專利名稱：一種同時測定血液及組織中三種抗結核藥物含量的方法
一種同時測定血液及組織中三種抗結核藥物含量的方法所屬領域本發明是屬于一種同時測定中三種抗結核藥物(異煙胼，利福平，吡嗪酰胺)含量的方法，具體地說是一種涉及高壓液相色譜法同時測定血液及組織中三種抗結核藥物含量的方法。
背景技術：
異煙胼(Isoniazid)，利福平(Rifampicin)，吡嗪酰胺(Pyrazinamide)仍是當今廣泛使用的一線抗結核藥物，異煙胼具有神經毒性，利福平具有肝毒性因此對抗結核藥物進行濃度監測具有十分重要的臨床意義。這三種藥物的理化性質截然相反，異煙胼和吡嗪酰胺為強極性物質，且水溶性大，而利福平為弱極性物質，脂溶性大，因此要在一個色譜條件下將三種藥物完全分離開有一定的困難。已有的監測方法主要采用磷酸鹽緩沖液作為流動相，采用不同的色譜柱(C8柱和C18柱)在不同的色譜條件下分別檢測這三種藥物的含量，或將其中的部分藥物預先進行衍生化再進樣監測。此類方法工藝較為繁瑣復雜，對實驗室條件要求較高，需要多次重復檢測，出檢測報告的時間也較長，對樣本量的要求亦較大，增加了臨床檢測的難度。
發明內容
本發明的目的就是提供一種操作簡便，精確度高，檢測速度快，穩定可靠，能夠同時測定三種抗結核藥物含量的方法。發明的檢測方法包括如下步驟(1)樣品處理血液樣本采用(4000轉/分鐘)離心15分鐘后取血漿，組織樣本加入生理鹽水采用均質器搗碎后(4000轉/分鐘)離心，加入提取液進行提取。(2)色譜條件流動相為0. 02mol/L,庚烷磺酸鈉溶液(稀磷酸調pH至3. 0)-乙腈-甲醇，流動相使用前過濾后超聲15分鐘，脫氣。(3)樣品分析采用日本島津公司高效液相色譜儀(LC2010C)，AT-130柱溫控箱，Lc-solution型色譜工作站。色譜柱為分析柱shim-pack HRC-C84. 6謹，5 μ m)，保護柱EclipseXDB-C18(125mmX4. 6mm)，柱溫 25C°。(4)建立標準曲線將空白血漿加入標準品溶液后稀釋成含INH、RPF、PZA分別為0. 1,0. 2,0. 4、1、2、4、8、16 μ g/ml的標準血漿，以三種藥物的峰面積為X軸、三種藥物的濃度為Y軸作線性分析。得三種藥物的回歸方程Y^hw= 2370. 46X+1282. 66
Ynwgtis= 86447. 8X+5195. 94Yfl鮮=3007. 2X+3714. 58將樣本進樣后的色譜圖藥物峰面積帶入到以上公式中，即可計算出藥物濃度。本發明的優點為1.廣泛適用性本色譜法不僅可以用于血液，還可以用于人體其他體液和組織等生物制劑樣本內三種抗結核藥物含量的檢測，乳唾液，尿液，腦脊液，精液等。只要能夠在液體狀態能夠中分離出來的組織均可以進行檢測，可為臨床血藥濃度的檢測，藥代動力學的研究，用藥方案的調整等提供可靠的檢測手段。因此廣泛適用性是本色譜檢測方法具有深遠的前景。2.樣本處理的簡便性本色譜方法對樣本的處理及其簡單，無需進行預先的衍生化。血液制劑直接離心后取血清用提取液進行提取，組織樣本采用勻質器搗碎后離心，取上清液用提取液進行提取。方法簡單，處理時間短，便利易行。3.檢測過程快速本色譜方法采用梯度洗脫的方法對樣本進行檢測，能夠一次進樣同時檢測樣本中三種藥物的濃度，耗時短，保留時間小于三十分鐘，即一次進樣三十分鐘內就可得出檢測結果。同時因為一次進樣即可檢測出三種藥物含量，相比多次進樣分別檢測三種藥物對檢測樣本的消耗也大大降低。4.檢測結果精確而穩定本色譜方法精密度穩定(吡嗪酰胺8.4%，異煙胼10. 1%，利福平9.5% .)，回收率高(吡嗪酰胺83. 7%，異煙胼86. 2%，利福平88. 1% .)實施例11. 1檢測樣品是血液1. 2色譜條件色譜柱為分析柱shim-pack HRC-C8 (250mmX 4. 6mm, 5 μ m)，保護柱 EclipseXDB-C18(125mmX4. 6mm)，柱溫25C° ；流動相為0. 02mol/L，庚烷磺酸鈉溶液(稀磷酸調pH至 3.0)-乙腈-甲醇(78 5 17)6min, (20 5 75) 16min，(78 5 17)27min.流速為0. 8ml/min，測試波長吡嗪酰胺268nm，異煙胼264nm，利福平2Mnm.保留時間分別吡嗪酰胺:5. 62min，異煙胼:10. Olmin，利福平24. 89min.1. 3色譜分析結果色譜分離情況良好，三種藥物與血液中內源性雜志互不干擾。圖1為空白血漿進樣后的譜圖，圖2為空白血漿添加三種藥物后進樣的色譜圖，圖3為血液樣本進樣后的色譜圖，圖5-7為空白血漿添加不同濃度的三種藥物后，其濃度和峰面積的線性關系。1. 4計算藥物含量根據圖5-7作線性分析后得，按照藥物峰面積和濃度關系得出三藥的回歸方程Y 異煙肼=2370. 4X+1282. 66Ynwgtis= 86447. 8X+5195. 94Yfl鮮=3007. 2X+3714. 58將圖3血液樣本進樣后的色譜圖的藥物峰面積，異煙胼6426. 56m2，利福平16976. 33m2，吡嗪酰胺2060924. 62m2帶入到上述方程當中，即可計算出三種藥物的含量，異煙胼2. 17 μ g/ml，利福平4. 41 μ g/ml，吡嗪酰胺23. 78 μ g/ml。
2. 1檢測樣品是骨骼2. 2色譜條件色譜柱為分析柱shim-pack HRC-C8 (250mmX4. 6mm, 5 μ m)，保護柱 Ecl ipseXDB-C18(125mmX4. 6mm)，柱溫25C° ；流動相為0. 02mol/L，庚烷磺酸鈉溶液(稀磷酸調pH至 3.0)-乙腈-甲醇(78 5 17)6min, (20 5 75) 16min，(78 5 17)27min.流速為0. 8ml/min，測試波長吡嗪酰胺268nm，異煙胼264nm，利福平2Mnm.保留時間分別吡嗪酰胺:5. 62min，異煙胼:10. Olmin，利福平24. 89min.2. 3色譜分析結果色譜分離情況良好，三種藥物與血液中內源性雜志互不干擾。圖1為空白血漿進樣后的譜圖，圖2為空白血漿添加三種藥物后進樣的色譜圖，圖4為骨骼樣本進樣后的色譜圖，圖5-7為空白血漿添加不同濃度的三種藥物后，其濃度和峰面積的線性關系。1.4計算藥物含量根據圖5-7作線性分析后得，按照藥物峰面積和濃度關系得出三藥的回歸方程Y 異煙肼=2370. 4X+1282. 66Ynwgtis= 86447. 8X+5195. 94Yfl鮮=3007. 2X+3714. 58將圖3血液樣本進樣后的色譜圖的藥物峰面積，異煙胼3321.沈!112，利福平12473. 36m2，吡嗪酰胺559326. 34m2帶入到上述方程當中，即可計算出三種藥物的含量，異煙胼0. 86 μ g/ml，利福平2. 42 μ g/ml，吡嗪酰胺6. 41 μ g/ml
圖1是空白血漿進樣后的譜2是空白血漿添加三種藥物后進樣的色譜3是血液樣本進樣后的色譜4是骨骼樣本進樣后的色譜5是異煙胼藥物濃度與峰面積線性關系6是吡嗪酰胺藥物濃度與峰面積線性關系7是利福平藥物濃度與峰面積線性關系圖。
權利要求
1.一種高壓液相色譜法同時測定血液及組織中三種抗結核(異煙胼，利福平，吡嗪酰胺)藥物含量的方法，其特征在于包括如下步驟(1)樣品處理血液樣本采用(4000轉/分鐘)離心15分鐘后取血漿，組織樣本加入生理鹽水采用均質器搗碎后(4000轉/分鐘)離心，加入提取液進行提取。(2)色譜條件流動相為0. 02mol/L,庚烷磺酸鈉溶液(稀磷酸調pH至3. 0)-乙腈-甲醇，流動相使用前過濾后超聲15分鐘，脫氣。(3)樣品分析采用日本島津公司高效液相色譜儀(LC2010C)，AT-130柱溫控箱，Lc-solution型色譜工作站。色譜柱為分析柱shim-pack HRC-C8 Q50mmX4. 6mm，5 μ m)，保護柱EclipseXDB-C18(125mmX4. 6mm)，柱溫 25°C。(4)建立標準曲線將空白血漿加入標準品溶液后稀釋成含INH、RPF、PZA分別為0. 1,0. 2,0. 4、1、2、4、8、16 μ g/ml的標準血漿，以三種藥物的峰面積為X軸、三種藥物的濃度為Y軸作線性分析。得三種藥物的回歸方程Y異煙肼=2370. 4X+1282. 66Y 酸胺=86447. 8X+5195. 94Y 利福平=3007. 2X+3714. 58將樣本進樣后的色譜圖藥物峰面積帶入到以上公式中，即可計算出藥物濃度。
2.根據權利要求1所述高壓液相色譜法同時測定血液及組織中三種抗結核藥物含量的方法，其特征在于提取液采用(二氯甲烷異丙醇=1 1)配置，進行提取。
3.根據權利要求1所述高壓液相色譜法同時測定血液及組織中三種抗結核藥物含量的方法，其特征在于流動相的比例為(78 5 17)6min, (20 5 75) 16min,(78 5 17)27min，采用梯度洗脫的方法，流速為0.8ml/min。
4.根據權利要求1所述高壓液相色譜法同時測定血液及組織中三種抗結核藥物含量的方法，其特征在于測試波長PZA :268nm, INH :264nm，RFP :254nm0流速為1. 5毫升/分鐘，進樣體積為20微升進行色譜分析。
全文摘要
本專利提供了一種同時測定血液及組織中三種抗結核(異煙肼，利福平，吡嗪酰胺)藥物含量的方法，該方法具有操作簡便，精確度高，檢測速度快，穩定可靠的特點。采用日本島津公司高效液相色譜儀(LC2010C)，AT-130柱溫控箱，Lc-solution型色譜工作站。色譜柱為分析柱采用C8柱，保護住采用C18柱，流動相采用庚烷磺酸鈉溶液進項配制。
文檔編號G01N30/02GK102384949SQ20111022821
公開日2012年3月21日 申請日期2011年8月2日 優先權日2011年8月2日
發明者劉鵬 申請人:劉鵬, 江建明, 蔣暉