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統疾病的檢測，未發現交叉反應。7)穩定性檢測應用Arrhenius法則，將弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒放置 370C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為 18個月。
權利要求
1.弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于設有載體板、硝酸纖維膜、弓形蟲總抗體檢測線、對照線，弓形蟲總抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲總抗體檢測線處包被弓形蟲重組抗原，在對照線處包被人Ig抗體；辣根過氧化物酶標記抗人Ig抗體。
2.如權利要求1所述的弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于所述弓形蟲重組抗原為 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2、GRA7，但不限于以上抗原。
3.如權利要求1所述的弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于所述載體板采用 PVC 板。
4.如權利要求1所述的弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)制備弓形蟲重組抗原采用基因克隆技術，PCR擴增編碼弓形蟲螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原；2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜總檢測線上包被弓形蟲重組抗原，在對照線處包被人Ig抗體，晾干；3)制備抗人Ig單克隆抗體以人Ig為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得穩定分泌抗人Ig單克隆抗體的雜交瘤細胞株；4)抗人Ig單克隆抗體的辣根過氧化物酶標記采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶標記；5)制備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，弓形蟲總抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上，在弓形蟲總抗體檢測線處包被弓形蟲重組抗原，在對照線處包被人Ig抗體，用切條機切成條狀，與酶標記的抗人Ig單克隆抗體及其底物共同組裝成弓形蟲總抗體免疫印跡試齊U盒。
5.如權利要求4所述的弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述弓形蟲重組抗原為SAG1(P30)、SAG2(P22)、R0P2、GRA7。
6.如權利要求4所述的弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述弓形蟲重組抗原和人Ig抗體的濃度為1 ％ig/mL；點樣量為1 μ L/cm。
7.如權利要求4所述的弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟3)中，采用ELISA的方法鑒定McAb效價在1 IO7以上。
8.如權利要求4所述的弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述辣根過氧化物酶的底物按質量/體積百分比由0.03%的過氧化氫和0. 07%的二氨基聯苯胺組成。
全文摘要
弓形蟲總抗體免疫印跡試劑盒及其制備方法，涉及一種試劑盒。試劑盒設有載體板、硝酸纖維膜、弓形蟲總抗體檢測線和對照線；所述弓形蟲總抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲總抗體檢測線處包被弓形蟲重組抗原，在對照線處包被人Ig抗體；辣根過氧化物酶標記抗人Ig抗體。制備弓形蟲重組抗原；硝酸纖維素膜的點樣；制備抗人Ig單克隆抗體；抗人Ig單克隆抗體的辣根過氧化物酶標記；制備免疫印跡試劑盒。檢測時，所需的標本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結果，且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低，應用廣泛。
文檔編號G01N33/535GK102323420SQ201110277920
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月19日 優先權日2011年9月19日
發明者劉莉莉, 張忠英, 張長弓, 楊天賜, 林麗蓉 申請人:廈門大學附屬中山醫院