專利名稱：基于非損傷微測技術的水稻生理性青枯病評價方法
技術領域：
本發明涉及水稻生理性青枯病的評價方法，具體涉及一種基于非損傷微測技術的水稻生理性青枯病評價方法。
背景技術：
水稻青枯病是水稻常見病害，多發生于水稻育苗期及晚水稻灌水稻灌漿期，癥狀表現為葉片卷曲萎蔫，葉片水分含量下降，青灰色，莖稈干癟柔軟。水稻生理性青枯病的發生多由于生理性失水所致，另外土層淺、肥力不夠、缺氮肥也容易導致水稻生理性青枯病的發生。水稻發生生理性青枯病時根系枯黃、根生長緩慢，因此，作為吸收水分及營養的主要器官其吸收功能下降，尤其是對無機離子的吸收表現最為明顯，因此，檢測評價水稻生長期間根系對無機離子的吸收情況可以判別是否會發生水稻生理性青枯病。以往分析植物材料中無機離子含量時都是通過前處理，然后利用原子吸收光譜法檢測離子含量，如，王寶山等對小麥葉片中Na+、K+離子含量的測定就采用了原子吸收光譜法(王寶山，趙可夫小麥葉片中Na，K提取方法的比較植物生理學通訊[J]. 1995，31(1)50-52)；陳貴桂林等研究NaCl對白刺離子含量影響時也采用了原子吸收光譜法(陳貴林，王晨霞，陳建英NaCl脅迫對白刺試管苗滲透調節物質及離子含量的影響西北植物學報[J]. 2009,6 :1233-1239)；董桃杏等檢測茉莉酸甲酯對水稻葉片無機離子含量的影響時也采用了原子吸收光譜法，以上方法對于檢測特定時間點材料中的離子含量是非常有效的，但是對離子進出植物材料的動態檢測是無法實現的(董桃杏，蔡昆爭酸甲酯對水稻葉片質膜透性及無機離子含量的影響華北農學報[J].2010，25(l)起止頁碼136-140)。非損傷微測技術(Non-InvasiveMicro-Test ^Technology，NMT)，是通過微電極和微傳感器獲取離子和分子的信號，基于Nernst方程和Fick' s第一擴散定律計算離子和分子的濃度和流速的技術，可獲得10-12mol/Cm2.S數量級的離子流信號，該技術能夠以對被測材料無損檢測的的方式在細胞、器官、組織外周測量進出的離子或分子的運動速率、方向及濃度信息等。這種技術主要應用在植物學、動物學、微生物學、醫學、環境科學、材料科學等領域。2011年澳大利亞的Siabala等人報道了用馬鈴薯病毒X(Potatc) virusX，PVX)侵染煙草，并暴露在氧化脅迫中，用非損傷性離子流檢測技術(non-invasive ionflux measuring technique, MIFE)測定了 Ca2+和K+流速，結合藥理學和細胞學方法研究了植物整體的適應性反應，發現病毒對植物的抗逆性具有重要的作用(Plant，Cell andEnvironment, 2011, 34 :406-417)。非損傷微測技術可以實現動態、不間斷的對植物材料的檢測，從而發現植物材料在不同環境及外界因素影響下的離子轉運規律，從而判斷植物所處的狀態。非損傷微測技術可實現對植物材料無損、動態離子流的測量。Chen等利用非損傷微測技術檢測了 NaCl處理下的小麥K+動態離子流，通過該種方法篩選耐鹽性小麥品禾中(Chen Ζ.，Newman I.，Zhou Μ.，Mendham N.，Zhang G. Shabala S :Screening plantsfor salt tolerance by measuring K+flux -.a case study for barley [J]. Plant, Cell&Environment，2005，28 :1230-1246) ；Shabala等利用非損傷微測技術研究鹽脅迫下Ca2+對擬南芥耐鹽性的影響時發現不同濃度的外源Ca2+調節的NaCl引起的擬南芥根部K+外流(Shabala S, Demidchik V, Shabala L, Cuin TA, Smith SJ, Miller AJ,Davies JM, NewmanIA :Extracellular Ca2+ameIiorates NaCl-induced K+Ioss from Arabidopsisroot andleaf cells by controlling plasma membrane K+-permeable channels [J]. PlantPhysiol,2006,141(4) :1653-1665)。目前對植物病害評價報道很少，申請號“200910192176”的中國專利用香蕉組培苗接種香蕉鐮刀菌枯萎病(fusarium wilt)，接種對天，按照0_6級的病害評價等級對單株生根試管苗進行病害等級鑒定；申請號“201010164237”的中國專利在室內條件下以一定數量的接種體在水稻特定生育期接種待測水稻一定時間，培養待測水稻至發病顯癥后，根據病害發生的嚴重度評價待測水稻對水稻黑條矮縮病的抗性水平，而水稻生理性青枯病發生的評價至今未見公開。
發明內容
為克服目前尚無水稻生理性青枯病有效評價方法的缺陷，本發明的目的是提供一種高效、快速、準確的水稻生理性青枯病評價方法。本發明所述的水稻生理性青枯病評價方法采用非損傷微測技術檢測水稻苗根部無機離子的離子流，所述離子流流向處于外流狀態的水稻苗即為發生了生理性青枯病，所述無機離子為K+、NH4\ Ca2+中的一種或兩種以上。在非損傷微測技術檢測植物離子流時，通常，植物體對離子的外排，即離子由植物體流向測試液稱為外流；相反地，植物體對離子的吸收，即離子由測試液流向植物體則稱為內流。所述非損傷微測技術中測試緩沖液中的測試離子濃度為0. 05 0. 15mM。所述水稻苗為2葉1心期水稻苗，測量位置為距所述水稻苗根尖300 500 μ m的根尖分生區的外表面20 50 μ m處。所述評價方法進一步包括以下步驟(1)向微電極末端灌入測試離子灌充液至充滿所述電極尖端0. 8 1. 5cm，再將所述電極的前端吸入測試離子的液體離子交換劑；(2)將經過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測水稻苗，將其根部先放在測試緩沖液中平衡20 50min，再用校正后的電極對待測水稻苗進行檢測10 20min ；(4)對檢測結果進行處理和分析。步驟(1)所述電極的前端吸入液體離子交換劑的長度為K+::150 -200 μ m
NH4+ 30 -、50 μ m ；
Ca2+ 10 -、30 μ m。 步驟⑴所述灌充液為
K+ 80 120mM KCl ；NH4+ 80 120mM NH4Cl ；Ca2+ 80 120mM CaCl2。步驟( 所述的校正液通常與測試緩沖液的成分相似，由低濃度校正液和高濃度校正液組成，具體為K+ 0. 05 0. 15mM KCl 和 0. 5 1. 5mM KCl ；NH4+ :0· 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ 0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；校正后電極的Nerst方程計算理想值是K+:55 60mV;NH4+ 55 60Mv ；Ca2+ 25 30mV。步驟(3)所述的測試緩沖液為K+或 Ca2+ 0. 05 0. 15mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mMMgCl2、0. 3 0. 6mM NaCl、0. 1 0. 3mM Na2SO4^O. 2 0. 5mM MES ；NH4+ :0. 8 1. 2mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2、0· 05 0. 15mMNH4Cl。所述K+離子流的流速為3 IOpmol. cm"2, s4，NH4+離子流的流速為100 150pmol.cm_2. Ca2+ 離子流的流速為 50 IOOpmol. cm_2. s—1。非損傷微測技術(^T)是以無損、活體、動態實時監測的方式獲得進出水稻根系的凈離子濃度、流速及方向信息的技術。將水稻沖洗根至干凈后置于測試液中利用該技術測試水稻根部無機離子的離子流，通過無機離子流的變化規律可評價生理性青枯病的發生。K+在植物體內參與多種代謝途徑，調控細胞的膨壓，參與離子運輸調控，因此正常水稻苗對K+是吸收的，而青枯病苗K+處于明顯的外排；NH4+作為植物氮素吸收的主要形式對于植物的生長發育都很重要，氮元素參與機體內各種代謝途徑，尤其在蛋白質的合成中是必須的無機元素，正常水稻苗對NH4+是吸收的，而青枯病苗NH4+處于明顯的外排；鈣是植物必須的營養元素，同時也是植物體內信號轉導途徑的第二信使，正常水稻苗對Ca2+是吸收的，而青枯病苗Ca2+則處于明顯的外排。因此，K+、NH4+或Ca2+的吸收和外排可作為判別水稻是否發生了生理性青枯病的依據。生理性青枯病苗中K+、NH4+、Ca2+等無機離子在流向發生變化的同時，其流速也與正常稻苗有很大的不同，因此，在明確的測試條件下，離子流速也可作為判斷水稻苗是否發生了生理性青枯病的依據之一。本發明的另一項技術方案是提供了非損傷微測技術在評價水稻生理性青枯病中的用途。本發明所述的檢測方法能夠實現對水稻生理性青枯病的無損、活體、快速檢測，發病水稻苗與正常水稻苗凈離子流對比明顯，檢測一個樣本只需要幾分鐘最多十幾分鐘，耗時短；相對于感官識別的評價方法，檢測準確性高。總之，本發明所述的檢測方法簡單、可靠，具有廣泛的應用前景。
圖1是本發明所述評價方法的流程圖；圖加是生理性青枯病與正常水稻苗的K+離子流分析圖(實時流速)；圖2b是生理性青枯病與正常水稻苗的K+離子流分析圖(平均流速)；圖3a是生理性青枯病與正常水稻苗的NH4+離子流分析圖(實時流速)；圖北是生理性青枯病與正常水稻苗的NH4+離子流分析圖(平均流速)；圖如是生理性青枯病與正常水稻苗的Ca2+離子流分析圖(實時流速)；圖4b是生理性青枯病與正常水稻苗的Ca2+離子流分析圖(平均流速)；其中，圖h、3a3a中縱坐標為離子流速，單位為pmol. cm_2. s—1，橫坐標為時間，單位為s ；圖2b、3b、4b中縱坐標為離子流速，單位為pmol. cm—2· s\
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。1、秧苗培養材料及培養條件為水稻品種龍粳沈(由黑龍江省農科院佳木斯水稻研究所提供)，種子經過曬種3天，鹽水04斤食鹽/100斤水)篩選后，20°C浸種2天，25°C催芽1天，播種在育苗秧盤中，土壤營養土 = 3 1，施底肥硫酸銨(1斤/1000斤土壤)和磷酸二銨O斤/1000斤土壤)，自然光照，溫度在25-30°C，培養地點在國家農業信息化工程技術研究中心溫室，秧苗在2葉1心時青枯病開始發生，此時開始離子流檢測。2、儀器及耗材離子流檢測用非損傷微測系統(BIO-OOlBJoungerUSA Sci. &Tech. Corp.，USA)，軟件imFlux，微電極采用尖端直徑為2-4 μ m的玻璃微電極。3、試劑及溶液(1)液態離子交換劑(LIX)K+ :Potassium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, M063103, USA ；NH4+Ammonium ionophore I-cocktail A；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103,USA ；Ca2+ Calcium ionophore I-cocktail A ;Sigma_Aldrich, Louis, M063103, USA。(2)測試緩沖液離子流測試時，測試不同的離子需要不同的測試液，如下K+離子0. ImM KC1、0. ImM CaCl2、0. ImM MgCl2、0. 5mM NaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mMMESNH4+離子lmM KC1、0. ImM CaCl2,0. ImM NH4ClCa2+ 離子0. ImM KCl、0· ImM CaCl2,0. ImM MgCl2、0. 5mMNaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mMMES(3)電極灌充液K+: IOOmM KClNH4+: IOOmM NH4ClCa2+: IOOmM CaCl2
(4)校正液K+ 離子0. ImM 和 ImM KClNH4+ 離子0. ImM 和 ImM NH4ClCa2+ 離子0. ImM 和 ImM CaCl24、操作方法從電極末端灌入Icm左右的相應測試離子的灌充液至電極尖端充滿，電極前端吸入適當長度(K+ 180 μ m、NH4+ :40 μ m、Ca2+ :20 μ m)的液體離子交換劑(LIX)。將電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座。參比電極為固體低滲漏性電極(WPI)。電極在相應的校正液中校正，其Nerst方程計算理想值分別是K+、NH4+ :58mV，Ca2+ J9mV。測試前，水稻苗測試材料在相應的測試緩沖液中平衡30min，然后在距離水稻根尖分生區(距離根尖400 μ m左右)表面30 μ m的地方振動檢測，每個樣品檢測IOmin。5、數據處理離子流處理基于Fick擴散定律，并通過在線軟件MageFluX-3D Ion FluxPlotting System(http://www. xuyue. net/mageflux/)計算得出。由 4 次獨立實驗所得到的數據做統計分析，利用EXcel2003分析作圖。6、結果分析由圖加和圖2b可以看出，正常水稻苗K+處于內流狀態，平均流速為-50. 3pmol.cm-2. S"1 ；發生生理性青枯病水稻苗K+處于明顯的外流狀態，平均流速為5. 4pmol. cm_2. s—1。由圖3a和圖北可以看出，正常水稻苗的NH4+處于內流狀態，平均流速為-118. 57pmol. cm—2, s—1 ；發生生理性青枯病的水稻苗的NH4+處于外流狀態，平均流速為123. 78pmol. cm 2· s 1O由圖如和圖4b可以看出，正常的水稻苗的Ca2+處于內流狀態，平均流速為-105. 68pmol. cm_2. s—1，發生生理性青枯病的水稻苗Ca2+處于外流狀態，平均流速為86. 6 lpmol. cm 2. s 1O根據幾種離子中的一種或多種流向方向可以判斷出水稻苗是否發生了生理性青枯病。雖然上文中已經用一般性說明具體實施方式
及實驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
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權利要求
1.一種水稻生理性青枯病的評價方法，其特征在于，采用非損傷微測技術檢測水稻苗根部無機離子的離子流，所述離子流流向處于外流狀態的水稻苗即為發生了生理性青枯病，所述無機離子為K+、NH4+、Ca2+中的一種或兩種以上。
2.根據權利要求1所述的評價方法，其特征在于，所述非損傷微測技術中測試緩沖液中的測試離子濃度為0. 05 0. 15mM。
3.根據權利要求1所述的評價方法，其特征在于，所述水稻苗為2葉1心期水稻苗，測量位置為距所述水稻苗根尖300 500 μ m的根尖分生區的外表面20 50 μ m處。
4.根據權利要求1-3任一項所述的評價方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向微電極末端灌入測試離子灌充液至充滿所述電極尖端0.8 1. 5cm，再將所述電極的前端吸入測試離子的液體離子交換劑；(2)將經過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測水稻苗，將其根部先放在測試緩沖液中平衡20 50min，再用校正后的電極對待測水稻苗進行檢測10 20min ；(4)對檢測結果進行處理和分析。
5.根據權利要求4所述的評價方法，其特征在于，步驟(1)所述電極的前端吸入液體離子交換劑的長度為K+ 150 ~ 200 μ m ；NH4+ :30 50μπι ；Ca2+ 10 30 μ m。
6.根據權利要求4所述的評價方法，其特征在于，步驟(1)所述灌充液為K+ 80 120mM KCl ；NH4+ 80 120mM NH4Cl ；Ca2+ 80 120mM CaCl2。
7.根據權利要求4所述的評價方法，其特征在于，步驟(2)所述的校正液為K+ 0. 05 0. 15mM KCl 和 0. 5 1. 5mM KCl ；NH4+ :0. 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ 0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；校正后電極的能斯特方程計算理想值為K+ 55 60mV ；NH4+ 55 60Mv ；Ca2+ 25 30mV。
8.根據權利要求4所述的評價方法，其特征在于，步驟(3)所述的測試緩沖液為K+或Ca2+ 0. 05 0. 15mM KC1、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mMMgCl2、0. 3 0. 6mMNaCl、0. 1 0. 3mM Na2SO4^O. 2 0. 5mM MES ；NH4+ :0. 8 1. 2mM KCl、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mMNH4Cl。
9.根據權利要求4所述的評價方法，其特征在于，所述K+離子流的流速為3 IOpmol.cm_2. S^NH4+離子流的流速為100 150pmol. cm_2. Ca2+離子流的流速為50 IOOpmol.-2 -1cm . s ο
10.非損傷微測技術在評價水稻生理性青枯病中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種水稻生理性青枯病的快速評價方法，所述方法采用非損傷微測技術檢測水稻苗根部無機離子的離子流，所述離子流流向處于外流狀態的水稻苗即為發生了生理性青枯病，所述無機離子為K+、NH4+、Ca2+中的一種或兩種以上。本發明還提供了非損傷微測技術在檢測水稻生理性青枯病中的用途。本發明所述的評價檢測方法能夠實現對水稻生理性青枯病的無損、活體、快速檢測，發病水稻苗與正常水稻苗凈離子流對比明顯，檢測一個樣本只需要幾分鐘最多十幾分鐘，耗時短；相對于感官識別的評價方法，檢測準確性高。本發明所述的檢測方法簡單、可靠，具有廣泛的應用前景。
文檔編號G01N27/416GK102393416SQ201110246849
公開日2012年3月28日 申請日期2011年8月25日 優先權日2011年8月25日
發明者于春花, 侯佩臣, 侯瑞鋒, 潘大宇, 王成, 王曉冬, 高權 申請人:北京農業智能裝備技術研究中心