專利名稱：對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的傳感器的制作方法
技術領域：
本發明屬于納米結構的熒光化學傳感器領域，特別涉及對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器及其制備方法，以及該化學傳感器的應用。
背景技術：
1987年發現一氧化氮在體內由內皮釋放產生，在人體的免疫反應中，它是心血管系統和神經系統中重要的信息傳輸者。自此，一氧化氮的生理作用引起了許多生物學家以及化學家的關注。目前，應用于一氧化氮的檢測手段很多，主要有電化學法以及電子順磁共振波譜法等。但是以上方法由于低的空間分辨率，甚至需要較為復雜的儀器，這使得其在細胞成像中的應用得到了限制。然而熒光技術因為自身的高的靈敏度和高的空間 分辨率，使得它在細胞內以及細胞外一氧化氮成像中顯示出了極大的優勢。文獻中已經報道了多種可用于一氧化氮熒光成像的試劑，如Yang Y J, J. Am. Chem. Soc. 2010,132,13114 ；Lippard S J, Acc. Chem. Res. 2007,40,41 ；Lim M H, Nature Chem. Biol. 2006，2，375 ；Duarte AJ, Sensors, 2010,10，1661。然而這些方法在使用中都有一些局限性，最為廣泛使用的試劑就是二氨基熒光素衍生物，它不僅與一氧化氮反應，細胞內釋放的其它分子也會參加反應。并且大部分報道的成像試劑都需要在有機溶劑中使用， 這有可能會引起細胞發生病變。這些成像試劑存在的其它局限性還包括易于光漂白、難于合成以及在使用中需要水解等。因此合成可以應用于生物體系中一氧化氮檢測的合適的熒光試劑具有非常重要的意義。
發明內容
本發明的目的之一是提供對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器。本發明的目的之二是提供對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器的制備方法。本發明的目的之三是提供對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器在生物檢測方面的應用。本發明的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器是由 3_氨基丙基三乙氧基硅烷和進行了表面清洗的硅納米線或硅納米線陣列反應得到的表面修飾有氨基的硅納米線或硅納米線陣列，與戊二醛反應得到表面修飾有醛基的硅納米線或硅納米線陣列(硅納米線或硅納米線陣列上的氨基與戊二醛反應)，經還原(以硼氫化鈉作為還原劑)修飾在硅納米線或硅納米線陣列上由硅納米線或硅納米線陣列上的醛基與氨基熒光素反應得到的氨基熒光素，得到表面修飾有作為對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線的化學傳感器。
所述的硅納米線是由化學氣相沉積法或化學刻蝕法所得到的不同尺寸的硅納米
線本發明的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器的制備方法包括以下步驟1)將用化學氣相沉積法制備得到的硅納米線于溫度為70 95°C的體積比為 1 1 8 1的濃硫酸(質量濃度為50% 98%)與H2O2(質量濃度為5% 30%) 的混合液中加熱30 90分鐘，之后冷卻至室溫，取出并反復水洗至中性，于室溫下浸泡在 H2O H2O2 (質量濃度為5% 30% ) NH4OH的體積比為3 1 1 9 1 1的混合液中并放置(一般放置時間為1 2. 5小時)，取出并反復水洗至中性，真空干燥；或將用化學刻蝕法制備得到的硅納米線陣列于溫度為70 95 °C的體積比為 1 1 8 1的濃硫酸(質量濃度為50% 98%)與H2O2 (質量濃度為5% 30%)的混合液中加熱30 90分鐘，之后冷卻至室溫，取出并反復水洗至中性，然后置于氧等離子體系統中進行硅納米線陣列的表面處理(處理條件氧氣的質量含量為10 100%，電壓為100 500伏，時間為10秒 5分鐘，溫度為10 35°C )；2)在反應器中加入10 60mg步驟1)得到的干燥的硅納米線或硅納米線陣列、 5 30mL無水甲苯和0. 05 0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(0. 21 1. 26mmol)，在惰性氣體(如氮氣)保護下加熱至80 120°C后，恒溫反應12 36小時，冷卻至室溫，用微型過濾器過濾收集硅納米線或硅納米線陣列，用有機溶劑反復超聲清洗除去未反應的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，過濾收集表面修飾有氨基的硅納米線或硅納米線陣列；3)將步驟2)得到的表面修飾有氨基的硅納米線或硅納米線陣列置于反應器中， 加入質量濃度為10% 50%的戊二醛水溶液(可為1. 5 IOmL)，室溫攪拌反應(一般反應時間為30 120分鐘)，然后用有機溶劑反復超聲清洗除去未反應的戊二醛，過濾收集表面修飾有醛基的硅納米線或硅納米線陣列；4)將步驟3)得到的表面修飾有醛基的硅納米線或硅納米線陣列置于反應器中， 加入濃度為1 6mol/L的氨基熒光素的乙醇溶液或丙酮溶液(一般全部步驟3)得到的經過戊二醛修飾的硅納米線或硅納米線陣列用0. 5 3mL濃度為1 6mol/L的氨基熒光素的乙醇溶液或丙酮溶液)，室溫下攪拌反應(一般反應時間為0. 5 3小時)，然后用有機溶劑反復超聲清洗除去未反應的氨基熒光素，直至洗滌液無熒光，過濾收集經過氨基熒光素修飾的硅納米線或硅納米線陣列；5)將步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線，或從步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列上刮取的單根硅納米線置于乙醇或丙酮中，超聲使其分散， 取分散液置于0. 1 5M的NaBH4水溶液中進行還原，于室溫下反應(一般反應時間為2 24小時)，反應液室溫保存，得到表面修飾有作為對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線；即得到對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器(如將1 15mg步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線，或經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列上刮取的單根硅納米線置于0. 2 3mL乙醇或丙酮中，超聲使其分散，取0. 05 0. 5mL分散液置于0. 1 5M的NaBH4水溶液中進行還原)。本發明中所述的化學氣相沉積法制備硅納米線的方法可是室溫下，將一氧化硅經研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放在石英管的中部，加熱前，系統先用機械泵和分子泵對石英管抽真空至10_3Pa，隨后以15 30SCCm(mL/min)的流速通入氬氣(占混合氣體的體積95% )與氫氣(占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當壓力穩定在700 IOOOOPa時， 系統開始升溫；系統以10 20°C /min升至300°C，再以10 20°C /min升溫至800°C，此時關閉氣閥和泵閘，保溫10 30分鐘后繼續升溫至1350°C，在1350°C下反應(一般反應時間為3 7小時)，反應結束后，自然冷卻至室溫，在瓷舟的兩側收集產物硅納米線。 本發明中所述的化學刻蝕法制備硅納米線陣列的方法可是取不同尺寸的(100) 硅片，依次用乙醇、丙酮、蒸餾水進行超聲清洗(一般超聲清洗的時間為5 30分鐘)；之后將該硅片浸泡在質量濃度為2 5%的HF水溶液中，浸泡時間為30秒 15分鐘；將硅片取出后置于含有濃度為3 SmmoVLAgNO3和2 7mol/L HF的混合水溶液中(一般浸泡時間為1 5分鐘)；將硅片取出后浸入含有濃度為2 7mol/L HF和0. 05 0. 4mol/ L H2O2的混合水溶液中，體系由溫度為30 60°C的水浴保溫；5 45分鐘后取出硅片，放入濃鹽酸(質量濃度為36% )濃硝酸(質量濃度為36% )的體積比為3 1的混合液中，浸泡0.5 2. 5小時后取出硅片，用蒸餾水沖洗后(可置于表面皿中待其自然晾干)自然晾干，得到由硅納米線構成的硅納米線陣列。本發明可將步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線或硅納米線陣列經進一步處理后再進行步驟5)，所述的處理是將步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線或硅納米線陣列置于反應器中，加入濃度為0. 01 0. 06mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液或丙酮溶液(一般全部步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線或硅納米線陣列用2 12mL濃度為0. 01 0. 06mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液或丙酮溶液)，在溫度為30 70°C下加熱反應(一般反應時間為1 8小時)，然后用有機溶劑反復超聲清洗除去未反應的三乙酰氧基硼氫化鈉，過濾收集得到經過氨基熒光素修飾的硅納米線或硅納米線陣列，室溫干燥。將步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線或硅納米線陣列用濃度為0. 01 0. 06mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液或丙酮溶液處理，可以使得氨基熒光素分子更加牢固的修飾在硅納米線或硅納米線陣列的表面，在后續的反應過程中保證其不易從硅納米線或硅納米線陣列的表面脫落下來。所述的化學氣相沉積法制備得到的硅納米線的直徑為5 20nm。所述的化學刻蝕法制備得到的硅納米線陣列中的硅納米線的直徑為100 300nm，長度為5 40 μ m。所述的無水甲苯優選是新蒸的無水甲苯。所述的清洗用的有機溶劑可以是常用的有機溶劑，如甲醇、乙醇或丙酮。本發明的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器可用于對一氧化氮分子的檢測，其在用熒光光譜儀或熒光顯微鏡對一氧化氮分子作檢測時，以經過特殊的有機分子修飾的上述的基于硅納米線的化學傳感器作為熒光檢測的活性基底，聯用熒光光譜儀或熒光顯微鏡，在有一氧化氮存在的體系中，上述的基于硅納米線的化學傳感器會產生熒光，通過繪制一氧化氮的濃度和特征熒光特征峰強度的定標曲線，由上述的基于硅納米線的化學傳感器檢測到的特征熒光特征峰的強度確定體系中一氧化氮的濃度， 從而實現對一氧化氮分子的檢測。即，憑借該活性基底的高選擇性和靈敏度，可以定量檢測出一氧化氮分子的濃度，從而實現了傳感器的構筑。本發明的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器在對一氧化氮分子進行檢測時，所述的有一氧化氮存在的體系，可以是將含有一氧化氮的溶液直接加入到含有本發明的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器的溶液中，也可以是將能夠產生一氧化氮的物質與含有本發明的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器的溶液進行混合，在37°C下進行孵育；也可以是將能夠產生一氧化氮的生物樣品(組織提取液或是細胞)與本發明的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器進行適當孵育(適當即是以保證生物樣品活性為前提)，之后再進行熒光強度的測試。用熒光光譜儀或者熒光顯微鏡進行檢測。所用的激發光源為汞燈(激發波長為470 495nm)、氙燈(激發波長為470 495nm)或激發波長為 488nm的激光器 ，該傳感器的發射光為綠光。所述的有一氧化氮存在的體系是動物肝臟提取液(可對動物肝臟提取液中的一氧化氮進行檢測)。本發明是將基于化學氣相沉積法和化學刻蝕方法制備得到的硅納米線和硅納米線陣列進行表面處理，然后再用有機小分子物質氨基熒光素對其進行化學共價修飾，得到對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器。本發明的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器可用于溶液及生物體系中一氧化氮的檢測。
圖1.本發明實施例1的經過化學氣相沉積法制備得到的硅納米線的HRTEM照片。圖2.本發明實施例2的經過化學刻蝕法制備得到的硅納米線陣列的SEM照片。圖3.本發明實施例1 8中的活性基底1和活性基底2對NO的響應機理；其中 圖3a為活性基底1和活性基底2的化學合成過程示意圖；圖3b為活性基底1和活性基底 2對NO的響應示意圖。圖4.本發明實施例1的活性基底1作為檢測基底，體系熒光與NO的濃度的線性曲線。圖5.本發明實施例1的活性基底1作為檢測基底，對肝臟提取液中NO的濃度變化進行檢測時，體系熒光強度和所加肝臟提取液的體積繪制的線性曲線。圖6.本發明實施例2的活性基底2作為檢測基底，對溶液中NO進行檢測的熒光圖像。a為從活性基底2上刮下的單根納米線的明場照片；b為從活性基底2上刮下的單根納米線的熒光照片；c為從活性基底2上刮下的單根納米線置于ImL濃度為0. 5M羥乙基哌嗪乙硫磺酸(除氧)中，且加入45 μ L含有濃度為0. IM HCl和0. IMNaNO2的混合溶液，并于水浴(37°C )中保溫1小時之后于熒光顯微鏡下進行觀察得到的熒光照片。
具體實施例方式實施例11)室溫下，將一氧化硅經研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放在石英管的中部，力口熱前，系統先用機械泵和分子泵抽真空至10_3Pa，隨后以25SCCm(mL/min)的流速通入氬氣 (占混合氣體的體積95% )與氫氣(占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當壓力穩定在 IO3Pa時，系統開始升溫。系統以10°C/min升至300°C，再以20°C/min升溫至800°C，此時關閉氣閥和泵閘，保持10分鐘后繼續升溫至1350°C，1350°C下反應5小時，反應結束后，自然冷卻至室溫，在瓷舟的兩側收集產物，所得到的硅納米線是中心為直徑為15 20nm的單晶硅線，外邊有一層1 3nm的非晶氧化硅層(見圖1)。2)將步驟1)得到的硅納米線于溫度為70°C的體積比為5 1的濃硫酸(質量濃度為98% )與H2O2(質量濃度為30% )的混合液中加熱30分鐘，之后冷卻至室溫，取出并反復水洗至中性，于室溫下浸泡在H2O H2O2(質量濃度為30%) NH4OH的體積比為 7:1: 1的混合液中并放置2. 5小時，取出并反復水洗至中性，真空干燥。
3)在圓底燒瓶中加入45. 5mg步驟2)得到的干燥的硅納米線、IOmL新蒸的無水甲苯和0. 2mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(0. 84mmol)，在氮氣保護下加熱至90°C后，恒溫反應 24小時，冷卻至室溫，用微型過濾器過濾收集硅納米線，用乙醇反復超聲清洗除去未反應的 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，過濾收集表面修飾有氨基的硅納米線。4)將步驟3)得到的表面修飾有氨基的硅納米線置于圓底燒瓶中，加入5mL質量濃度為50%的戊二醛水溶液，室溫攪拌反應1小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的戊二醛，過濾收集表面修飾有醛基的硅納米線。5)將步驟4)得到的表面修飾有醛基的硅納米線置于圓底燒瓶中，加入2mL濃度為5mol/L的氨基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應2小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的氨基熒光素，直至洗滌液無熒光，過濾收集經過氨基熒光素修飾的硅納米線。6)將步驟5)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線置于圓底燒瓶中，加入6mL濃度為0. 024mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液，在溫度為50°C下加熱反應4小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的三乙酰氧基硼氫化鈉，過濾收集得到經過氨基熒光素修飾的硅納米線，室溫干燥。7)將步驟6)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線6mg置于ImL乙醇中，超聲使其分散，取0. 2mL的分散液置于3mL 0. IM的NaBH4水溶液中進行還原，于室溫下反應3小時，反應液室溫保存，得到表面修飾有作為對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線；即活性基底1 (見圖3)。將上述得到的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的活性基底1作為對一氧化氮分子進行熒光檢測基底，聯用熒光光譜儀，對溶液體系中產生的NO進行熒光檢測，激發光源為氙燈。在含有活性基底1的ImL 0. 5M的羥乙基哌嗪乙硫磺酸水溶液(除氧)中，加入 45 μ L0. IM HCl和100 μ L0. IM NaNO2溶液，并于水浴(37°C )中保溫，用450nm的光激發， 每隔5分鐘進行一次熒光檢測，發現隨著體系中一氧化氮濃度的增加，上述活性基底1的熒光特征峰的強度逐漸增強。熒光特征峰的強度和一氧化氮濃度呈線性關系，從而繪制了熒光特征峰強度和一氧化氮濃度的線性定標曲線(見圖4)。取新鮮的小鼠肝臟，稱重12克，于2mL除菌的PBS緩沖液中攪勻，于4000rpm離心 15分鐘，取上層清液，于4000rpm離心15分鐘，收集清液，得到肝臟提取液，冷凍保存。將上述得到的活性基底1作為熒光檢測基底，聯用熒光光譜儀，對上述制備得到的肝臟提取液進行熒光檢測。在含有活性基底1的ImL PBS (除菌)中，逐漸加入10μ L肝臟提取液，用450nm的光激發，之后立即進行熒光檢測，結果表明隨著體系中肝臟提取液的增加，熒光特征峰強度明顯的增加(見圖5)。實施例21)取2cmX0. 5cm的(100)硅片，依次用乙醇、丙酮、蒸餾水各超聲清洗10分鐘；之后將該硅片浸泡在質量濃度為5%的HF水溶液中15分鐘；將該硅片取出后置于含有濃度為5mmol/L AgNO3和4. 8mol/L HF的混合水溶液中；浸泡2. 5分鐘后取出放入IOmL含有濃度為4. 8mol/L HF和0. 2mol/LH202混合水溶液中，體系于50°C水浴保溫；35分鐘后取出硅片，放入盛有4. 5mL濃鹽酸(質量濃度為36% )和1. 5mL濃硝酸(質量濃度為36% )的混合液中；浸泡1小時后取出硅片，用蒸餾水沖洗，洗干凈后置于表面皿中自然晾干，得到由硅納米線構成的硅納米線陣列，其中硅納米線的直徑為100 200nm，長度為25 40 μ m(見圖2)。2)將步驟1)得到的硅納米線陣列于溫度為90°C的體積比為5 1的濃硫酸(質量濃度為98%)與H2O2(質量濃度為30%)的混合液中加熱50分鐘，之后冷卻至室溫，取出并反復水洗至中性，然后置于氧等離子體系統中進行硅納米線陣列的表面處理(處理條件氧氣的質量含量為100%，電壓為500伏，時間為5分鐘，溫度為35°C )。3)在圓底燒瓶中加入45. 5mg步驟2)得到的干燥的硅納米線陣列、IOmL新蒸的無水甲苯和0. 2mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(0.84mmol)，在氮氣保護下加熱至90°C后，恒溫反應24小時，冷卻至室溫，用微型過濾器過濾收集硅納米線陣列，用乙醇反復超聲清洗除去未反應的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，過濾收集表面修飾有氨基的硅納米線陣列。4)將步驟3)得到的表面修飾有氨基的硅納米線陣列置于圓底燒瓶中，加入5mL質量濃度為30%的戊二醛水溶液，室溫攪拌反應1小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的戊二醛，過濾收集表面修飾有醛基的硅納米線陣列。5)將步驟4)得到的表面修飾有醛基的硅納米線陣列置于圓底燒瓶中，加入2mL濃度為5mol/L的氨基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應2小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的氨基熒光素，直至洗滌液無熒光，過濾收集經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列。
6)將步驟5)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列置于圓底燒瓶中，加入 6mL濃度為0. 024mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液，在溫度為50°C下加熱反應4小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的三乙酰氧基硼氫化鈉，過濾收集得到經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列，室溫干燥。7)將從步驟6)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列根部下刮取的2mg單根硅納米線置于ImL乙醇中，超聲使其分散，取0. 2mL的分散液置于3mL 3M的NaBH4水溶液中進行還原，于室溫下反應5小時，反應液室溫保存，得到表面修飾有作為對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線，即活性基底2。將上述得到的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的活性基底2作為對一氧化氮分子進行熒光檢測基底，聯用熒光顯微鏡，對溶液體系中產生的NO進行熒光檢測，激發光源為氙燈。在含有活性基底2的ImL 0. 5M的羥乙基哌嗪乙硫磺酸水溶液(除氧)中，加入 45 μ L 0. IM HCl和0. ImL 2. 6Μ NaNO2溶液，并于水浴(37°C )中保溫，1小時之后在熒光顯微鏡下進行觀察，在與NO溶液反應之后，活性基底2的熒光強度明顯增強(見圖6)。實施例31)室溫下，將一氧化硅經研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放在石英管的中部，力口熱前，系統先用機械泵和分子泵抽真空至10_3Pa，隨后以25SCCm(mL/min)的流速通入氬氣 (占混合氣體的體積95% )與氫氣(占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當壓力穩定在IO3Pa時，系統開始升溫。系統以20°C /min升至300°C，再以10°C /min升溫至800°C，此時關閉氣閥和泵閘，保持10分鐘后繼續升溫至1350°C，1350°C下反應5小時，反應結束后，自然冷卻至室溫，在瓷舟的兩側收集產物，所得到的硅納米線是中心直徑為5 15nm的單晶硅線，外邊有一層1 3nm的非晶氧化硅層。2)將步驟1)得到的硅納米線于溫度為70°C的體積比為5 1的濃硫酸(質量濃度為50%)與H2O2 (質量濃度為5%)的混合液中加熱30分鐘，之后冷卻至室溫，取出并反復水洗至中性，于室溫下浸泡在H2O H2O2 (質量濃度為5%) NH4OH的體積比為7 1 1 的混合液中并放置2. 5小時，取出并反復水洗至中性，真空干燥。3)在圓底燒瓶中加入IOmg步驟2)得到的干燥的硅納米線、5mL新蒸的無水甲苯和0. 05mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(0. 21mmol)，在氮氣保護下加熱至80°C后，恒溫反應 12小時，冷卻至室溫，用微型過濾器過濾收集硅納米線，用乙醇反復超聲清洗除去未反應的 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，過濾收集表面修飾有氨基的硅納米線。4)將步驟3)得到的表面修飾有氨基的硅納米線置于圓底燒瓶中，加入1. 5mL質量濃度為35%的戊二醛水溶液，室溫攪拌反應30分鐘，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的戊二醛，過濾收集表面修飾有醛基的硅納米線。5)將步驟4)得到的表面修飾有醛基的硅納米線置于圓底燒瓶中，加入0. 5mL濃度為lmmol/L的氨基熒光素的丙酮溶液，室溫下攪拌反應30分鐘，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的氨基熒光素，直至洗滌液無熒光，過濾收集經過氨基熒光素修飾的硅納米線。6)將步驟5)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線置于圓底燒瓶中，加入2mL濃度為O.Olmol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的(0. 02mmol)乙醇溶液，在溫度為30°C下加熱回流反應1小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的三乙酰氧基硼氫化鈉，過濾收集得到經過氨基熒光素修飾的硅納米線，室溫干燥。7)將步驟6)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線Img置于0. 2mL乙醇中，超聲使其分散，取0. 05mL的分散液置于0. 5mL 0. lmol/L的NaBH4水溶液中進行還原，于室溫下反應2小時，反應液室溫保存，得到表面修飾有作為對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線，即活性基底1。將上述得到的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的活性基底1作為對一氧化氮分子進行熒光檢測基底，聯用熒光光譜儀，用450nm的光激發，對溶液體系中產生的NO進行熒光檢測。取新鮮的小鼠肝臟，稱重6克，于3mL除菌的PBS緩沖液中攪勻，于4000rpm離心 15分鐘，取上層清液，于4000rpm離心15分鐘，收集清液，得到肝臟提取液，冷凍保存。將上述得到的活性基底1作為熒光檢測基底，聯用熒光光譜儀，對上述制備得到的肝臟提取液進行熒光檢測。在含有活性基底1的ImL PBS (除菌)中，逐漸加入10μ L肝臟提取液，之后立即進行熒光檢測，用450nm的光激發，結果表明隨著體系中肝臟提取液的增加，熒光特征峰強度明顯的增加。實施例41)取2cmX0. 5cm的(100)硅片，依次用乙醇、丙酮、蒸餾水各超聲清洗10分鐘；之后將該硅片浸泡在質量濃度為5%的HF水溶液中15分鐘；將該硅片取出后置于含有濃度為5mmol/L AgNO3和4. 8mol/L HF的混合水溶液中；浸泡2. 5分鐘后取出放入IOmL含有濃度為4. 8mol/L HF和0. 2mol/LH202混合水溶液中，體系于50°C水浴保溫；15分鐘后取出硅片，放入盛有4. 5mL濃鹽酸(質量濃度為36% )和1. 5mL濃硝酸(質量濃度為36% )的混合液中；浸泡1小時后取出硅片，用蒸餾水沖洗，洗干凈后置于表面皿中自然晾干，得到由硅納米線構成的硅納米線陣列，其中硅納米線的直徑為200 300nm，長度為5 25 μ m。2)將步驟1)得到的硅納米線陣列于溫度為95°C的體積比為4 1的濃硫酸(質量濃度為70%)與H2O2(質量濃度為15%)的混合液中加熱90分鐘，之后冷卻至室溫，取出并反復水洗至中性，然后置于氧等離子體系統中進行硅納米線陣列的表面處理(處理條件氧氣的質量含量為10%，電壓為100伏，時間為10秒，溫度為10°C)；3)在圓底燒瓶中加入IOmg步驟2)得到的干燥的硅納米線陣列、30mL新蒸的無水甲苯和0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(1. 26mmol)，在氮氣保護下加熱至120°C后，恒溫反應12小時，冷卻至室溫，用微型過濾器過濾收集硅納米線陣列，用乙醇反復超聲清洗除去未反應的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，過濾收集表面修飾有氨基的硅納米線陣列。4)將步驟3)得到的經表面修飾有氨基的硅納米線陣列置于圓底燒瓶中，加入5mL 質量濃度為10%的戊二醛水溶液，室溫攪拌反應1小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的戊二醛，過濾收集表面修飾有醛基的硅納米線陣列。5)將步驟4)得到的表面修飾有醛基的硅納米線陣列置于圓底燒瓶中，加入2mL濃度為5mol/L的氨基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應2小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的氨基熒光素，直至洗滌液無熒光，過濾收集經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列。6)將步驟5)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列置于圓底燒瓶中，加入 6mL濃度為0. 024mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液，在溫度為50°C下加熱反應4小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的三乙酰氧基硼氫化鈉，過濾收集得到經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列，室溫干燥。7)將從步驟6)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列根部下刮取的IOmg 單根硅納米線置于5mL乙醇中，超聲使其分散，取0. 5mL的分散液置于5mL 1. 85mol/L的 NaBH4水溶液中進行還原，于室溫下反應18小時，反應液室溫保存，得到表面修飾有作為對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線，即活性基底2。將上述得到的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的活性基底2作為對一氧化氮分子進行熒光檢測基底，聯用熒光顯微鏡，對溶液體系中產生的NO進行熒光檢測。將活性基底2置于產生一氧化氮的溶液體系中，并于水浴(37°C )中保溫，1小時之后在熒光顯微鏡下進行觀察，氙燈作為激發光源在與NO溶液反應之后，活性基底2的熒光強度明顯增強。實施例51)將實施例1中經過化學氣相沉積法得到的硅納米線于溫度為95°C的體積比為8 1的濃硫酸(質量濃度為80% )與H2O2(質量濃度為20% )的混合液中加熱90 分鐘，之后冷卻至室溫，取出并反復水洗至中性，于室溫下浸泡在H2O H2O2(質量濃度為 20% ) NH4OH的體積比為9 1 1的混合液中并放置2. 5小時，取出并反復水洗至中
性，真空干燥。2)在圓底燒瓶中加入60mg步驟1)得到的干燥的硅納米線、30mL新蒸的無水甲苯和0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(1. 26mmol)，在氮氣保護下加熱至120°C后，恒溫反應36小時，冷卻至室溫，用微型過濾器過濾收集硅納米線，用丙酮反復超聲清洗除去未反應的 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，過濾收集表面修飾有氨基的硅納米線。4)將步驟3)得到的表面修飾有氨基的硅納米線置于圓底燒瓶中，加入IOmL質量濃度為50%的戊二醛水溶液，室溫攪拌反應120分鐘，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的戊二醛，過濾收集表面修飾有醛基的硅納米線。5)將步驟4)得到的表面修飾有醛基的硅納米線置于錐形瓶中，加入3mL濃度為 6mmol/L的氨基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應3小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的氨基熒光素，直至洗滌液無熒光，過濾收集經過氨基熒光素修飾的硅納米線。6)將步驟5)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線置于圓底燒瓶中，加入12mL 濃度為0. 06mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的(0. 72mmol)乙醇溶液，在溫度為70°C下加熱回流反應8小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的三乙酰氧基硼氫化鈉，過濾收集得到經過氨基熒光素修飾的硅納米線，室溫干燥。7)將步驟6)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線15mg置于3mL乙醇中，超聲使其分散，取0. 5mL的分散液置于5mL 0. 8mol/L的NaBH4水溶液中進行還原，于室溫下反應24小時，反應液室溫保存，得到表面修飾有作為對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線，即活性基底1。將上述得到的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的活性基底1作為對一氧化氮分子進行熒光檢測基底，聯用熒光光譜儀，對溶液體系中產生的NO進行熒光檢測。將活性基底1置于能夠緩慢產生一氧化氮的溶液體系中，用450nm的光激發，每隔5分鐘進行一次熒光檢測，并記錄熒光曲線。發現隨著體系中一氧化氮濃度的增加，上述活性基底1的熒光特征峰(的強度逐漸增強。熒光特征峰的強度和一氧化氮濃度呈線性關系，從而繪制了熒光特征峰強度和一氧化氮濃度的線性定標曲線。實施例61)將實施例2中經過化學刻蝕法得到的硅納米線陣列于溫度為70°C的體積比為 4.5 1的濃硫酸(質量濃度為90% )與H2O2 (質量濃度為25% )的混合液中加熱30分鐘，之后冷卻至室溫，取出并反復水洗至中性，然后置于氧等離子體系統中進行硅納米線陣列的表面處理(處理條件氧氣的質量含量為50%，電壓為300伏，時間為3分鐘，溫度為 25 0C )。2)在圓底燒瓶中加入60mg步驟1)得到的干燥的硅納米線陣列、5mL新蒸的無水甲苯和0.05mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(0. 21mmol)，在氮氣保護下加熱至120°C后，恒溫反應36小時，冷卻至室溫，用微型過濾器過濾收集硅納米線陣列，用丙酮反復超聲清洗除去未反應的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，過濾收集表面修飾有氨基的硅納米線陣列。3)將步驟2)得到的表面修飾有氨基的硅納米線陣列置于圓底燒瓶中，加入5mL質量濃度為45%的戊二醛水溶液，室溫攪拌反應1小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的戊二醛，過濾收集表面修飾有醛基的硅納米線陣列。4)將步驟3)得到的表面修飾有醛基的硅納米線陣列置于圓底燒瓶中，加入2mL濃度為5mol/L的氨基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應2小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的氨基熒光素，直至洗滌液無熒光，過濾收集經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列。
5)將從步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列根部下刮取的20mg單根硅納米線置于15mL乙醇中，超聲使其分散，取1. 5mL的分散液置于18mL 5mol/L的NaBH4 水溶液中進行還原，于室溫下反應14小時，反應液室溫保存，得到表面修飾有作為對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線，即活性基底2。將上述得到的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的活性基底2作為對一氧化氮分子進行熒光檢測基底，聯用熒光顯微鏡，對溶液體系中產生的NO進行熒光檢測。將活性基底2置于能夠產生一氧化氮的溶液體系中，并于水浴(37°C )中保溫，1小時之后在熒光顯微鏡下進行觀察，氙燈作為激發光源，結果表明在與NO溶液反應之后，活性基底2的熒光強度明顯增強。實施例71)將實施例3經中過化學氣相沉積法得到的硅納米線于溫度為90°C的體積比為5. 5 1的濃硫酸(質量濃度為98% )與H2O2 (質量濃度為30% )的混合液中加熱90 分鐘，之后冷卻至室溫，取出并反復水洗至中性，于室溫下浸泡在H2O H2O2(質量濃度為 30% ) NH4OH的體積比為6. 5 1 1的混合液中并放置3小時，取出并反復水洗至中
性，真空干燥。2)在圓底燒瓶中加入60mg步驟1)得到的干燥的硅納米線、15mL新蒸的無水甲苯和0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(1.26mm0l)，在氮氣保護下加熱至95°C后，恒溫反應 28小時，冷卻至室溫，用微型過濾器過濾收集硅納米線，用丙酮反復超聲清洗除去未反應的 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，過濾收集表面修飾有氨基的硅納米線。3)將步驟2)得到的表面修飾有氨基的硅納米線置于圓底燒瓶中，加入7mL質量濃度為50%的戊二醛水溶液，室溫攪拌反應90分鐘，然后用丙酮反復超聲清洗除去未反應的戊二醛，過濾收集表面修飾有醛基的硅納米線。4)將步驟3)得到的表面修飾有醛基的硅納米線置于錐形瓶中，加入3mL濃度為 5mmol/L的氨基熒光素的丙酮溶液，室溫下攪拌反應3小時，然后用丙酮反復超聲清洗除去未反應的氨基熒光素，直至洗滌液無熒光，過濾收集經過氨基熒光素修飾的硅納米線。5)將步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線8mg置于1. 5mL乙醇中，超聲使其分散，取0. 5mL的分散液置于6mL 2. 6mol/L的NaBH4水溶液中進行還原，于室溫下反應10小時，反應液室溫保存，得到表面修飾有作為對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線，即活性基底1。將上述得到的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的活性基底1作為對一氧化氮分子進行熒光檢測基底，聯用熒光光譜儀，對溶液體系中產生的NO進行熒光檢測。將活性基底1置于能夠緩慢產生一氧化氮的體系中，用氙燈作為激發光源，用450nm的光激發，每隔6 分鐘進行一次熒光檢測，并記錄熒光曲線，發現隨著體系中一氧化氮濃度的增加，上述活性基底1的熒光特征峰的強度逐漸增強。熒光特征峰的強度和一氧化氮濃度呈線性關系，從而繪制了熒光特征峰強度和一氧化氮濃度的線性定標曲線。實施例81)將實施例4中經過化學刻蝕法得到的硅納米線陣列于溫度為90°C的體積比為3 1的濃硫酸(質量濃度為98% )與H2O2 (質量濃度為30% )的混合液中加熱50分鐘，之后冷卻至室溫，取出并反復水洗至中性，然后置于氧等離子體系統中進行硅納米線陣列的表面處理(處理條件氧氣的質量含量為80%，電壓為500伏，時間為5分鐘，溫度為 30 0C )。2)在圓底燒瓶中加入60mg步驟1)得到的干燥的硅納米線陣列、IOmL新蒸的無水甲苯和0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(1. 26mmol)，在氮氣保護下加熱至90°C后，恒溫反應36小時，冷卻至室溫，用微型過濾器過濾收集硅納米線陣列，用丙酮反復超聲清洗除去未反應的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，過濾收集表面修飾有氨基的硅納米線陣列。3)將步驟2)得到的表面修飾有氨基的硅納米線陣列置于圓底燒瓶中，加入5mL質量濃度為50%的戊二醛水溶液，室溫攪拌反應1小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的戊二醛，過濾收集表面修飾有醛基的硅納米線陣列。4)將步驟3)得到的表面修飾有醛基的硅納米線陣列置于圓底燒瓶中，加入2mL濃度為5mol/L的氨基熒光素的乙醇溶液，室溫下攪拌反應2小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的氨基熒光素，直至洗滌液無熒光，過濾收集經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列。5)將步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列置于圓底燒瓶中，加入 6mL濃度為0. 024mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液，在溫度為50°C下加熱反應4小時，然后用乙醇反復超聲清洗除去未反應的三乙酰氧基硼氫化鈉，過濾收集得到經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列，室溫干燥。6)將從步驟5)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列根部下刮取的8mg單根硅納米線置于ImL乙醇中，超聲使其分散，取0. 5mL的分散液置于6mL 2. 6mol/L的NaBH4 水溶液中進行還原，于室溫下反應10小時，反應液室溫保存，得到表面修飾有作為對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線，即活性基底2。將上述得到的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的活性基底2作為對一氧化氮分子進行熒光檢測基底，聯用熒光顯微鏡，對溶液體系中產生的NO進行熒光檢測。將活性基底2置于能夠產生一氧化氮的溶液體系中，并于水浴(37°C )中保溫，1小時之后在熒光顯微鏡下進行觀察，氙燈作為光源，在與NO溶液反應之后，活性基底2的熒光強度明顯增強。
1權利要求
1.一種對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器，其特征是所述的基于硅納米線的化學傳感器是由3-氨基丙基三乙氧基硅烷和硅納米線或硅納米線陣列反應得到的表面修飾有氨基的硅納米線或硅納米線陣列，與戊二醛反應得到表面修飾有醛基的硅納米線或硅納米線陣列，經還原修飾在硅納米線或硅納米線陣列上由醛基與氨基熒光素反應得到的氨基熒光素，得到表面修飾有作為對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線的化學傳感器。
2.根據權利要求1所述的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器，其特征是所述的硅納米線是由化學氣相沉積法制備得到的直徑為5 20nm的硅納米線；或是由化學刻蝕法制備得到的直徑為100 300nm，長度為5 40 μ m的硅納米線。
3.一種根據權利要求1或2所述的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器的制備方法，其特征是，所述的方法包括以下步驟1)將用化學氣相沉積法制備得到的硅納米線于溫度為70 95°C的體積比為1 1 8 1的濃硫酸與H2O2的混合液中加熱30 90分鐘，之后冷卻至室溫，取出水洗至中性， 于室溫下浸泡在H2O H2O2 NH4OH的體積比為3 1 1 9 1 1的混合液中并放置，取出并水洗至中性，真空干燥；或將用化學刻蝕法制備得到的硅納米線陣列于溫度為70 95°C的體積比為1 1 8 1的濃硫酸與H2O2的混合液中加熱30 90分鐘，之后冷卻至室溫，取出并水洗至中性， 然后置于氧等離子體系統中進行硅納米線陣列的表面處理，處理條件氧氣的質量含量為 10 100%，電壓為100 500伏，時間為10秒 5分鐘，溫度為10 35°C ；2)在反應器中加入10 60mg步驟1)得到的干燥的硅納米線或硅納米線陣列、5 30mL無水甲苯和0. 05 0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在惰性氣體保護下加熱至80 120°C后，恒溫反應12 36小時，冷卻至室溫，過濾收集硅納米線或硅納米線陣列，用有機溶劑超聲清洗除去未反應的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，過濾收集表面修飾有氨基的硅納米線或硅納米線陣列；3)將步驟2)得到的表面修飾有氨基的硅納米線或硅納米線陣列置于反應器中，加入質量濃度為10% 50%的戊二醛水溶液，室溫攪拌反應，然后用有機溶劑超聲清洗除去未反應的戊二醛，過濾收集表面修飾有醛基的硅納米線或硅納米線陣列；4)將步驟3)得到的表面修飾有醛基的硅納米線或硅納米線陣列置于反應器中，加入濃度為1 6mol/L的氨基熒光素的乙醇溶液或丙酮溶液，室溫下攪拌反應，然后用有機溶劑反復超聲清洗除去未反應的氨基熒光素，直至洗滌液無熒光，過濾收集經過氨基熒光素修飾的硅納米線或硅納米線陣列；5)將步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線，或從步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線陣列上刮取的單根硅納米線置于乙醇或丙酮中，超聲使硅納米線分散，取分散液置于0. 1 5M的NaBH4水溶液中進行還原，于室溫下反應，得到表面修飾有對一氧化氮具有選擇性熒光響應的還原態氨基熒光素的硅納米線的化學傳感器。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征是將步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線或硅納米線陣列經進一步處理后再進行步驟5)，所述的處理是將步驟4)得到的經過氨基熒光素修飾的硅納米線或硅納米線陣列置于反應器中，加入濃度為0.01 0. 06mol/L的三乙酰氧基硼氫化鈉的乙醇溶液或丙酮溶液，在溫度為30 70°C下加熱反應，然后用有機溶劑反復超聲清洗除去未反應的三乙酰氧基硼氫化鈉，過濾收集得到經過氨基熒光素修飾的硅納米線或硅納米線陣列。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征是步驟3)所述的室溫攪拌反應的反應時間為0. 5 2小時；步驟4)所述的室溫下攪拌反應的反應時間為0. 5 3小時； 步驟5)所述的于室溫下反應的反應時間為2 24小時。
6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征是所述的化學氣相沉積法制備得到的硅納米線的直徑為5 20nm ；所述的化學刻蝕法制備得到的硅納米線陣列中的硅納米線的直徑為100 300nm，長度為5 40ym。
7.根據權利要求3或4所述的制備方法，其特征是所述的有機溶劑是甲醇、乙醇或丙酮。
8.一種根據權利要求1 3任意一項所述的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器的應用，其特征是所述的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器用于對一氧化氮分子的檢測，在有一氧化氮存在的體系中，所述的基于硅納米線的化學傳感器會產生熒光，通過繪制一氧化氮的濃度和特征熒光特征峰強度的定標曲線，由所述的基于硅納米線的化學傳感器檢測到的特征熒光特征峰的強度確定體系中一氧化氮的濃度。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征是所述的有一氧化氮存在的體系是動物肝臟提取液。
全文摘要
本發明屬于納米結構的熒光化學傳感器領域，特別涉及對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器及其制備方法和應用。本發明是將基于化學氣相沉積法和化學刻蝕方法制備得到的硅納米線和硅納米線陣列進行表面處理，然后再用有機小分子物質氨基熒光素對其進行化學共價修飾，得到對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器。本發明的對一氧化氮具有選擇性熒光響應的基于硅納米線的化學傳感器可用于溶液及生物體系中一氧化氮的檢測。
文檔編號G01N21/64GK102419319SQ20111026616
公開日2012年4月18日 申請日期2011年9月8日 優先權日2011年9月8日
發明者師文生, 穆麗璇, 苗榮 申請人:中國科學院理化技術研究所