專利名稱：一種煙草中煙堿的快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測方法，具體涉及利用高效液相色譜-氮化學發光檢測器 (HPLC-CLND)的一種煙草中煙堿的快速檢測方法。
背景技術：
煙堿是煙草中特有的一種生物堿，占煙草中全部生物堿含量的92%以上，與煙草內在化學成分的協調性和吸食品質有著密切的關系。同時也是煙草和卷煙質量控制環節中的一項重要指標。目前，煙葉中煙堿含量的測定方法主要有質量分析法、紫外分光光度法、 滴定法、旋光法、紅外光譜法、原子吸收分光光度法、色譜分析法、電位分析法、極譜分析法等。這些方法在靈敏度、準確度、專屬性、操作方便程度方面均存在著一定的不足；而目前較為流行的色譜法因其常連接的紫外可見光檢測器只對在紫外可見光區有吸收的化合物有響應，而且靈敏度與物質分子結構有關，且定量時需要對照品，但很多含氮化合物在此波長范圍內無吸收或吸收較弱。雖然有些分析方法先將樣品衍生，但前處理耗時，而且很可能有副反應，準確度難以保證，也無法知道樣品中至少含有多少種含氮化合物。總氮含量是評價煙葉質量的重要指標，煙葉中的總氮量和其中的各種氮化合物含量之間有著密切的相關性，故測定總氮量對了解氮化合物的特性具有一定的作用。現在應用較多且較為經典的總氮測定法為凱氏定氮法，該法步驟繁瑣，操作過程中稍有不慎易導致結果偏差。氮化學發光檢測器是一種氮選擇性較強的檢測器，對氮化合物等摩爾線性響應。 其檢測原理是使用不銹鋼燃燒器使含氮化合物在高溫下燃燒生成N0，一氧化氮進一步與臭氧反應生成激發態的二氧化氮。當激發態二氧化氮回到基態時在紅區和紅外區發光，光電倍增管檢測到的發射光強與樣品中氮的含量成正比。因為反應的專屬性，故可以分析復雜的樣品基質，而沒有或只有很小的干擾，對氮化合物等摩爾的線性響應。除檢測有機氮化物外，氮化學發光檢測法還可以用來檢測氨、胼、氰化氫和NOx等無機氮化合物。利用液相色譜和氮發光檢測器聯用技術用于檢測煙草中煙堿的含量，目前還未見報道。
發明內容
本發明的目的就是針對現有方法的步驟繁瑣，易導致結果偏差等不足，提供利用高效液相色譜-氮化學發光檢測器的一種煙草中煙堿的快速檢測方法，該法與其它檢測方法相比，不僅簡單快速，而且檢測結果準確度高。為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是一種煙草中煙堿的快速檢測方法，包括如下步驟a、樣品前處理準確稱取煙草，放入烘箱中烘干；烘干后進行研磨，制得試樣；b、標準工作溶液配制將一定量的試樣裝入提取罐中，同時加入乙醇去離子水溶液，并混合均勻；提取液離心后，將濾液靜置，并定容，過濾，作為供試品溶液；稱取一定量煙堿對照品，加相同類型溶劑溶解，并稀釋至容量瓶刻度，搖勻，即為煙堿對照品溶液；C、高效液相色譜測定高效液相色譜的檢測器為氮發光檢測器，以三氟乙酸水溶液和三氟乙酸的甲醇溶液為流動相分別對步驟b中的供試品溶液、對照品溶液進行高效液相色譜測定，以檢測到的對照品煙堿色譜峰面積對其相應濃度進行回歸分析，得到標準曲線及其回歸方程；然后以相同方法對步驟b中的供試品溶液進行測定，將供試品色譜峰面積帶入標準曲線的回歸方程中得到供試品溶液中的煙堿的濃度，從而計算得到煙草中煙堿的含量。所述步驟a中烘箱的的溫度為30°C -40°C。所述步驟b中的乙醇去離子水溶液為3-12倍重量，濃度為< 80%，優選濃度為 30% -75%。所述步驟b中過濾的濾膜直徑為0. 45 μ m。所述步驟c中高效液相色譜條件為SunFireC18色譜柱(50mmX2. 1mm, 2. 5 μ m) 流速0. 2-0. 4mL/min ；柱溫，22_35°C ；氮發光檢測器檢測條件為波長為250-265nm，燃燒溫度為1000-1300°C，氬氣流速為1. 0-2. 5mL/min，氧氣流速為4_8mL/min。本發明的煙草中煙堿含量的測定方法，采用氮化學發光檢測器來檢測。因為反應的專屬性，故可以分析復雜的樣品基質，而沒有或只有很小的干擾，對氮化合物等摩爾的線性響應。提高了測定的準確性，使本發明的測定方法具有靈敏度高、重復性好及檢測范圍廣的優點，平均回收率為97%，而且本法的方法操作簡單、快捷，自動化程度高，易于推廣應用。另外，本發明的煙草中煙堿含量的測定方法，針對煙草或煙草制品的特點，對前處理及高效液相色譜的條件進行了優化，降低了雜質對煙堿的影響，進一步的提高了測定的準確性。
圖1 本發明供試品色譜圖；圖2 本發明煙堿對照品色譜圖；圖3:本發明空白溶劑(水)色譜圖。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明做進一步描述實施例1 一、儀器與試劑高效液相色譜；SunFireC18色譜柱(50_Χ2· 1謹，2. 5 μ m)；氮發光檢測器1)樣品前處理用軟毛刷清除煙葉樣品上的細土和砂粒，將煙葉剪成片狀或切成絲狀。將處理好的煙葉放入烘箱，在30°C的烘箱中烘干，直至可用手指捻碎。從烘箱中取出烘干好的樣品， 馬上進行研磨，隨即裝入密封袋保存，此即為制備好的試樣。2)準備標準工作溶液按照我國煙草行業標準(YC/T31-1996)測定試樣的含水率。將一定量的試樣裝入提取罐中，同時加入試樣的3倍重量的濃度為75%的乙醇去離子水溶液，并混合均勻。提取液離心后，將濾液置于一定容積的量瓶中，并用提取溶劑定容，進樣前經0. 45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。稱取一定量煙堿對照品，加入相同的乙醇去離子水溶液溶解，并稀釋至容量瓶刻度，搖勻，即為煙堿對照品溶液。3)高效液相色譜測定利用HPLC-CLND對煙堿進行檢測，分析條件SunFireC18色譜柱(50mmX2. 1mm,
2.5 μ m)；流動相(A)水TFA = 100 0. 1，(B)甲醇TFA = 100 0. 1 ；梯度洗脫，0 35min A相從95 %線性改變至5 %，流速0. 2mL/min ；柱溫22°C ；進樣體積10 μ L。氮發光檢測器測定檢測波長為250nm，燃燒溫度為1000°C，氬氣流速為1. OmL/min，氧氣流速為 6. OmL/min，檢測數據自動采集。取對照品溶液進樣繪制標準曲線，計算回歸方程Y = 218. 774X+1.972, r = 0. 9998。精密度試驗RSD為2. 1 %、穩定性試驗他內穩定性良好、重復性試驗RSD為3. 4%， 回收率試驗平均回收率為96. 7% ；RSD為3. 8%。取供試品溶液分別進樣檢測，帶入回歸方程，計算樣品中煙堿含量為1.83%，行業標準檢測方法氣相色譜-質譜分析法的檢測結果為 1. 84%，兩者 RSD 為 2. 7%。實施例2 本實施例的測定方法與實施例1基本相同，區別在于烘箱烘干溫度是38°C，加入的乙醇去離子水溶液是試樣的8倍重量，濃度是30%，利用HPLC-CLND對煙堿進行檢測，分析條件SunFireC18 色譜柱(50mmX2. 1mm, 2. 5 μ m)；流動相(A)水TFA= 100 1. 0，(B) 甲醇TFA=IOO 1.5 ；梯度洗脫，O ;35min A相從95%線性改變至5%，流速0. 3mL/ min ；柱溫28 V ；進樣體積10 μ L ；氮發光檢測器檢測條件檢測波長為255nm，燃燒溫度為 1150°C，氬氣流速為2. OmL/min，氧氣流速為4. OmL/min，檢測數據自動采集。取對照品溶液進樣繪制標準曲線，計算回歸方程Y = 16. 258X+1.5017, r = 0.9997。精密度試驗RSD 為4. 7%、穩定性試驗他內穩定性良好、重復性試驗RSD為4. 1%，回收率試驗平均回收率為95. 3% ；RSD為5.0%。取供試品溶液分別進樣檢測，帶入回歸方程，計算樣品中煙堿含量為1.87%，行業標準檢測方法氣相色譜-質譜分析法的檢測結果為1.84%，兩者RSD為
3.4%。實施例3 本實施例的測定方法與實施例1基本相同，區別在于烘箱的烘干溫度是40°C，加入的乙醇去離子水溶液是試樣的12倍重量，濃度是80%。SimFireClS色譜柱 (50mmX2. 1mm, 2. 5 μ m)；流動相(A)水TFA = 100 2. 0，(B)甲醇TFA = 100 2. 5 ； 梯度洗脫，O 35minA相從95 %線性改變至5 %，流速0. 4mL/min ；柱溫35 °C ；進樣體積 10 μ L ；氮發光檢測器檢測條件檢測波長為^5nm，燃燒溫度為1300°C，氬氣流速為2. 5mL/ min，氧氣流速為8. OmL/min，檢測數據自動采集。取對照品溶液進樣繪制標準曲線，計算回歸方程Y = 95. 569X+9. 715, r = 0. 9995。精密度試驗RSD為3. 6%、穩定性試驗8h內穩定性良好、重復性試驗RSD為3. 3 %，回收率試驗平均回收率為97. 1%;RSD為4. 0%。取供試品溶液分別進樣檢測，帶入回歸方程，計算樣品中煙堿含量為1. 80%，行業標準檢測方法氣相色譜-質譜分析法的檢測結果為1. 83 %，兩者RSD為3. 3%。
權利要求
1.一種煙草中煙堿的快速檢測方法，包括如下步驟a、樣品前處理準確稱取煙草，放入烘箱中烘干；烘干后進行研磨，制得試樣；b、標準工作溶液配制將一定量的試樣裝入提取罐中，同時加入乙醇去離子水溶液，并混合均勻；提取液離心后，將濾液靜置，并定容，過濾，作為供試品溶液；稱取一定量煙堿對照品，加相同類型溶劑溶解，并稀釋至容量瓶刻度，搖勻，即為煙堿對照品溶液；C、高效液相色譜測定以氮發光檢測器作為高效液相色譜的檢測器，以三氟乙酸水溶液和三氟乙酸的甲醇溶液為流動相分別對步驟b中的供試品溶液、對照品溶液進行高效液相色譜測定，以檢測到的對照品煙堿色譜峰面積對其相應濃度進行回歸分析，得到標準曲線及其回歸方程；然后以相同方法對步驟b中的供試品溶液進行測定，將供試品色譜峰面積帶入標準曲線的回歸方程中得到供試品溶液中的煙堿的濃度，從而計算得到煙草中煙堿的含量。
2.根據權利要求1所述的煙草中煙堿的快速檢測方法，其特征在于所述步驟a中烘箱的的溫度為30°C -40°C。
3.根據權利要求1所述的煙草中煙堿的快速檢測方法，其特征在于所述步驟b中的乙醇去離子水溶液為試樣的3-12倍重量，濃度為< 80%。
4.根據權利要求1所述的煙草中煙堿的快速檢測方法，其特征在于所述步驟b中過濾的濾膜直徑為0. 45 μ m。
5.根據權利要求1所述的煙草中煙堿的快速檢測方法，其特征在于所述步驟c中高效液相色譜條件為SunFireC18色譜柱，流速0. 2-0. 4mL/min ；柱溫，22_35°C ；氮發光檢測器檢測條件為波長為250-265nm，燃燒溫度為1000-1300°C，氬氣流速為1. 0-2. 5mL/min, 氧氣流速為4-8mL/min。
全文摘要
本發明公開了一種煙草中煙堿的快速檢測方法，其主要步驟為先進行樣品前處理，制得試樣；再加入乙醇去離子水溶液，離心靜置，并定容，過濾配制成供試品溶液和煙堿對照品溶液；隨后對供試品溶液和對照品溶液進行高效液相色譜測定，并進行氮發光檢測器檢測，以檢測到的結果進行回歸分析，得到供試品溶液中的煙堿的濃度，進而計算得到煙草中煙堿的含量。本發明的測定方法，采用高效液相色譜和氮化學發光檢測相結合，氮化學發光檢測對氮檢測的選擇性較強，提高了反應的專屬性，抗干擾性強，準確性高，本發明的測定方法靈敏度高、重復性好及檢測范圍廣，平均回收率為97％；而且本發明的方法操作簡單、快捷，自動化程度高，易于推廣應用。
文檔編號G01N30/06GK102353739SQ20111025631
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月1日 優先權日2011年9月1日
發明者喻世濤, 朱巍, 程書鋒, 黃龍 申請人:武漢市黃鶴樓科技園有限公司, 湖北中煙工業有限責任公司