一種大豆水溶性蛋白檢測方法

專利名稱：一種大豆水溶性蛋白檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種大豆水溶性蛋白檢測方法。
背景技術：
大豆中所含的蛋白質含量約為38%，是谷類食物的4 5倍，其氨基酸組成與牛奶蛋白質相近，除蛋氨酸略低外，其余必需氨基酸含量均較豐富。在營養價值上，大豆蛋白質可與動物蛋白等同。大豆蛋白飲品中的精氨酸含量比牛奶高，其精氨酸與賴氨酸之比例也較合理，脂質、亞油酸含量極為豐富且不含膽固醇，可防止成年期心血管疾病發生。此外，大豆還含有豐富的卵磷脂，可以清除血液中多余的固醇類。近年來，隨著人民生活水平的提高，大豆蛋白，特別是大豆水溶性蛋白，因其極易被人體直接吸收，且與人體內蛋白質的組成和結構相似，不但其營養品質得到了越來越高的重視，而且它的生理保健功能亦被逐步發現，如何提高大豆水溶性蛋白含量也成了栽培、 育種和遺傳研究的一個重要方向。因此，大豆水溶性蛋白含量成為檢測大豆品質的重要指標，對大豆品種進行水溶性蛋白含量的分析具有重要指導意義。1988年，我國第一次根據水溶性蛋白含量對大豆進行分級，2006年農業部專門制定了大豆水溶性蛋白含量的測定的國家標準。國際標準中大豆水溶性蛋白的檢測方式是凱氏定氮法，該方法適用于所有蛋白的標準檢驗，然而凱氏定氮法需用樣品用量大，單籽粒大豆在不影響其萌發率的前提下，所能提供的樣品水溶性蛋白含量很小，接近凱氏定氮法的檢測下限，誤差影響較大。因此該方法只適于樣品量較大的高世代材料的檢測，而對于大豆育種工作者前期基礎材料的篩選很不適合，且該方法操作危險、步驟繁瑣，耗時過長，不適合大批量檢測。染料結合法是利用蛋白與染料結合后吸光度的改變來檢測蛋白含量，有人利用偶氮洋紅G染料快速測定大豆水溶性蛋白，但該研究還處在條件摸索階段，未應用到大批量的標準檢驗中。考馬斯亮藍法發明于1976年，也屬于染料結合法的一種，初時僅用于定性檢驗，后隨著分光光度計檢測精度的提高，也應用于乳品、中藥中蛋白質的檢測，以及生理病理學中蛋白質成分的鑒定，但在作物中還未見使用。考馬斯亮藍法具有簡單、快速、靈敏的特點，但光電信號不穩定、線性擬合度，限制了其檢測準確度。低世代材料種子量少，樣品寶貴，還需要繼續向下遺傳從而獲得高世代材料，因而檢測和繁育同樣重要，這就要求在檢測的同時，保證種子的生命活性，所以提供一種適用于低世代大豆水溶性蛋白的檢測方法，具有現實意義。

發明內容
有鑒于此，本發明提供一種大豆水溶性蛋白檢測方法。該方法通過改進大豆取樣方式，既滿足低世代大豆中水溶性蛋白的檢測，又不影響剩余部分的正常育苗，使低世代篩選與高世代遺傳分析得以實現。本發明還通過縮小反應體系，改變蛋白樣品與考馬斯亮蘭染料之間的比例，提高了檢測方法的線性擬合度，適用于樣品量較少的樣本檢測。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案
本發明提供了一種大豆水溶性蛋白檢測方法，包括步驟1 沿與大豆種臍平行的方向，于種臍背側按照大豆質量的1/11 1/7取樣， 浸提后獲得待測液；步驟2 取所述待測液與濃度為0. lmg/mL的考馬斯亮藍染液按照體積比為30 35 2000的比例混合，混勻后在595nm下檢測樣品吸光度值；制作標準曲線，利用比色法得到所述待測液中水溶性蛋白含量。本發明通過等比例縮減反應體系中待測液和考馬斯亮藍染液的量，發現較小的反應體系中，標準曲線的線性關系更好。因為分光光度計檢測最少需要2mL，所以選擇考馬斯亮藍染料用量定為2mL。在確定了考馬斯亮藍染料用量定為2mL的基礎上，本發明對反應體系中待測液和考馬斯亮藍染液的量進行非等比例縮減，發現水溶性蛋白含量在過低濃度或過高濃度時， 檢測結果均會出現顯色不敏感。其中，20μ L/anL、25y L/anL、30y L/2mL的200 μ g/mL位置以及45μ 72ιΛ、50μ 72ιΛ的1000 μ g/mL位置，均出現程度不等的非線性偏移。30 35 μ L/2mL的反應體系，線性關系最好。因此，本發明提供的檢測方法中，待測液和考馬斯亮藍染液的體積比選擇30 ；35 μ L 2mL。大豆的取樣方法，直接影響檢測結果的準確性和可信度，以及種子繼續向下遺傳從而獲得高世代材料，因此，本發明提供的一種檢測方法中，選用沿與大豆種臍平行的方向，于種臍背側取大豆待測樣品，所述大豆待測樣品與所述大豆的質量比為1 11 1 7，如圖1所示。不從頂端取樣，以避免銼刀損傷到頂端距離很近的胚，影響子葉出土， 見圖2 ；不從底端取樣，是為了避免取樣時，尖嘴鉗固定大豆時容易傷害到胚，影響大豆生理活性，如圖3所示；只有平行于胚，在胚的背面取樣，既能夠滿足低世代大豆水溶性蛋白的檢測，又不影響大豆剩余部分的正常育苗。為了更準備地檢測大豆樣品中水溶性蛋白的含量，本發明對浸提條件進行了研究。本發明提供的檢測方法中，將浸提次數從3次縮減到了 2次，同時每次的浸提時間從 60min縮減到第1次15min、第2次30min，能夠在不影響浸提效果的前提下，將浸提時間從 180min縮減到45min，從而提高了浸提效率。在本發明的一些實施例中，步驟1中所述浸提為，在大豆待測樣品中加水，在18 22°C振蕩15 30min的條件下提取兩次。本發明提供的檢測方法中，水可以為蒸餾水或重蒸水。在本發明的一些實施例中，步驟1中離心為在離心力為3000 3500r/min的條件下離心5 lOmin。在制作標準曲線的過程中，發現在蛋白濃度為低濃度(O 400yg/mL)時，檢測值有偏離線性的趨勢，在高濃度(600 1000 μ g/mL)時，檢測值有偏離線性的趨勢，在中濃度 (400 600 μ g/mL)時，檢測值的線性擬合度較好，因此，本發明提供的檢測方法中，將檢測液的濃度調整為400 600 μ g/mL,能夠更準確地獲得待測液中水溶性蛋白的含量。在本發明的一些實施例中，步驟1中所述待測液的濃度為400 600 μ g/mL。與之相對應的，步驟1中所述標準待測液的濃度分別為Ομ g/mL、200y g/mL、 400 μ g/mL、600 μ g/mL、800 μ g/mL、1000 μ g/mL。在發明的一些實施例中，以g/mL計，在大豆待測樣品中加入質量體積比為2 3 200的蒸餾水，提取兩次后，收集兩次的浸提液，加蒸餾水定容，制得大豆水溶性蛋白待測液；以g/mL計，大豆待測樣品與大豆水溶性蛋白待測液的質量體積比為2 3 1000。在本發明的一些實施例中，步驟1中所述浸提為以g/mL計，在大豆待測樣品中加入質量體積比為2 3 200的蒸餾水，18 22°C振蕩15min后，離心，收集上清為第一浸提液；收集第一次離心沉淀物，以g/mL計，在離心沉淀物中加入質量體積比為2 3 200 的水，18 22°C振蕩30min后，離心，收集上清為第二浸提液；合并第一浸提液和第二浸提液，加水定容，制得大豆水溶性蛋白待測液；以g/mL計，大豆待測樣品與大豆水溶性蛋白待測液的質量體積比為2 3 1000。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的檢測方法步驟1中所述浸提為，取所述大豆待測樣品0. 02 0. 03g置于2mL離心管中，加入2mL蒸餾水，18 22°C振蕩15min 后，3000 3500r/min離心5 lOmin，收集第一次離心后上清為第一浸提液；收集第一次離心沉淀物，再加入2mL蒸餾水，18 22°C振蕩30min后，3000 3500r/min離心5 lOmin，收集第二次離心后上清為第二浸提液；合并第一浸提液和第二浸提液，加水定容至 IOmL,制得所述大豆水溶性蛋白待測液。其中，蛋白標準液的制備方法為準確稱取IOOmg牛血清白蛋白(solarbio索萊寶生物科技有限公司)，溶于IOOmL蒸餾水中，即為1000 μ g/mL的原液。標準曲線的制作方法為取不同濃度蛋白標準液與考馬斯亮藍染液按照體積比為 30 35 2000的比例混合，混勻后在595nm下檢測標準品吸光度值，制得標準曲線。考馬斯亮藍染液的配制方法為稱取IOOmg考馬斯亮藍G-250 (wolsen沃爾森生物技術有限公司)，溶于50mL90%乙醇(市售)中，加入85% (W/V)的磷酸(市售)100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL。每一批次樣品使用同一批考馬斯亮藍染液。本發明提供的檢測方法中，大豆優選為低世代大豆。該檢測方法也同樣適用于高世代大豆中水溶性蛋白的檢測，同時在對豆漿、豆奶中水溶性蛋白檢測的試驗中，與傳統的凱氏定氮法相比，檢測結果無顯著差異。本發明提供一種大豆水溶性蛋白檢測方法。該方法通過改進大豆取樣方式，既滿足低世代大豆中水溶性蛋白的檢測，又不影響剩余部分的正常育苗，使低世代篩選與高世代遺傳分析得以實現。本發明還通過縮小反應體系，改變蛋白樣品與考馬斯亮蘭染料之間的比例，提高了檢測方法的線性擬合度，適用于樣品量較少的樣本檢測。同時通過浸提時間的優化，進一步縮短了檢測時間，提高了檢測效率。本發明提供的檢測方法，具有簡便快捷、 種子破壞性小，適用于低世代大豆中水溶性蛋白的檢測，也同樣適用于高世代大豆及豆漿、 豆奶中水溶性蛋白的檢測。


圖1示大豆頂端取樣方法。圖2示大豆底端取樣方法。圖3示本發明提供的大豆取樣方法。圖4示浸提次數對大豆水溶性蛋白提取率的影響；其中，第1-2柱形示第一次浸提 60min，第3-4柱形示第二次浸提60min，第5_6柱形示第三次浸提60min ；第7-8柱形示第一次浸提30min，第9-10柱形示第二次浸提30min，第11-12柱形示第三次浸提30min ’第13-14柱形示第一次浸提15min，第15-16柱形示第二次浸提15min，第17-18柱形示第三次浸提15min ；第19-20柱形示本發明提供的檢測方法第一次浸提15min，第21-22柱形示本發明提供的檢測方法第二次浸提30min，第23-M柱形示本發明提供的檢測方法第三次浸提15min ；其中，示凱氏定氮法的檢測結果，i示考馬斯亮藍法的檢測結果。圖5示各次浸提對大豆水溶性蛋白提取率的累加影響；其中，第1-2柱形示第一次浸提60min，第3-4柱形示第二次浸提60min后與第一次浸提液混合，第5_6柱形示第三次浸提60min后與前兩次浸提液混合；第7-8柱形示第一次浸提30min，第9_10柱形示第二次浸提30min后與第一次浸提液混合，第11-12柱形示第三次浸提30min后與前兩次浸提液混合；第13-14柱形示第一次浸提15min，第15-16柱形示第二次浸提15min后與第一次浸提液混合，第17-18柱形示第三次浸提15min后與前兩次浸提液混合；第19-20柱形示本發明提供的檢測方法第一次浸提15min，第21-22柱形示本發明提供的檢測方法第二次浸提30min后與第一次浸提液混合，第2314柱形示本發明提供的檢測方法第三次浸提15min 后與前兩次浸提液混合；其中，示凱氏定氮法的檢測結果，i示考馬斯亮藍法的檢測結果。圖6示等比例縮減反應體系120 μ L/6mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0006χ-0. 0173，相關系數為R2 =0.9741。圖7示等比例縮減反應體系100 μ L/5mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程y = 0. 0006χ-0. 0008，相關系數為R2 = 0.9847。圖8示等比例縮減反應體系80 μ L/4mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0006x+0. 0115，相關系數為R2 =0.9871。圖9示等比例縮減反應體系60 μ L/3mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0005x+0. 0313，相關系數為R2 =0.9891。圖10示等比例縮減反應體系40 μ L/2mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0007χ-0. 0139，相關系數為R2 =0.9896。圖11示非等比例縮減反應體系50 μ L/2mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0007X+0. 0436，相關系數為 R2 = 0. 9846。圖12示非等比例縮減反應體系45μ L/2mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0007X+0. 0338，相關系數為 R2 = 0. 9878。圖13示非等比例縮減反應體系40yL/2mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0006X+0. 0341，相關系數為 R2 = 0. 9885。圖14示非等比例縮減反應體系35 μ L/2mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0006X+0. 0209，相關系數為R2 = 0. 9944。圖15示非等比例縮減反應體系30 μ L/2mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程為y = 0. ΟΟΟδχ+Ο. 0169，相關系數為 R2 = 0. 9927。圖16示非等比例縮減反應體系25 μ L/2mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0004X+0. 0251，相關系數為 R2 = 0. 9795。圖17示非等比例縮減反應體系20 μ L/2mL標準曲線示意圖，其中，橫坐標為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0004X+0. 0215，相關系數為 R2 = 0. 9793。
具體實施例方式本發明公開了一種大豆水溶性蛋白檢測方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。各大豆樣品由國家大豆改良中心石家莊分中心提供，各試劑均可由市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發明實施例1取質量為0.020g的大豆，沿與該大豆種臍平行的方向，于種臍背側取樣，取樣量為0. 01 0. 07g/粒。取樣量與萌芽之間的關系檢測結果見表1。表1大豆籽粒取用量與萌芽之間的關系
檢測重量萌芽率萌芽率方差檢測值檢測值方差0.Olg/ 粒100. 00%0. 00%31. 33%1. 37%0. 02g/ 粒100. 00%0. 00%31. 45%0. 99%0.03g/ 粒95. 00%2. 65%31. 48%0. 83%0. 04g/ 粒90. 33%3. 06%31. 46%0. 73%0.05g/ 粒83. 33%4. 04%31. 57%0. 62%0. 06g/ 粒80. 33%4. 16%31. 36%0. 55%0.07g/ 粒65. 33%5. 51%31. 62%0. 51% 早期篩選獲得的種子量較少，必須要盡量保證95 100%的萌芽率，否則對后續的遺傳研究會造成極大的誤差。在取用0. Olg 0. 03g/粒時，籽粒萌芽率能保證95 100%，但取0. Olg時檢測結果方差較大，優選取用量為0. 02g。浸提方法對照組國標法樣品反復浸提3次，每次60min。試驗組浸提對水溶性蛋白浸提率的檢測結果見表2。表2不同浸提處理下，水溶性蛋白的檢測結果
浸提時間浸提次數凱氏定氮法法改良考馬斯亮藍法平均方差平均方差60min第1次26.28%0.41%26.19%0.39%第2次4.05%0.16%3.97%0.26%第3次0.13%0.06%0.13%0.03%2次混合30.32%0.27%30.24%0.37%3次混合30.55%0.14%30.27%0.27%3 Omin第1次25.85%0.13%25.66%0.64%第2次4.13%0.09%4.09%0.18%第3次0.15%0.02%0.14%0.03%2次混合30.21%0.15%30.05%0.56%3次混合30.48%0.40%30.28%0.52%15min第1次24.62%0.26%24.32%0.63%第2次5.00%0.25%4.89%0.24%第3次0.12%0.03%0.16%0.04%2次混合29.15%0.24%29.02%0.30%3次混合29.20%0.95%29.04%0.33%本發明提供的檢測方法第1次15min 第2次3 Omin 第3次60min第1次24.85%0.41%24.64%0.43%第2次5.49%0.28%5.48%0.08%第3次0.12%0.02%0.11%0.01%2次混合30.30%0.45%30.16%0.27%3次混合30.40%0.58%30.18%0.70% 試驗結果(如圖4、5所示)，第1次浸提時，60min浸提蛋白最多，15min浸提蛋白最少；第2次浸提時，15min浸提蛋白最多，60min浸提蛋白最少；第3次浸提過后各浸提時間下浸提效果無顯著差異。經顯著性檢驗，本方法與3次60min浸提效果無顯著差異，可代替。同時第三次浸提對于結果的前后影響沒有顯著差異。故在大批量大豆水溶性蛋白的檢測過程中，其浸提次數可以減為2次，浸提時間可以縮減75 %，提取效率可以提高300 %。
綜合上述試驗結果，在大豆水溶性蛋白的浸提過程中，本方法將浸提次數從3次縮減到了 2次，同時每次的浸提時間從60min縮減到第1次15min、第2次30min，在不影響浸提效果的前提下，將浸提時間從ISOmin縮減到了 45min，效率提高了 300%。在大豆水溶性蛋白的檢測過程中，受儀器以及方法本身的限制，凱氏定氮法的最大效率能達到12個樣品X3重復/天/人。本發明提供的檢測方法顯色快，只要將所得蛋白提取液稀釋到合適濃度，加顯色液后(30s)即可顯色檢測，檢測時間也非常迅速(Imin)， 因此用考馬斯亮藍法的檢測速度能達到48樣品X 9重復/天/人，若只進行水溶性蛋白的初步篩選，此速度還能加倍，最高效率是傳統凱氏定氮法的12倍。反應體系對照組傳統考馬斯亮藍法蛋白-染料反應體系為100 μ L/5mL,反應在IOmL試管中進行。試驗組蛋白-染料反應體系分別為120 μ L/6mL、80 μ L/4mL、60 μ L/3mL、 40 μ L/2mL,反應在IOmL試管中進行。等比例縮減反應體系見表3，結果如圖4至10所示。表3等比例縮減反應體系
權利要求
1.一種大豆水溶性蛋白檢測方法，其特征在于，包括步驟1 沿與大豆種臍平行的方向，于種臍背側按照大豆質量的1/11 1/7取樣，加水浸提后獲得待測液；步驟2 取所述待測液與濃度為0. lmg/mL的考馬斯亮藍染液按照體積比為30 35 2000的比例混合，混勻后在595nm下檢測樣品吸光度值；制作標準曲線，利用比色法得到所述待測液中水溶性蛋白含量。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟1中所述浸提為，在18 22°C振蕩15 30min的條件下提取兩次。
3.如權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，步驟1中離心為在離心力為3000 3500r/min的條件下離心5 lOmin。
4.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟1中所述待測液的濃度為400 600 μ g/mL0
5.如權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，步驟2中制備所述標準曲線的蛋白標準液的濃度分別為 0 μ g/mL、200 μ g/mL、400 μ g/mL、600 μ g/mL、800 μ g/mL、1000 μ g/mL。
6.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述大豆為低世代大豆。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種大豆水溶性蛋白檢測方法。該方法通過改進大豆取樣方式，既滿足早期世代大豆中水溶性蛋白的檢測，又不影響剩余部分的正常育苗，使低世代篩選與高世代遺傳分析得以實現。本發明還通過縮小反應體系，改變蛋白樣品與考馬斯亮蘭染料之間的比例，提高了檢測方法的線性擬合度，適用于樣品量較少的樣本檢測。
文檔編號G01N21/31GK102393362SQ20111023631
公開日2012年3月28日 申請日期2011年8月17日 優先權日2011年8月17日
發明者唐曉東, 張孟臣 申請人:河北省農林科學院糧油作物研究所