檢測CW9基因中的CpG甲基化片段的方法

專利名稱：檢測CW9基因中的CpG甲基化片段的方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢驗領域，尤其設計ー種檢測CW9基因中的CpG甲基化片段的方法。
背景技術：
我國腫瘤的診斷主要依靠影像學手段，其缺點是不能早期診斷。一旦發現影像學異常，多數病例已錯過手術治療甚至化學藥物和放射治療的時機。因此，借助免疫檢測腫瘤標志物進行早期診斷始終是腫瘤防治研究的重要課題。但現有試劑盒檢測結果與疾病的符合率還不理想。對許多病例不能做出準確早期診斷。目前市場上用于免疫檢測腫瘤標志物的主要有放射免疫和酶免疫兩大類試劑盒。雖然它們都通過定量分析病人體內的腫瘤標志物表現提出診斷信息，但是存在以下幾方面的問題
a.定量標準混亂，不同廠家生產的試劑盒定量ー個特定樣品的結果有時會相差數倍， 導致特定標志物表達的信息無法準確傳遞出來，與疾病的符合程度下降；
b.定量范圍不合理。普遍表現為定量范圍窄，在實際應用中給定量的準確性帶來影響。 因而，新型檢測技術精確定量分析腫瘤標志物，可以準確區別個體分度和疾病狀態下腫瘤標志物水平的差異及濃度變化。而化學發光免疫診斷技術由于靈敏度高，線性范圍寬，從而在有種于確定合理的定量和定量范圍。結腸鏡檢查是目前臨床使用的最精確的結腸癌篩檢方法，但是，高額的費用和患者不愿承受這種侵入性治療方法限制了它的使用。結腸癌發生時，關聯相關基因CW9出現甲基化，然后利用RT-PCR技術進行片段擴増，基因檢測，或者而采用其他的方法進行檢測， 但對于在片段擴增前的基因CW9甲基化的早期檢測方法效果并不理想。

發明內容
發明目的本發明提供一種檢測CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其目的是解決以往的檢測方法效果不理想的問題。技術方案本發明是通過以下技術方案來實現的
一種檢測CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于該方法通過單克隆抗體和化學發光試劑聯用的方法進行檢測CW9基因中的CpG甲基化片段。單克隆抗體和化學發光試劑聯用的方法的具體步驟如下 (1)、制備單克隆抗體
單克隆抗體利用下列試劑
抗原CW9基因CpG島甲基化片段為陽性抗原，CW9基因CpG島非甲基化片段為陰性抗原，非特異性抗原為=MGMT基因CpG島甲基化片段，P16基因CpG島甲基化片段，HPPl基因CpG島甲基化片段；
其它特殊試劑弗氏完全佐計與弗氏不完全佐計，L-谷氨酰胺聚乙ニ醇-1000，14-四甲基15烷，鄰苯ニ胺，TRIS，HEPES緩沖劑，辣根過氧化氫酶標兔抗BALB/c鼠檢驗試劑盒其他常規化學試劑均為分析純試劑；
免疫動物8周齡BALB/c雄性小鼠用陽性抗原甲基化CW9/CpG進行二次免疫；每只小鼠基礎免疫劑量為100μ g，腹腔注射；24d后加強免疫，劑量為每只小鼠100μ g，尾靜脈注射，4d后取脾融合；
細胞融合免疫小鼠脾細胞與骨髄瘤細胞Sp-2 / 0以10:1混合。用50%分子量為1000 聚乙ニ醇作融合劑，融合細胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養基懸浮后，接種于以小鼠腹腔巨噬細胞作飼養層的96孔培養板中，于5%C02，37°C條件下培養，7d后，每培養孔更換 2/3HT培養液。9d后，開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔，取上清液進行篩選，對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆化； 腹水抗體純化用硫酸銨鹽析法純化腹水抗體； (2)、CW9甲基化片段免疫化學發光法測定
a.化學發光系統的優化由SapphireII不同濃度的增強劑和成底物工作液，進行化學發光值測定，進行底物工作液的優化；
b.固相化抗體微孔板的制備將上述制備的抗CW9甲基化片段單克隆抗體用0.05 mol/L、pH 為 9. 6 的碳酸鹽緩沖液稀釋成 1. 0，2. 0，5. 0，7. 0，10. 0，15. 0 μ g/mL 的包被濃度，按100 μ L/孔的量加入包被板中，37°C包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L、pH為7. 4的PBS 37°C封閉2 h后晾干備用，確定包被選擇最佳包被抗體工作濃度；
c.以正常人游離DNA作為參考，確定用優化好的HRP化學發光定量試劑對100份健康人標本進行濃度測定，進行統計學分析，確定正常游離DNA，CW9甲基化片段參考范圍；
d.化學發光免疫檢測樣品或標準品于相應孔分別加25μ L后，每孔再各加第二抗體 75 yL，在震蕩器上混勻1 min，置37°C恒溫反應60 min.洗掉游離成分，加入底物工作液 50 yL，催化底物，第10 min后測定各加樣品孔的發光值RLU，并將數據用化學發光檢測儀
Luminoskan Ascent version 2. 4. 1tfi^lf。將制備的單克隆抗體進行雜交瘤篩選及抗體檢測，具體步驟如下
雜交瘤篩選用固相抗原間接競爭性ELISA法進行包被陽性抗原甲基化CW9/CpG的濃度為25 μ g/ml，每孔加量150 μ 1 ；每孔所含抗體抗原反應物由80 μ 1培養上清液+2 μ 1 經紫外分光光度計標定濃度的15 μ g/ml的甲基化CW9/CpG組成；檢測對照孔中的抗原部分則用20μ l、20%Me0H-PBS的抗原稀釋液代替；酶底物用鄰苯ニ胺；其它按標準方法進行。優點及效果本發明提供一種檢測CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于該方法通過單克隆抗體和化學發光試劑聯用的方法進行檢測CW9基因中的CpG甲基化片段。本發明通過化學發光免疫技木，定性地測定特定的腫瘤基因甲基化片段。本發明的關鍵在于制備CW9甲基化單克隆抗體，該抗體可以對CW9甲基化片段有陽性反應，對CW9 非甲基化有陰性反應。以上得出一個中間結果，然后利用傳統的RT-PCR基因擴增技術，對上述CW9甲基化非陰性產品的樣品進行檢驗，然后根據化學發光免疫技術及RT-PCR的檢驗結果對患者是否有早期直腸癌進行綜合性的評定。本發明具有如下的優點 1、化學發光免疫檢測
化學發光免疫分析方法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)因其具有簡便易
5行、標記物制備非常容易、穩定性高、便于實現完全自動化和不污染環境等優點，特別是能在較短的時間內得到實驗結果，因此深受檢驗醫學工作者和臨床醫師的好評。化學發光免疫診斷試劑作為免疫診斷試劑的ー種，是以化學發光免疫檢測技術為基礎的ー類診斷試劑，理論上所有免疫反應均可以制備為化學發光診斷試劑盒。此類試劑盒通常包括免疫反應試劑及化學發光反應試劑。2、化學發光免疫方法的特點
作為近十年來在世界范圍內發展非常迅速的非放射性免疫分析方法。基于此構建的化學發光免疫診斷試劑具有以下突出的技術特點
①靈敏度高。以發光底物可檢測出的堿性磷酸酶的濃度比顯色底物要靈敏5000倍。這對濃度極稀的臨床標志物的檢測尤為有效。以當前廣為關注的HIV診斷為例。Handa等醫用化學發光免疫分析法檢測處于窗ロ期的HIV-I PM抗原。發現化學發光法的最小檢測極限在3. 1-6. 3pg/ml之間，而酶免疫法的最小檢測極限在12. 5-25. 0 pg/mL之間。與酶免疫法相比，化學發光法可把HIV的窗ロ期縮短7d。Sakai等醫用化學發光免疫技術檢測pM 抗原。其最小檢測濃度達到4. 3 pg/mL,小于Abbot和Coulter酶免疫試劑盒的相應濃度。 縮短了 HIV感染的窗ロ期。②寬的線性動力學范圍，發光強度在4-6個數量級之間與測定物質濃度間呈線性關系，這有助于檢測濃度較高的臨床樣本。并避免彎鉤效應，便如化學發光免疫分析檢測癌胚抗原(CEA)時的線性范圍為0. 01-1000 ng/mL，達到約6個數量級，不受血清非特異因素的干擾，使檢測的特異性和敏感性明顯提高。③光信號持續時間長，輝光型化學發光產生的光信號持續時間可達數小時甚至1 天。從而簡化了實驗操作及測量。④結果穩定、誤差小、樣品系直接發光。不需要任何光源照射。免除了各種可能因素(光源穩定性、光散射、光波選擇器等)給分析來來的影響。⑤環境友好。免除了使用放射性物質。到目前為止，還未發現化學發光免疫分析的危害性，試劑有效期可長達1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰變，一般有效期只有1-2個月。而酶聯的底物儲存性差，都無法與化學發光相比，從而有利于推廣應用。⑥、化學發光免疫分析較其他診斷技術更容易整合最新的平臺技木。由于化學發光反應的特點，尤其適合于全自動檢測，所以整合了高質量的單克隆抗體和重組(或合成) 蛋白質抗原、高效抗體標記方法、生物素親和素及磁性微粒子等固相包被技木。集加樣、傳輸、、分享、洗滌和測量、數據處理于一體的全自動診斷技術平臺將是化學發光診斷技術的發展方向之一。⑦、快速檢測、攜帯方便。試劑盒可以隨身攜帯、操作場地不限。3、化學發光免疫診斷試劑
化學發光免疫診斷試劑漸有取代放射性免疫分析與普通酶免疫診斷試劑的趨勢，是未來免疫診斷試劑的重要發展方向。理論上所有免疫反應均可以制備為化學發光診斷試劑盒。檢驗快速，攜帯方便。4、結腸癌早期檢測
經過研究論證，在連續臨床病例控制中，來自于結腸癌患者和非癌癥結腸疾病患者 3，000例血漿采樣健康控制，我們使DNA甲基化，由腫瘤流向血流充當早期敏感性特異性的結腸癌探測生物標記。在2006年ー項研究中，我們以甲基化DNA作為生物標記物在血漿中探測，結腸癌早期檢測敏感性達到90%，當測試被調整為“高敏感性”吋，則敏感度也可達到 70%。 通過參照實驗測試服務提早向患者及醫生們提供生物標記使用權。為高風險個人、癌癥及癌癥患者開發專門的診斷法，這些測試包括監督結腸癌生物標記應用及針對癌癥患者的基于組織的預期癌癥分子分類試驗。
5、化學發光試劑用于結腸癌早期檢測
結腸癌發生吋，關聯相關基因CW9出現甲基化，傳統方法可利用RT-PCR技術進行片段擴增，基因檢測，本發明的新方法利用化學發光免疫方法對腫瘤發生物甲基化片段進行免疫制作成單克隆抗體，通過化學發光免疫技術進行檢測，速度快，成本低，價格合理易于接受。
具體實施例方式下面對本發明做進ー步的說明
本發明提供一種檢測CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，該方法通過單克隆抗體和化學發光試劑聯用的方法進行檢測CW9基因中的CpG甲基化片段。本發明的方法具體步驟如下
一.制備單克隆抗體本發明所產生的CW9甲基化單克隆抗體利用下列試劑 抗原CW9基因CpG島(CpGisland)甲基化片段(甲基化CW9/CpG)為陽性抗原，CW9 基因CpG島(CpGisland)非甲基化片段(非甲基化CW9/CpG)為陰性抗原，非特異性抗原為 MGMT基因CpG島(CpGisland)甲基化片段，P16基因CpG島(CpGisland)甲基化片段，HPPl 基因CpG島(CpGisland)甲基化片段。其它特殊試劑弗氏完全佐計與弗氏不完全佐計，L-谷氨酰胺聚乙ニ醇-1000， 14-四甲基15烷(美國SIGMA公司)，鄰苯ニ胺，TRIS，HEPES緩沖劑(美國GIBCO公司)，辣根過氧化氫酶標(ELISA)兔抗BALB/c鼠檢驗試劑盒(美國標準試劑公司)其他常規化學試劑均為分析純試劑。2.免疫動物8周齡BALB/c雄性小鼠(購自衛生部藥檢所動物繁育場)用陽性抗原甲基化CW9/CpG進行二次免疫；每只小鼠基礎免疫劑量為100 μ g，腹腔注射；24d后加強免疫，劑量為每只小鼠100 μ g,尾靜脈注射，4d后取脾融合。3.細胞融合免疫小鼠脾細胞與骨髄瘤細胞Sp-2 / 0以10:1混合。用50%分子量為1000聚乙ニ醇作融合劑，融合細胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養基懸浮后，接種于以小鼠腹腔巨噬細胞作飼養層的96孔培養板中，于5%C02，37°C條件下培養，7d后，每培養孔更換2/3HT培養液。9d后，開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔，取上清液進行篩選，對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆化。4.腹水抗體純化用硫酸銨鹽析法純化腹水抗體。5.雜交瘤篩選及抗體檢測雜交瘤篩選用固相抗原間接競爭性ELISA法進行包被陽性抗原甲基化CW9/CpG的濃度為25 μ g/ml，每孔加量150 μ 1 ；每孔所含抗體抗原反應物由80 μ 1培養上清液+2 μ 1經紫外分光光度計標定濃度的甲基化CW9/CpG( 15 μ g/ml) 組成；檢測對照孔中的抗原部分則用20 μ 1抗原稀釋液(20%Me0H-PBS)代替；酶底物用鄰苯 ニ胺(OPD)；其它按標準方法進行。6.抗體的特性測定方法抗體滴度用固相抗原間接非競爭性ELISA測定，測定條件為包被抗原為甲基化CW9/ CpG，濃度為25μβ/πι1，每孔加量150 μ 1 ；抗體從100倍開始對倍稀釋，每孔加量130μ 1 ； 抗體稀釋液為0. P/oBSA-PBS ；陰性對照孔用Sp-2 / 0骨髓瘤細胞培養上清液；封閉液為1% BSA-PBS,每孔加量250 μ 1 ；酶底物用OPD ；酶標板購自美國Linbro公司。其它按標準方法進行。7.檢測標準抗原靈敏度先用期盼滴定法篩選出包被抗原濃度和抗體工作稀釋度的優化組合，以此為測試條件，用固相抗原間接競爭性ELISA法作出抗原甲基化CW9/CpG 的標準抑制曲線，并對結果進行數理統計分析。其中ELISA測試條件為包被抗原甲基化 CW9/CpG的濃度問哦5μ g/ml，每孔加量150 μ 1 ；抗體工作稀釋度為1:300000 ；抗體稀釋度為0. 1% BSA-PBS ；抗體抗原反應液為每孔65 μ 1抗體+65 μ 1相應濃度甲基化CW9/CpG ；封閉液為1% BSA-PBS，每孔加量250 μ 1 ；酶底物為OPD ；陰性對照用Sp_2 / 0骨髄瘤細胞培養上清液；酶標板用美國Linbro板。其它按標準方法進行。8.抗體的特異性用固相抗原剪輯競爭性ELISA法測定，參試陽性抗原為甲基化才、陰性抗原非甲基化CW9/CpG、非特異性抗原MGMT基因CpG島(CpGisland)甲基化片段， P16基因CpG島(CpGisland)甲基化片段，HPPl基因CpG島(CpGisland)甲基化片段。其它測試條件同1。9.抗體亞類分析用免疫雙擴散法進行。10.抗體親和カ=Friguet法。對應小鼠IgG標準曲線滴定出抗體IgG含量，再對應抗體滴度曲線求出平衡態下，抗體使抗原達到半飽和時的游離抗體克分子濃度[Ab]，帶入下式求出抗體的親和常數Ka(L/mol)
Ka = l/[Ab]
11.本發明生產單克隆抗體取得結果如下
細胞融合與雜交流細胞的篩選細胞融合后約有65. 孔長出雜交流克隆，其中對陽性抗體有反應的約為77. 5%，對陰性抗體有反應的為46. 7%。從中選擇出對陽性抗體有強烈反應同時對陰性抗體無反應的孔，經過多次亞克隆建立了 3個穩定分泌抗甲計劃片段單克隆抗體的雜交流細胞株2B6，3E7，3H18。其中再經過兩次亞克隆后，各個細胞株經過兩次亞克隆陽性率都達到了 100%，對陰性抗原的反應率均為零。經過反復測定，選2B6為最佳克隆，做進ー步的研究。抗體特性抗體滴度為7. 5x107 ；抗體檢測靈敏度為0. 005ng/ml ；
抗體的特異性陰性抗原通過固體抗原間接競爭性ELISA法經過測定表明抗體與陰性抗原無交叉反應，與其他非特異性抗原非甲基化片段無交叉反應，且與其他非特異性抗原甲基化片段有弱交叉反應，數值在0.04、. 12 (假設陽性反應為1) 抗體亞類分析為IgG3 抗體的親和カKa為8. 45xl09L/mol
12.血漿樣品的制備
使用乙ニ胺四乙酸一次性采血管(紫色頂的Becton/Dickinson)采血。血漿必須在4 小時內處理。對血漿1500 X g離心十分鐘，接著在不破壞白細胞層的情況下小心地移除血漿。血漿放在15 ml管里并再次1500 X g離心10分鐘。如果從每名患者得到了一管多的血漿，血漿合并在-SOoC的冷凍管里儲存。13.人體血漿游離DNA抽取本發明利用美國QIAGEN公司的Qia AMP DNA抽取試劑盒， 提取人體血漿游離DNA.
ニ、CW9甲基化片段免疫化學發光法測定
a.化學發光系統的優化由不同濃度的增強劑和組成底物工作液，進行化學發光值 (RLU)測定，進行底物工作液的優化。b.固相化抗體微孔板的制備將CW9甲基化單克隆抗體用0. 05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9. 6)稀釋成 1. 0，2. 0，5. 0，7. 0，10. 0，15. 0 μ g/mL 的包被濃度，按 100 μ L/孔的量加入包被板中，37°C包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L PBS (pH 7.4)37°C封閉2 h后晾干備用，確定包被選擇最佳包被抗體工作濃度.
c.正常人游離DNA作為參考，確定用優化好的HRP化學發光定量試劑對100份健康人標本進行濃度測定，進行統計學分析，確定正常游離DNA CW9甲基化片段參考范圍。d.化學發光免疫檢測樣品或標準品于相應孔分別加25 μ L后，每孔再各加第二抗體75 yL，在震蕩器上混勻1 min，置37°C恒溫反應60 min.洗掉游離成分，加入底物エ 作液50 yL，第10 min后測定各加樣品孔的發光值RLU，并將數據用化學發光檢測儀定量軟件 Luminoskan Ascent version 2· 4· 1 軟件&行定量分析。15.即時PCR測定CW9/CpG島片段的甲基化程度
把化學發光免疫階段測定的CW9/CpG島甲基化片段陽性樣品DNA進行即時PCR甲基化程度測定利用美國ABI即時PCR測定試劑盒，和甲基化片段測定試劑盒進行測定。16.根據甲基化程度的高低曲線來判定樣品中是否含有腫瘤細胞。本發明具有如下實用內容
1.利用本發明所涉及的單克隆抗體檢測人體各種體液包括血液、唾液及其它的液體中的CW9基因中的CpG甲基化片段。2.利用本發明所涉及的單克隆抗體測定CW9基因CpG甲基化片段所得的中間結果再結合以往常規的方法來判定人體各項腫瘤包括直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等固體腫瘤以及白血病、淋巴癌等液體腫瘤的早期檢驗，以及癌癥治療跟蹤等應用。3.利用本發明所涉及的單克隆抗體作為對正常人進行各種癌癥的早期篩查的中間指標。4.利用本發明所涉及的單克隆抗體與即時PCR結合，進行各種的癌癥篩查與檢驗。5.本發明所涉及的單克隆抗體可以用于化學免疫發光或和普通酶標法(ELISA) 以及其它的生化免疫方法測定CW9基因中的CpG甲基化片段。6.通過本發明涉及的單克隆抗體而測定的CW9基因中的CpG甲基化片段的結果， 除了在腫瘤檢測方面應用，也可以運用于非腫瘤鄰域的應用。
權利要求
1.一種檢測CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于該方法通過單克隆抗體和化學發光試劑聯用的方法進行檢測CW9基因中的CpG甲基化片段。
2.根據權利要求1所述的檢測CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于單克隆抗體和化學發光試劑聯用的方法的具體步驟如下(1)、制備單克隆抗體單克隆抗體利用下列試劑抗原CW9基因CpG島甲基化片段為陽性抗原，CW9基因CpG島非甲基化片段為陰性抗原，非特異性抗原為=MGMT基因CpG島甲基化片段，P16基因CpG島甲基化片段，HPPl基因CpG島甲基化片段；其它特殊試劑弗氏完全佐計與弗氏不完全佐計，L-谷氨酰胺聚乙ニ醇-1000，14-四甲基15烷，鄰苯ニ胺，TRIS，HEPES緩沖劑，辣根過氧化氫酶標兔抗BALB/c鼠檢驗試劑盒其他常規化學試劑均為分析純試劑；免疫動物8周齡BALB/c雄性小鼠用陽性抗原甲基化CW9/CpG進行二次免疫；每只小鼠基礎免疫劑量為100 μ g，腹腔注射；24d后加強免疫，劑量為每只小鼠100 μ g，尾靜脈注射，4d后取脾融合；細胞融合免疫小鼠脾細胞與骨髄瘤細胞Sp-2 / 0以10:1混合；用50%分子量為1000 聚乙ニ醇作融合劑，融合細胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養基懸浮后，接種于以小鼠腹腔巨噬細胞作飼養層的96孔培養板中，于5%C02，37°C條件下培養，7d后，每培養孔更換 2/3HT培養液；9d后，開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔，取上清液進行篩選，對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆化；腹水抗體純化用硫酸銨鹽析法純化腹水抗體；(2)、CW9甲基化片段免疫化學發光法測定a.化學發光系統的優化由SapphireII不同濃度的增強劑和成底物工作液，進行化學發光值測定，進行底物工作液的優化；b.固相化抗體微孔板的制備將上述制備的抗CW9甲基化片段單克隆抗體用0.05 mol/L、pH 為 9. 6 的碳酸鹽緩沖液稀釋成 1. 0，2. 0，5. 0，7. 0，10. 0，15. 0 μ g/mL 的包被濃度，按100 μ L/孔的量加入包被板中，37°C包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L、pH為7. 4的PBS 37°C封閉2 h后晾干備用，確定包被選擇最佳包被抗體工作濃度；c.以正常人游離DNA作為參考，確定用優化好的HRP化學發光定量試劑對100份健康人標本進行濃度測定，進行統計學分析，確定正常游離DNA，CW9甲基化片段參考范圍；d.化學發光免疫檢測樣品或標準品于相應孔分別加25μ L后，每孔再各加第二抗體 75 yL，在震蕩器上混勻1 min，置37°C恒溫反應60 min.洗掉游離成分，加入底物工作液 50 yL，催化底物，第10 min后測定各加樣品孔的發光值RLU，并將數據用化學發光檢測儀Luminoskan Ascent version 2. 4. 1tfi^lf。
3.根據權利要求2所述的檢測CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于將制備的單克隆抗體進行雜交瘤篩選及抗體檢測，具體步驟如下雜交瘤篩選用固相抗原間接競爭性ELISA法進行包被陽性抗原甲基化CW9/CpG的濃度為25 μ g/ml，每孔加量150 μ 1 ；每孔所含抗體抗原反應物由80 μ 1培養上清液+2 μ 1 經紫外分光光度計標定濃度的15μ g/ml的甲基化CW9/CpG組成；檢測對照孔中的抗原部分則用20μ l、20%Me0H-PBS的抗原稀釋液代替；酶底物用鄰苯ニ胺；其它按標準方法進行。
全文摘要
本發明提供一種檢測人體CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于該方法通過單克隆抗體和化學發光試劑聯用的方法進行檢測CW9基因中的CpG甲基化片段，然后利用傳統的RT-PCR基因擴增技術，對上述CW9甲基化非陰性產品的樣品進行檢驗，然后根據化學發光免疫技術及RT-PCR的檢驗結果對患者是否有早期直腸癌進行綜合性的評定，以及進行各種的癌癥篩查與檢驗。
文檔編號G01N33/531GK102565406SQ20111025423
公開日2012年7月11日 申請日期2011年8月31日 優先權日2011年8月31日
發明者孫琦, 程澎, 賈世哲 申請人:孫琦, 程澎