黃曲霉毒素B₁的熒光增敏劑及其運用的制作方法

專利名稱：黃曲霉毒素B₁的熒光增敏劑及其運用的制作方法
技術領域：
本發明涉及化學領域的含量分析領域，特別涉及黃曲霉毒素B1的熒光檢測。
背景技術：
黃曲霉毒素B1于1993年被世界衛生組織(WTO)的癌癥研究機構劃定為I類致癌物，對人類健康危害極大。我國相關的限量標準已經過多次修訂(20 μ g/kg)，但是相對于國際上所制定的限量標準(WH0/FA0規定為15 μ g/kg, EU規定為2 μ g/kg)，仍然明顯偏高，因此亟需研究AFB1衍生試劑以提高檢測靈敏度。目前常用強氧化劑三氟乙酸和鹵族元素及衍生物等，但存在需加熱、穩定性差、試劑有腐蝕性，保存壽命短等不足，研究安全而穩定的新型熒光增強劑，提高光學系統靈敏度成為研究黃曲霉毒素檢測技術的重要發展方向。β -⑶是超分子化學最重要的主體，利用β -⑶及其衍生物和多類客體分子形成超分子體系過程熒光強度發生變化的特性，將其作為熒光增敏試劑的研究和應用越來越多，但β-CD是否適用于作黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑還有待提高。另外，在食品安全高靈敏度檢測技術的開發領域，缺乏利用β "CDs三元絡合反應進行熒光增強作用的探索與研究。

發明內容
本發明的目的之一在于提供一種熒光增敏劑，該熒光增敏劑可以顯著提高黃曲霉毒素B1熒光檢測時的強度。為實現上述目的，本發明的技術方案為
黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑，所述黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑由所述環糊精或/ 和β -環糊精衍生物與含有Hg2+的溶液組成，所述β -環糊精或/和β -環糊精衍生物與 Hg2+摩爾比為1-10:1。進一步，所述β-環糊精與含有Hg2+的溶液的摩爾濃度均為O.Olmol/L，所述 β-環糊精與含有Hg2+的溶液的體積比為4:1。進一步，所述β-環糊精衍生物為β-環糊精、2，4_ 二甲基-β-環糊精、羥丙基- β -環糊精、羥乙基- β -環糊精和甲基- β -環糊精中的一種或多種混合。本發明的目的之二在于提供一種黃曲霉毒素B1三元絡合物，該三元絡合物對熒光的吸收量與黃曲霉毒素B1 二元絡合物相比，顯著提高。為實現上述目的，本發明的技術方案
含有所述的黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑的黃曲霉毒素B1待測溶液。
進一步，所述黃曲霉毒素B1待測溶液為含有黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的體積百分數為20-70%。進一步，所述甲醇水溶液中甲醇的體積百分數為50%。進一步，所述β-環糊精或/和β-環糊精衍生物與黃曲霉毒素&的摩爾比為大于或等于300 :1，所述Hg2+與黃曲霉毒素B1的摩爾比為大于或等于300 :1。本發明的目的之三在于提供一種檢測所述黃曲霉毒素B1待測溶液含量的方法，該方法靈敏度高。為實現上述目的，本發明的技術方案為
檢測所述的黃曲霉毒素B1待測溶液含量的方法，將所述黃曲霉毒素B1待測溶液在最大激發波長為360-370nm，最大發射波長為432-445nm的條件下測量熒光強度，并計算黃曲霉
毒素B1的含量。進一步，所述黃曲霉毒素B1待測溶液的配制為在黃曲霉毒素B1的甲醇水溶液中依次加入配方量的含有Hg2+的溶液、β-環糊精或/和β-環糊精衍生物溶液，混合均勻， 得黃曲霉素B1待測溶液。本發明的有益效果在于黃曲霉毒素&的熒光增敏劑的熒光強度顯著增強，當溶劑中甲醇比例為50%，Hg2+、β -⑶與AFB1反應摩爾比均大于300 1時，熒光增強倍數最大， 可達到15倍，顯著高于國標及報道中的各種衍生試劑。將黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑作為新型熒光增強劑，替代國標中傳統衍生試劑，提高檢測靈敏度，建立了高靈敏度、快速測定AFB1W熒光分析法。AFB1濃度在0. 1-40 μ g/L范圍內與體系熒光強度呈線性關系，相關系數R為0. 9998，檢出限為0. 08 μ g/L,回收率為90%_100% ；與國標方法及速測方法比對分析，檢測準確度均無顯著性差異。
具體實施例方式本發明中涉及的主要儀器和試劑如下
日立F-2500熒光分光光度儀；島津UV-2450紫外分光光度計；NYART-I型AFB1定量熒光速測儀(華夏科創有限公司)；分析天平；純水發生器。AFB1 (IO6Pg/!甲醇溶液，美國SIGMA公司)甲醇(色譜純，天津四友)；β-環糊精(β-⑶)、2，4_ 二甲基-β-環糊精(DM-β-⑶)、羥丙基-β-環糊精(ΗΡ-β-⑶)、羥乙基-β -環糊精(HE- β -⑶)、甲基-β -環糊精(M- β -⑶)、葡萄糖基-β -環糊精(分析純，山東新大精細化工有限公司)水溶液；HgCl2 (分析純，貴州銅仁汞試劑公司)水溶液。
實施例1 β -環糊精和Hg2+摩爾比的影響一試劑的配制
12組試劑的配制步驟為首先1-6組中的每組中均加入ImL lOPg/L AFB1甲醇溶液， 200μ 0. 01mol/L HgCl2,混勻；然后 1-6 組中分別加入 0、40、100、200、300、400μ 0. Olmol/ L β -CDs，混勻后得含有所述的黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑的黃曲霉素B1待測溶液。同時在7-12組的每組中均加入ImL 10μ§/1 AFB1甲醇溶液，再在7_12組中分別加入 0、40、80、120、160、200μ 0. 01mol/L HgCl2,混勻后，均加入 800μ 0. 01mol/L β -CDs，混勻后得含有所述的黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑的黃曲霉毒素B1待測溶液。12組試劑中AFB1 終濃度為5Pg/L。所述甲醇溶液中甲醇的體積百分含量為50%。二檢測方法
分別取待測溶液1-12號各lmL，用1. Ocm熒光用石英比色杯放置在熒光分光光度計中進行熒光激發、發射光譜的掃描，儀器狹縫均置為5nm。另外，取5Pg/L AFB1標準品溶液作為空白對照，用1.0cm熒光用石英比色杯，在最大激發波長365nm，最大發射波長440nm處測量熒光強度，狹縫均置為5nm。對400 μ g/L AFB1進行光譜掃描，確定AFB1最大激發波長(EX)365nm，最大發射波長(EM)432nm。對AFB1-HgCl2- β -OTs體系進行光譜掃描，確定研究AFB1熒光增強作用的熒光體系最大激發波長(EX) 365nm，最大發射波長(EM) 440nm。三結果
1-12 組熒光強度讀數依次分別為:24. 7,290. 3,310. 9,337. 5,339. 1,338. 2,24. 7、 137. 4,294. 1,341. 1,340. 5,342. 3。根據實驗結果，HgCl2、β-⑶與AFBl摩爾比在100:1 500:1范圍內時，均能達到一定程度的熒光增強。當HgC12、β-⑶與AFBl摩爾比均大于300 :1時，反應完全且濃度升高對反應沒有影響。當HgC12、i3-⑶均過量時，β-⑶與HgC12摩爾比在1_3:1范圍內， 摩爾比增大有利于熒光增強，3-10 1時熒光值穩定且達到最大。推測原因為包合反應是可逆反應，體系中β-CD濃度高有利于化學反應快速完全。通過計算5 μ g/L AFBl至少需要 0. OlmoVLHgCl2I μ L,0. 01mol/L β-CD溶液4yL。由于AFB1污染具有不均勻性，有高濃度含量樣品檢測，因此要確保熒光增強劑過量，使測定準確快速穩定。
實施例2甲醇含量的影響一試劑的配制
試劑共配制6組，配制步驟為首先1-6組中的每組中均加入400μ 濃度為5(^g/L AfB1JOOPLO. 01mol/L HgCl2,混勻后加入 400μ 0. 01mol/L β -CDs，再依次加入 0、200、400、 600、800、1000μ 甲醇，混勻后混勻后得含有所述的黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑的黃曲霉毒素B1待測溶液。二檢測方法
檢測方法同實施例1中的“檢測方法”。三結果
1-6 組熒光強度讀數依次分別為:622. 3,703. 7,735. 7,753. 1,739. 1、628。在分析過程中，選擇適當的甲醇/水比例，能夠更好的達到熒光增強的效果(AFB1 易溶于有機溶劑，在水中溶解度極低，在水相中易發生熒光淬滅作用；β "CD溶于水且能增加AFB1在水相中的溶解度)。根據實驗結果，甲醇比例在20% 70%范圍內時，均有一定程度的熒光增強。當甲醇比例為50%時，反應時間短，反應穩定，熒光增強值高，因此選擇50% 作為最佳反應比例。并在甲醇比例50%條件下，對反應時間進行考察，混勻后即可測定，30d 內保持穩定，表明形成了穩定的三元絡合物。
實施例3 β環糊精衍生物的影響一試劑的配制
在 ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、 200μ β-環糊精混勻。檢測方法同實施例1的檢測方法，熒光強度讀數依次分別為 39.98,290.3,328.9,335. 7,340,340. 8。在ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、200 μ L葡萄糖基-β -環糊精混勻。檢測方法同實施例1的檢測方法，熒光強度讀數依次分別為39. 98、169、178、182. 3,186. 1、187。在ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、 200 μ L2，4- 二甲基-β -環糊精混勻。檢測方法同實施例1的檢測方法，熒光強度讀數依次分別為39. 98,300,308. 9、313、320、324。在ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、 200 μ L羥丙基-β -環糊精混勻。檢測方法同實施例1的檢測方法，熒光強度讀數依次分別為39.98、289、300、308、312、313。在ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、 200 μ L羥乙基-β -環糊精混勻。檢測方法同實施例1的檢測方法，熒光強度讀數依次分別為39. 98,292. 3,318.9,330.7,331,332.1。在ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、 200yL甲基-β-環糊精混勻。檢測方法同實施例1的檢測方法，熒光強度讀數依次分別為39. 98,288,310. 2,321,330. 3、335。在ImL 10 μ g/L AFB1 中依次加入 0、20、40、60、80、100 μ L HgCl2,混勻后加入 800 μ L葡萄糖基-β -環糊精混勻。檢測方法同實施例1的檢測方法，熒光強度讀數依次分別為39. 98,100. 1、150、166、170、187。在ImL 10 μ g/L AFB1 中依次加入 0、20、40、60、80、100 μ L HgCl2,混勻后加入 800 μ L2，4- 二甲基-β -環糊精混勻。檢測方法同實施例1的檢測方法，熒光強度讀數依次分別為:39. 98,151,274. 1,311. 1,324. 5、324。在ImL 10 μ g/L AFB1 中依次加入 0、20、40、60、80、100 μ L HgCl2,混勻后加入 800 μ L羥丙基-β -環糊精混勻。檢測方法同實施例1的檢測方法，熒光強度讀數依次分別為39. 98,151,274. 1,311. 1,324. 5、324。在ImL 10 μ g/L AFB1 中依次加入 0、20、40、60、80、100 μ L HgCl2,混勻后加入 800 μ L輕乙基-β -環糊精混勻。檢測方法同實施例1的檢測方法，熒光強度讀數依次分別為39. 98、137、262、321、330、332.1。在ImL 10 μ g/L AFB1 中依次加入 0、20、40、60、80、100 μ L HgCl2,混勻后加入 SOOyL甲基-β-環糊精混勻。檢測方法同實施例1的檢測方法，熒光強度讀數依次分別為39. 98,147. 4,274. 1,311. 1,330.5、335。實驗結果顯示隨著β -⑶s和Hg濃度的變化，不同β -⑶S- HgCljfAFBd^有熒光增強作用，表明β-環糊精、葡萄糖基-β-環糊精、2，4_二甲基-β-環糊精、羥丙基-β-環糊精、羥乙基- β -環糊精和甲基- β -環糊精一種或多種均可以作為AFB1的熒光增強劑。 其中葡萄糖基-β -CD熒光增強幅度相對較小，分析原因可能是其余四種衍生物均屬于環糊精醚衍生物，僅葡萄糖基-β "CD屬于單支鏈環糊精，取代基分子較大，對客體分子進入空腔造成了一定程度的阻礙。除葡萄糖基-⑶外，β -⑶與其余四種衍生物的增強后熒光值均無顯著性差異(P >0.05)，且⑶成本較其衍生物更為低廉，約為其它⑶s價格的1/10，更符合做新型熒光增強劑的條件。
實施例4四種體系一試劑的配制
β-CD-Hg2+甲醇/水溶液體系在ImL甲醇中，加入0. OlmoVLHgCl2溶液200 μ L，再加 Λ 0. 01mol/L β -CD 溶液 800 μ L,混勻。AFB1 - HgCl2-β -CD 體系在 ImL 40 μ g/L AFB1 甲醇溶液中，加入0. 01mol/LHgCl2 溶液200yL，再加入0. 01mol/L β-CD溶液800 μ L，混勻。AFB1- β -CD 體系在 20 μ L 1000 μ g/L AFB1 甲醇溶液中，加入 0. 01mol/L β -CD 溶液980 μ L，混勻。AFB1- Hg2+ 體系在 ImL 40 μ g/L AFB1 甲醇溶液中，加入 0. 01mol/LHgCl2 溶液 200 μ L，超純水 800 μ L。四種體系中AFB1濃度均為20 μ g/L。二檢測方法
檢測方法同實施例1的檢測方法。三結果
在EX 432nm, EM 440nm處，β _⑶-Hg2+甲醇/水溶液體系的熒光強度讀數為10. 3， AFB1 - HgCl2-P -⑶體系的熒光強度讀數為2四0. 0，AFB1-^-OT體系的熒光強度讀數為 890. 1，AFB1- Hg2+體系的熒光強度讀數為552. 9。將各體系熒光光譜特性進行比較，β -⑶-Hg2+甲醇/水溶液在365/432nm處無熒光產生。AFB1-HgCl2-^-QKAFB1-P-OKAFB1- Hg2+反應體系的EX基本沒有發生移動，說明基態分子結構均沒有發生變化。AFB1-HgCl2-β-OTJFB1- Hg2+體系的EM發生了相同的變化(432nm到440nm)，說明々 81與Hg2+很大可能發生了配位反應，形成的AFB1- Hg2+螯合物作為客體分子被包合在β-CD空腔內。同時，三元絡合物的增強程度很大，沒有其他峰干擾，可以有效提高檢測的靈敏度和選擇性。分析反應前后體系熒光強度增加的可能原因為(1) β-CD空腔為AFB1的生色團提供了一個非極性環境，使其處于去水化狀態，對增進量子效應從而為增強熒光強度提供了有利的條件；(2)當AFB1包合進β -CD分子的空腔后，β -CD腔的構造保護了 AFB1的熒光單級態分子免于從外部淬滅；(3)由于增加了疏水性 AFB1在水中的溶解度，而增加了熒光強度。將各體系紫外吸收光譜進行比較，根據紫外吸收光譜圖，在AFB1中加入Hg2+后， 最大吸收波長發生了明顯的藍移(364 — 374nm)，表明AFB1和Hg2+之間存在著某種相互作用，該作用可能與AFBJPHg2+形成金屬螯合物有關。在AFB1- Hg2+中加入⑶后，最大吸收波長未發生變化(仍為374nm)，但吸光度增加，從中可以推測，AFB1-Hg2+螯合物作為客體分子進入β -CD空腔內，形成了穩定的復合體，AFB1的共軛程度增加，從而增強熒光強度。實施例5黃曲霉素B1待測溶液的配制一試劑的配制
方法1:在ImL 20 μ g/L AFB1甲醇溶液中先加入0. 01mol/LHgCl2溶液200 μ L，再 0. 01mol/L β -CD溶液800 μ L，得待測溶液。方法2 在ImL 20 μ g/L AFB1甲醇溶液中先加入0. 01mol/L β -CD溶液800 μ L，再加入0. OlmoVLHgCl2溶液200 μ L，待測溶液。二檢測方法
檢測方法同實施例1。
三結果
將方法1和方法2所得待測溶液分別測定體系的熒光強度，其分別為1091和998。結果表明兩種衍生方法都有熒光增強作用，按照方法1進行配制能夠達到更好的熒光增敏效果。若按照方法2進行配制，β -CD空腔的構造保護了 AFB1的熒光單級態分子免于從外部淬滅，從而不能與HgCl2完全螯合，未螯合的AFB1僅能形成AFB1- β -⑶二元包合物或形成部分AFB1- β -⑶-Hg三元包合物，因此不能達到最大熒光增強效果。實施例6熒光增強效果比較一檢測體系
實驗重點對國標及報道中的不同實驗試劑體系的熒光增敏作用進行了比較。實驗試劑體系分別為=DBr2體系:lmL40yg/L AFB1甲醇溶液中加入ImLO. 00 溴溶液；2) HgCl2 體系lmL40yg/L AFB1甲醇溶液中加入900 μ L超純水，IOOyL HgCl2 ;3) β-CD體系 lmL40 μ g/L AFB1甲醇溶液揮干后加入40 μ L甲醇，1000 μ L 0. 01mol/L β -CD水溶液， 96(^1^純水；4)取(12-3-0)體系11^4(^8/1 AFB1 甲醇溶液中加入 200yL HgCl2,混勻后加入800 μ L β -⑶。上述實驗試劑體系中AFB1濃度均為20 μ g/L。二檢測方法
方法1 同實施例1的檢測方法。方法2 參照《MA Liang(馬良).Beijing(北京)Chinese Academy of Agricultural Sciences (中國農業科學院)，Doctoral Dissertation (博士論文)，2007》 一文中AFB1-IAC速測方法。三結果
增強倍數=增強后的熒光值/ AFB1本底熒光值一 1，如表1。方法1和方法2的研究結果一致HgC12-i3 -⑶體系對AFB1熒光增強15倍，遠遠優于其他衍生試劑。實施例7黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑靈敏度和回收率的檢測一試劑的配制
1 AFB1 - HgCl2- β -⑶標準溶液的配制
移取 0、40、80、160、M0、320、400、600、800 PL 濃度為 5Pg/L 的 AFB1 甲醇溶液，濃度 200、400、600、800濃度為μ 50μδ/ 的AFB1甲醇溶液于13只試管中，依次加入1000,960, 920、840、760、680、600、400、200、800、600、400、200μ 甲醇后，于每只試管中加入 200μ 0. OlmoVLHgCl2,800μ 0. 01mol/Lβ-CD (即最終溶劑中甲醇比例為50%)，充分振蕩，配制成 0,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、1、1· 5、2、5、10、15、20“g/L AFB1 溶液。2 AFB1標準溶液的配制
移取 0、40、80、160、240、320、400、600、800 μ 濃度為 5“g/L 的 AFB1 甲醇溶液，濃度 200、 400,600,800濃度為的AFB1甲醇溶液于13只試管中，添加甲醇均至2mL，配制成含有濃度相同但未使用黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑的AFB1甲醇溶液為對照。3回收率試劑
分別在25g AFB1陰性玉米、花生油中分別添加25 μ L 10000 μ g/L AFB1甲醇溶液(即 AFB1含量為10 μ g/kg)，進行回收試驗(回收率=加標試樣測定值/加標量X 100%)，平行測
定三次。二檢測方法
提取、凈化參照GB/T 18979-2003。在凈化后的甲醇洗脫液中加入200μ HgCl2,混勻后加入800μ 濃度為0. 01mol/L的β -⑶溶液，混勻，于熒光光度計中讀取熒光值，帶入標準曲線計算其濃度。提取、凈化參照GB/T 18979-2003。在凈化后的甲醇洗脫液中加入ImLO. 00 溴溶液，混勻，于熒光光度計中讀取熒光值，計算其濃度。三結果
權利要求
1.黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑，其特征在于，所述黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑由所述 β -環糊精或/和β -環糊精衍生物與含有Hg2+的溶液組成，所述β -環糊精或/和β -環糊精衍生物與Hg2+摩爾比為1-10 :1。
2.根據權利要求1所述的黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑，其特征在于，所述β-環糊精與含有Hg2+的溶液的摩爾濃度均為O.Olmol/L，所述β _環糊精與含有Hg2+的溶液的體積比為4:1。
3.根據權利要求1所述的黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑，其特征在于，所述β-環糊精衍生物為β -環糊精、2，4- 二甲基-β -環糊精、羥丙基-β -環糊精、羥乙基-β -環糊精和甲基- β -環糊精中的一種或多種混合。
4.含有權利要求1所述的黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑的黃曲霉素B1待測溶液。
5.根據權利要求4所述的黃曲霉毒素B1待測溶液，其特征在于，所述黃曲霉毒素B1待測溶液為含有黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的體積百分數為20-70%。
6.根據權利要求5所述的黃曲霉毒素B1待測溶液，其特征在于，所述甲醇水溶液中甲醇的體積百分數為50%。
7.根據權利要求4所述的黃曲霉毒素B1待測溶液，其特征在于，所述環糊精或/ 和β-環糊精衍生物與黃曲霉毒素B1的摩爾比為大于或等于300 :1，所述含有Hg2+的溶液中Hg2+與黃曲霉毒素B1的摩爾比為大于或等于300 :1。
8.檢測權利要求4所述的黃曲霉毒素B1待測溶液含量的方法，其特征在于將所述黃曲霉毒素B1待測溶液在最大激發波長為360 370nm，最大發射波長為432 445nm的條件下測量熒光強度，并計算黃曲霉毒素A的含量。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述黃曲霉毒素B1待測溶液的配制為在黃曲霉毒素B1的甲醇水溶液中依次加入配方量的含有Hg2+的溶液、β-環糊精或/和β-環糊精衍生物溶液，混合均勻，得黃曲霉毒素B1待測溶液。
全文摘要
本發明涉及化學領域的含量分析領域，特別涉及黃曲霉毒素B1的熒光檢測，具體為黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑，由所述β-環糊精或/和β-環糊精衍生物與含有Hg2+的溶液組成，所述β-環糊精與Hg2+摩爾比為1～101；將待測溶液在最大激發波長為360-370nm、最大發射波長為432～445nm的條件下測量熒光強度，并計算黃曲霉毒素B1的含量；黃曲霉毒素B1的熒光增敏劑的熒光強度最大可達到15倍，靈敏度高，AFB1濃度在0.1-40μg/L范圍內與體系熒光強度呈線性關系，相關系數R為0.9998，檢出限為0.08μg/L，回收率為90%-100%；與國標方法及速測方法比對分析，檢測準確度均無顯著性差異。
文檔編號G01N21/64GK102331414SQ201110250548
公開日2012年1月25日 申請日期2011年8月29日 優先權日2011年8月29日
發明者張宇昊, 張敏, 馬良 申請人:西南大學