專利名稱：基于介質微球的熒光相關譜分析方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明屬于光學計量及超分辨成像領域，具體涉及一種基于介質微球的熒光相關譜分析方法和裝置。
背景技術：
科學技術的發展使得人們極大地擴展了自己的視野。隨著研究的深入，人們對于微觀領域產生了越來越濃厚的興趣。在化學、生物、醫學等諸多領域，為了可以更加準確地掌握研究對象的性質，對單分子的探測與分析成為一種必不可少的研究手段。為了滿足上述要求，相應的儀器設備被大量開發出來，熒光相關譜分析裝置(Fluorescence Correlation Spectroscopy,FCS)正是其中之一。通過動態地記錄收集到的熒光信號的強弱，并進行自(互)相關數字信號處理，FCS可以有效地對活體細胞內的生化反應速率、分子流動速度和分子擴散等信息進行實時測量，從而成為生物化學研究中使用最為廣泛的分析裝置之一。然而，作為一種光學共焦成像系統，FCS的分辨能力也不可避免地受到了光學遠場衍射極限的限制。因此當測試樣品中熒光分子濃度過大時，往往不能有效地進行單分子測量而對最終的測試結果產生干擾。解決這個問題最直接的辦法是對測試樣品進行稀釋，然而，鑒于許多的生化反應必須在高濃度浸潤環境下才可以完成，采用稀釋的辦法得到的測試數據并不可靠，甚至可能由于反應無法進行而造成測試失敗的結果。
發明內容
本發明提供了一種基于介質微球的熒光相關譜分析方法和裝置，使用徑向偏振光和切向偏振光分別作為熒光激發光束和熒光抑制光束，通過介質微球的納米噴射，突破光學遠場衍射極限的限制，提高分辨率，并且有效減小了熒光相關譜分析裝置(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)中的有效激發面積，可以有效應用于高濃度熒光分子樣品中。一種基于介質微球的熒光相關譜分析方法，包括以下步驟(1)使用徑向偏振光作為熒光激發光束，切向偏振光作為熒光抑制光束，將所述的熒光激發光束和熒光抑制光束同軸平行入射到顯微物鏡中，并被所述的顯微物鏡同時聚焦在介質微球上；所述的介質微球位于所述的顯微物鏡的物方焦平面上，所述的介質微球直徑為1 10um，折射率為1. 4 2 ；(2)所述的介質微球對經步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光激發光束和熒光抑制光束進行再次聚焦，在所述的介質微球下表面產生納米噴射(Nanojet)；所述的納米噴射 (Nanojet)包括由經步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光激發光束產生的納米噴射和由經步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光抑制光束產生的納米噴射，其中，由經步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光激發光束產生的納米噴射為實心亮斑，由經步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光抑制光束產生的納米噴射為中空的暗斑；
(3)將步驟(2)所產生的納米噴射作用于熒光樣品并激發熒光信號；換言之，由所述的熒光激發光束產生的納米噴射和熒光抑制光束產生的納米噴射共同作用于熒光樣品并激發熒光信號；(4)收集步驟( 所激發的熒光信號并進行分析處理，得到熒光相關譜。其中，步驟⑴所述的徑向偏振光和切向偏振光，可以是作為工作光束直接入射； 也可以由激光器發出的工作光束轉換而來，所述的轉換可以通過偏振轉換器實現，也可以通過現有技術中其他方法實現。其中，步驟(1)所述的顯微物鏡，優選為大數值孔徑顯微物鏡，可以為非浸沒式或浸沒式，其中非浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為0. 8 0. 95，浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為1. 0 1. 4，放大倍率為80 100倍。其中，步驟(4)中可以通過顯微物鏡來收集步驟(3)所激發的熒光信號，也可以通過現有技術中其他方法實現。當通過顯微物鏡收集所述的熒光信號時，該顯微物鏡可以是與步驟(1)所述的顯微物鏡為同一顯微物鏡，此時收集反射回來的熒光信號，構成“反射模式”；也可以是與步驟(1)所述的顯微物鏡的參數完全相同并在位置上構成共焦關系的顯微物鏡，此時收集透射回來的熒光信號，構成“透射模式”。其中，步驟中對于收集到的熒光信號進行分析處理采用現有技術中通用方式來實現，通常是采用計算機來進行分析處理。本發明還提供了用于實現上述的基于介質微球的熒光相關譜分析方法的裝置，依次包括光源、第一顯微物鏡、介質微球、樣品架和第二顯微物鏡，還包括與第二顯微物鏡連接的熒光信號分析處理裝置；其中，所述的光源，用于產生平行入射的同軸的徑向偏振光和切向偏振光；所述的第一顯微物鏡，用于對所述的徑向偏振光和切向偏振光進行聚焦；所述的介質微球，用于對經第一顯微物鏡聚焦后的徑向偏振光和切向偏振光進行再次聚焦，產生納米噴射；所述的樣品架，用于放置待觀察的熒光樣品，所述的熒光樣品在所述的納米噴射的作用下激發產生熒光信號；所述的第二顯微物鏡，用于收集所述的熒光信號；所述的熒光信號分析處理裝置， 用于分析和處理所收集到的熒光信號；所述的第一顯微物鏡、介質微球、放置在樣品架上的待觀察的熒光樣品和第二顯微物鏡均位于所述的徑向偏振光和切向偏振光的同軸光路上，所述的介質微球位于所述的第一顯微物鏡的物方焦平面上，所述的介質微球直徑為1 10um，折射率為1. 4 2。其中，所述的光源，可以為直接發出徑向偏振光和切向偏振光的光源；也可以為激光光源和偏振轉換器的組合，即，由激光光源發出線偏光并經偏振轉換器轉換得到徑向偏振光和切向偏振光。所述的偏振轉換器可以為現有技術中實現圓柱形偏振光的轉換的任何器件與裝置，優選為瑞典ARCoptix公司的偏振轉換器feidial-Azimuthal Polarization Converter。其中，所述的第一顯微物鏡和第二顯微物鏡，優選為大數值孔徑顯微物鏡，可以為非浸沒式或浸沒式，其中非浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為0. 8 0. 95，浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為1. 0 1. 4，放大倍率為80 100倍。所述的第二顯微物鏡可以與所述的第一顯微物鏡為同一顯微物鏡，此時收集反射回來的熒光信號，構成“反射模式”；所述的第二顯微物鏡也可以與所述的第一顯微物鏡的參數完全相同，并在位置上構成共焦關系，此時收集透射回來的熒光信號，構成“透射模式”。所述的熒光信號分析處理裝置，通常為計算機。本發明的工作原理如下使用徑向偏振光作為熒光激發光束，切向偏振光作為熒光抑制光束，兩光束同軸平行入射到大數值孔徑顯微物鏡中。兩光束通過大數值孔徑顯微物鏡后，在大數值孔徑顯微物鏡的物方焦點附近產生聚焦光場。由于介質微球位于大數值孔徑顯微物鏡的物方焦點上，因此熒光激發光束和熒光抑制光束將通過介質微球的再次聚焦作用，在介質微球下表面產生納米噴射現象，由于兩光束偏振狀態不一致，熒光激發光束產生的納米噴射為實心亮斑，熒光抑制光束產生的納米噴射為中空的暗斑。由于介質微球的場限制效應，兩種納米噴射的尺寸在徑向和軸向上都將小于一般的光學遠場衍射極限。同時，根據STED原理，FCS 系統的有效激發面積將在徑向上被進一步限制，這種限制效應隨著熒光抑制光束光強的增加而不斷加強。有效激發面積的減小使得在同一時刻，只有來自單分子的熒光可能被FCS 系統觀察到，從而使高濃度熒光分子樣品的單分子觀察成為可能，提高了觀察的準確性。位于有效激發面積內的分子將被激發產生熒光信號，進一步通過大數值孔徑顯微物鏡進行收集并分析處理，得到熒光相關譜。相比于現有技術，本發明具有以下有益的技術效果(1)本發明裝置的結構簡單，實現方法和原理容易；(2)打破了光學遠場衍射極限限制，提高了分辨率；(3)觀察準確度高，使用范圍有所擴大，可在不對樣品進行稀釋的前提下對高濃度熒光分子樣品進行單分子觀察；(4)成本低廉。
圖1為本發明的基于介質微球的熒光相關譜分析裝置的第一種實施方式的示意圖。圖2為本發明的基于介質微球的熒光相關譜分析裝置的第二種實施方式的示意圖。圖3為本發明中徑向偏振光的示意圖。圖4為本發明中切向偏振光的示意圖。圖5為本發明中熒光激發光束經由介質微球產生的納米噴射的光強分布示意圖。圖6為本發明中熒光抑制光束經由介質微球產生的納米噴射的光強分布示意圖。圖7為本發明中熒光激發光束經由不同折射率的介質微球產生的納米噴射沿徑向(X方向)的光強分布曲線圖。圖8為本發明中熒光激發光束經由不同折射率的介質微球產生的納米噴射沿軸向(Z方向)的光強分布曲線圖。圖9為本發明中熒光抑制光束經由不同折射率的介質微球產生的納米噴射沿徑向(X方向)的光強分布示意圖。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖來詳細說明本發明，但本發明并不僅限于此。實施例1如圖1所示，一種基于介質微球的熒光相關譜分析裝置，依次包括產生徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的光源、第一顯微物鏡1、介質微球2和樣品架5，樣品架5上放置有熒光樣品3，第一顯微物鏡1還連接有用于分析和處理所收集到的熒光信號的計算機(在圖 1中并未示出)。其中，徑向偏振光Rl和切向偏振光R2同軸且平行入射，第一顯微物鏡1、 介質微球2和熒光樣品3三者均處于徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的同軸光路上，且介質微球2位于第一顯微物鏡1的物方焦平面上。上述裝置中，產生徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的光源，可以為直接發出徑向偏振光和切向偏振光的光源；也可以為激光光源和偏振轉換器的組合，即，由激光光源發出線偏光并經偏振轉換器轉換得到徑向偏振光和切向偏振光。所述的偏振轉換器可以為現有技術中實現圓柱形偏振光的轉換的任何器件與裝置，優選為瑞典ARCoptix公司的偏振轉換器 Radial-Azimuthal Polarization Converter。上述裝置中，第一顯微物鏡1為大數值孔徑顯微物鏡，可以為非浸沒式或浸沒式， 其中非浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為0. 8 0. 95，浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為1. 0 1. 4，放大倍率為80 100倍。上述裝置中，介質微球2的直徑為1 10um，折射率為1. 4 2。采用上述裝置進行熒光相關譜分析方法如下使用徑向偏振光Rl作為熒光激發光束，切向偏振光R2作為熒光抑制光束，兩光束 Rl和R2同軸平行入射到第一顯微物鏡1中。圖3和圖4分別為徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的示意圖，可見，徑向偏振光Rl 每點的偏振方向都是沿著徑向方向，所有的偏振方向構成一個發散束；而切向偏振光R2每點的偏振方向都是沿著切線方向，所有點的偏振方向構成一個渦旋。兩光束Rl和R2通過第一顯微物鏡1后，在第一顯微物鏡1的物方焦點附近產生聚焦光場。由于介質微球2位于第一顯微物鏡1的物方焦點上，因此，兩光束Rl和R2被同時聚焦在介質微球2上；介質微球2對聚焦后的兩光束Rl和R2再次聚焦，在介質微球2下表面產生納米噴射現象，詳細說明如下對于任意形式的入射光，經過介質微球2的光場分布都可以使用時域有限元差分 (Finite Difference Time Domain, FDTD)算法對其進行精確仿真模擬。對于熒光激發光束來說，由于它的偏振態為徑向偏振光R1，計算結果表明它的納米噴射現象呈現為一個實心亮斑，如圖5所示。在徑向(X方向)和軸向(Z方向)兩個方向上，光斑的尺寸都小于光學遠場衍射極限。進一步的計算表明，它的大小與介質微球2的折射率相關——當介質微球2的折射率處于1. 4 2區間時，隨著介質微球2折射率的增加， 納米噴射在徑向(X方向)和軸向(Z方向)兩個方向上都被進一步壓縮。圖7和圖8清晰地描述了這種變化趨勢。如圖7所示為熒光激發光束經由不同折射率的介質微球2 (直徑為3um)產生的納米噴射沿徑向(X方向)的光強分布曲線圖；圖8為熒光激發光束經由不同折射率的介質微球2 (直徑為3um)產生的納米噴射沿軸向(Z方向)的光強分布曲線圖。
對于熒光抑制光束來說，由于它的偏振態為切向偏振光R2，FDTD算法計算結果表明它的納米噴射現象呈現為一個空心的暗斑，如圖6所示。暗斑的大小也與介質微球2的折射率相關，但與熒光激發光束不同，當介質微球2的折射率處于1. 4 2區間時，暗斑的大小并沒有呈現一直縮小的趨勢，它的徑向(X方向)尺寸在折射率等于1.8時達到極小值， 如圖9所示。圖9為熒光抑制光束經由不同折射率的介質微球2 (直徑為3um)產生的納米噴射沿徑向(X方向)的光強分布示意圖。熒光激發光束的主要作用是對熒光樣品3中的熒光分子進行激發。事實上由于在上述裝置中由熒光激發光束產生的納米噴射大小已經小于光學遠場衍射極限，僅僅使用熒光激發光束便可以得到比傳統FCS更好的分辨率。盡管如此，此時的FCS有效激發區域在徑向(X方向)和軸向(Z方向)上的大小仍達到百納米量級，對于高濃度熒光分子樣品來說進行單分子分析仍然不夠，因此有必要對FCS有效激發面積進行進一步壓縮。熒光抑制光束的主要作用是抑制照射區域的熒光激發現象，壓制熒光信號的產生。由于熒光抑制光束通過介質微球2產生的納米噴射為中空的暗斑，其與熒光激發光束產生的納米噴射同時作用在熒光樣品3上時，光斑中心點處的熒光激發不受影響但其周圍區域的熒光激發將被壓制，從而使熒光信號僅僅來自于光斑中心點，達到壓縮FCS有效激發面積的目的。抑制作用隨著熒光抑制光束光強的增加而增強，可以用公式表述為d = H{a-s[g)其中d為FCS有效激發面積的徑向(X方向)尺寸，a為拋物線擬合系數，ζ為熒光抑制光束通過介質微球2產生納米噴射的最大光強Isted與熒光激發光束過介質微球2產生納米噴射的最大光強Is的比值，即ζ = Isted/Is通過上述公式可以計算FCS有效激發面積的徑向(X方向)尺寸，如當介質微球2 的大小為3um、折射率為1.8時，徑向尺寸d約等于50nm。FCS有效激發面積的軸向(Z方向)尺寸1與熒光激發光束通過介質微球2產生納米噴射的軸向(Z方向)尺寸相等如當介質微球2的大小為3um、折射率為1. 8時，軸向尺寸1約等于lOOnm。通過兩種納米噴射的共同作用對熒光樣品3進行觀察并激發熒光信號，熒光信號通過反射再次經過第一顯微物鏡1，由第一顯微物鏡1收集并接入與第一顯微物鏡1連接的計算機進行分析處理，這一過程被稱為“反射模式”。實施例2如圖2所示，一種基于介質微球的熒光相關譜分析裝置，依次包括產生徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的光源、第一顯微物鏡1、介質微球2、樣品架5和第二顯微物鏡4，樣品架5上放置有熒光樣品3，第二顯微物鏡4還連接有用于分析和處理所收集到的熒光信號的計算機(在圖2中并未示出)。其中，徑向偏振光Rl和切向偏振光R2同軸且平行入射， 第一顯微物鏡1、介質微球2、熒光樣品3和第二顯微物鏡4均處于徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的同軸光路上，且介質微球2位于第一顯微物鏡1的物方焦平面上。可見，與實施例1的裝置相比，本實施例只是增加了一個第二顯微物鏡4，第二顯微物鏡4與第一顯微物鏡1參數完全相同。第二顯微鏡4的作用是收集由熒光樣品3產生的熒光信號。因此，與實施例1的方法相比，僅僅是在收集熒光信號的步驟有所不同。本實施例中，熒光信號將不再通過反射再次進入第一顯微物鏡1，而是直接透過熒光樣品3被第二顯微物鏡4收集，并接入第二顯微物鏡4連接的計算機進行分析處理，這一過程被稱為 “透射模式”。為了達到最佳收集效果，第二顯微物鏡4與第一顯微物鏡1在位置上構成共焦關系。與實施例1中的“反射模式”相比，本實施例中的“透射模式”增加了一個顯微物鏡，因此提高了系統成本；并且，“透射模式”僅僅適用于熒光樣品3為透明樣品的情況，而 “反射模式”則無此限制。本發明方法和裝置在不做任何改動的情況下，也可以適用于單分子雙光子熒光相關譜分析的應用。
權利要求
1.一種基于介質微球的熒光相關譜分析方法，其特征在于，包括以下步驟(1)使用徑向偏振光作為熒光激發光束，切向偏振光作為熒光抑制光束，將所述的熒光激發光束和熒光抑制光束同軸平行入射到顯微物鏡中，并被所述的顯微物鏡同時聚焦在介質微球上；所述的介質微球位于所述的顯微物鏡的物方焦平面上，所述的介質微球直徑為 1 10um，折射率為1. 4 2 ；(2)所述的介質微球對經步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光激發光束和熒光抑制光束進行再次聚焦，在所述的介質微球下表面產生納米噴射；(3)將步驟(2)所產生的納米噴射作用于熒光樣品并激發熒光信號；(4)收集步驟C3)所激發的熒光信號并進行分析處理，得到熒光相關譜。
2.如權利要求1所述的基于介質微球的熒光相關譜分析方法，其特征在于，步驟(1)所述的顯微物鏡為非浸沒式大數值孔徑顯微物鏡或浸沒式大數值孔徑顯微物鏡，所述的非浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為0. 8 0. 95，所述的浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為1. O 1. 4，放大倍率為80 100倍。
3.如權利要求1所述的基于介質微球的熒光相關譜分析方法，其特征在于，步驟(4) 中，通過顯微物鏡來收集步驟C3)所激發的熒光信號。
4.用于實現如權利要求1 3任一所述的基于介質微球的熒光相關譜分析方法的裝置，其特征在于，依次包括光源、第一顯微物鏡、介質微球、樣品架和第二顯微物鏡，還包括與第二顯微物鏡連接的熒光信號分析處理裝置；其中，所述的光源，用于產生平行入射的同軸的徑向偏振光和切向偏振光；所述的第一顯微物鏡，用于對所述的徑向偏振光和切向偏振光進行聚焦；所述的介質微球，用于對經第一顯微物鏡聚焦后的徑向偏振光和切向偏振光進行再次聚焦，產生納米噴射；所述的樣品架， 用于放置待觀察的熒光樣品，所述的熒光樣品在所述的納米噴射的作用下激發產生熒光信號；所述的第二顯微物鏡，用于收集所述的熒光信號；所述的熒光信號分析處理裝置，用于分析和處理所收集到的熒光信號；所述的第一顯微物鏡、介質微球、放置在樣品架上的待觀察的熒光樣品和第二顯微物鏡均位于所述的徑向偏振光和切向偏振光的同軸光路上，所述的介質微球位于所述的第一顯微物鏡的物方焦平面上，所述的介質微球直徑為1 lOum，折射率為1. 4 2。
5.如權利要求4所述的裝置，其特征在于，所述的第一顯微物鏡為非浸沒式大數值孔徑顯微物鏡或浸沒式大數值孔徑顯微物鏡，所述的非浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為0. 8 0. 95，所述的浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為1. O 1. 4，放大倍率為 80 100倍。
6.如權利要求4所述的裝置，其特征在于，所述的第二顯微物鏡為非浸沒式大數值孔徑顯微物鏡或浸沒式大數值孔徑顯微物鏡，所述的非浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為0. 8 0. 95，所述的浸沒式大數值孔徑顯微物鏡的數值孔徑為1. O 1. 4，放大倍率為 80 100倍。
7.如權利要求4所述的裝置，其特征在于，所述的第二顯微物鏡與第一顯微物鏡為同一顯微物鏡。
8.如權利要求4所述的裝置，其特征在于，所述的第二顯微物鏡與第一顯微物鏡的參數完全相同，并在位置上構成共焦關系。
全文摘要
本發明公開了一種基于介質微球的熒光相關譜分析方法和裝置，該方法使用徑向偏振光和切向偏振光分別作為熒光激發光束和熒光抑制光束，依次通過顯微物鏡的聚焦和介質微球的納米噴射后，再作用于熒光樣品并激發熒光信號，通過對熒光信號的收集和分析處理完成熒光相關譜分析。該裝置依次包括產生徑向偏振光和切向偏振光的光源、第一顯微物鏡、介質微球、放置有熒光樣品的樣品架和第二顯微物鏡，還包括與第二顯微物鏡連接的熒光信號分析處理裝置。第一顯微物鏡、介質微球、熒光樣品和第二顯微物鏡均處于徑向偏振光和切向偏振光的同軸光路上，且介質微球位于第一顯微物鏡的物方焦平面上。本發明可以有效應用于高濃度熒光分子樣品中。
文檔編號G01N21/64GK102305782SQ20111022843
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月10日 優先權日2011年8月10日
發明者劉旭, 匡翠方, 王婷婷, 郝翔 申請人:浙江大學