專利名稱：一株針對鴨疫里默氏桿菌的單抗的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及抗體工程技術，具體為識別不同血清型鴨疫里默氏桿菌的單克隆抗體及其以此為基礎建立的一種雙抗體夾心ELISA方法來檢測鴨疫里默氏桿菌。
背景技術：
鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)是引起鴨傳染性漿膜炎的病原菌，它主要侵害以水禽為主的多種家禽而引起急性或慢性傳染病。發病病鴨常表現出嗜睡、 歪頸、跛行、排黃綠稀糞，眼鼻有漿液性分泌物，隨后出現痙攣、角弓反張等神經癥狀。以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎為其病變特征。目前在我國已先后報道了血清1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14型和4個未定名型，其中以血清1型和血清2 型為主要流行型。世界各養鴨地區幾乎都有該病流行，已成為危害養鴨業最嚴重的疾病之一，該病病死率高，又可引起鴨生產性能降低，且治療費用較高，造成的經濟損失巨大。因此如何準確、快速的診斷成為防治該病的關鍵。針對RA的檢測方法目前主要有細菌分離鑒定、凝集試驗、瓊擴試驗、間接ELISA 試驗、PCR檢測和免疫膠體金試紙條等，其中以ELISA、免疫膠體金試紙條和PCR方法較為快速準確。間接ELISA方法具有檢測成本低，靈敏性高、特異性強，適于批量樣品測定等優點， 目前已建立了一些ELISA檢測方法，如辜新貴等應用假定保守蛋白P25包被反應板，以此檢測血清中有無RA抗體。張鶴曉等用裂解的1型RA菌體作為包被抗原，建立間接ELISA方法，檢測鴨血清中抗RA抗體。胡清海等脂多糖(LPQ作為包被抗原，建立了間接ELISA方法來檢測血清中抗體，人工感染RA的鴨在感染72 h即可檢出抗體；但由于RA的血清型十分復雜，此法只適用于對同一血清型的不同菌株的抗體進行檢測，所以在應用中也具有一定的局限性。目前建立的ELISA方法主要是檢測針對RA抗體，而針對RA抗原檢測的ELISA 方法還沒有。所以有必要開展相關研究，以滿足現場和生產實踐中的需求。本實驗建立的雙抗體夾心ELISA用于RA病原直接檢測，對該病的診斷可提供快速有效的工具。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明提供了 1株針對鴨疫里默氏桿菌的單抗，以及該單抗的應用，有效地解決了現有技術存在的問題。本發明所述的鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體細胞株，命名為5G7，其保藏編號為 CGMCC No. 5165。該單抗具有良好的特異性，與鴨源巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌無交叉反應，與已知血清型1、2、3、11型RA菌株反應。Western - blot結果顯示單抗5G7可結合45KD 左右蛋白條帶；另以血清1型RA菌株免疫兔制備RA的多抗血清；以純化的多抗IgG作為捕獲抗體，純化的單抗作為檢測抗體，建立雙抗體ELISA法來檢測鴨疫里默氏桿菌。應用本發明的單抗建立雙抗體ELISA法，不但可以直接檢測病原，而且可同時檢測血清型1、2、3、11型RA菌株，包含了其主要流行血清型菌株，具有較為廣泛的應用價值。為鴨傳染性漿膜炎的診斷提供了快速、特異、敏感的檢測方法。
圖 1 是 RA 全菌 SDS-PAGE 電泳圖。M: marker 圖2是單抗5G7ffestern-blot分析。圖3是純化多抗SDS-PAGE電泳結果。圖4純化單抗SDS-PAGE電泳結果，Mmarker;單抗5G7。
具體實施例方式本發明中生物材料可通過以下途徑獲得
1、2、3、11四個血清型的RA 參考文獻1、3型言天久.百色市鴨疫里默氏桿菌病流行病學調查與防治的研究[D].廣西大學，2007。2型與11型楊勇.江蘇部分地區鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及致病性研究[D]，揚州大學，專業碩士論文，2008;云水麗，楊勇，王小波等.11型鴨疫里默氏桿菌分離鑒定及致病性研究[J].預防獸醫學報，2009，8:605-609。巴氏桿菌(國內標準強毒菌株C48-1，購自中國獸醫藥品監察所)。沙門氏菌(雞腸炎沙門氏菌參考株C500041，購自美國ATCC)。大腸桿菌(DH5 α，購自Promega公司)。1、單抗的制備 1. 1抗原的制備
復蘇血清1型和2型鴨疫里默氏桿菌，經傳代后全板劃線，擴大培養。收獲并進行細菌計數，0. 1%甲醛滅活后最終將細菌稀釋至109CFU/mL。1.2動物免疫
分別取血清1型和2型適量的菌液(100 μ L左右)與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化， 皮下分點注射8周齡BALB/c小鼠200 μ L/只；2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐劑乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同劑量抗原腹腔注射，不加佐劑；3天后融合。1.3 融合
取加強免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作為陽性血清；頸脫白將小鼠致死，無菌取脾臟，分離脾細胞，經臺盼藍計數，按5:1的比例與SP2/0骨髓瘤細胞(2X IO7)混合，在 PEG4000作用下進行細胞融合；融合細胞經洗滌后，用HAT選擇培養基重懸，置37°C 5% CO2 培養箱內培養；5d后半量換液；IOd后改用HT培養基；觀察雜交瘤細胞的生長情況，待其細胞培養上清變黃或克隆分布至孔底面積的1/10以上時，吸取100 μ 1細胞上清進行抗體檢測。1.4雜交瘤細胞的篩選
分別以血清1型和血清2型全菌為檢測抗原，采用間接ELISA方法來篩選陽性克隆。將全菌用PBS稀釋，108CFU/mL, 100 μ L/孔包被酶標板，50°C烘箱過夜烘干；每孔加入冷甲醇固定，100 μ L/孔，15min ；用PBST洗滌3遍，每次5min,在吸水紙上拍干；加封閉液200 μ L/ 孔，4°C反應過夜，同上洗滌3遍；加入待檢細胞上清IOOyL/孔，37°C孵育lh，同上洗滌3 遍；加入工作濃度(1 :8000稀釋)的羊抗鼠HRP-IgG 50 μ Li/孔，37°C孵育lh，同上洗滌3遍；加入TMB顯色液50 μ L/孔，37°C反應10_15min ；加入2M H2SO4 50 μ 1/孔終止反應。測定孔內的0D45(i。免疫小鼠血清作為篩選時的陽性對照，非免疫的ICR小鼠血清作為陰性對照，同時設立空白調零孔。1.5雜交瘤細胞的亞克隆
采用有限稀釋法對ELISA檢測為陽性的雜交瘤細胞進行亞克隆。將陽性孔中的雜交瘤細胞吹下，經計數后用HT培養基稀釋，按1個細胞/孔、3個細胞/孔、10個細胞/孔加入到裝有飼養細胞的96孔板中；37°C 5% CO2培養箱培養7-10天，對出現單個細胞克隆孔的上清再用間接ELISA方法進行檢測；連續進行3-4次亞克隆，至每個細胞孔上清均為陽性時定株，擴大培養，凍存細胞。1.6腹水的制備
取10周齡的BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，0. 5mL/只；1周后腹腔注射用PBS 稀釋的處于對數生長期的雜交瘤細胞，IX IO6CFU/只；待小鼠腹部明顯隆起時，用16號針頭從腹腔采集腹水，2500rpm離心lOmin，去除脂肪組織，將上清取出，_70°C保存備用。1. 7單抗特性的鑒定 1. 7. 1單抗特異性鑒定
取巴氏桿菌C48-1、沙門氏菌C500041、大腸桿菌DH5a包被96孔酶標板，分別對單抗進行間接ELISA試驗，步驟同1. 4。 采用間接ELISA方法，各種細菌包被濃度108CFU/mL,每孔100 μ L，單抗腹水 1:1000稀釋，結果顯示以血清2型RA免疫小鼠融合后獲得的1株單抗5G7與1、2、3、11四個血清型的RA產生交叉反應(表1)。 表1單抗特異性鑒定結果
權利要求
1. 一株鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體細胞株5G7，它的保藏編號是CGMCC No. 5165。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一株針對鴨疫里默氏桿菌的單抗。所說的單抗5G7，其保藏編號為CGMCC No.5165。用該單抗在制備成檢測鴨疫里默氏桿菌的免疫膠體金試紙，不但可以直接檢測病原，而且可同時檢測血清型1、2、3、11型RA菌株，具有較為廣泛的應用價值。
文檔編號G01N33/577GK102304493SQ20111027103
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月14日 優先權日2011年9月14日
發明者劉秀梵, 孫化露, 張敬友, 彭大新, 陳冰, 陳素娟, 高以明 申請人:揚州大學