專利名稱：一種鑒定蛋白質中半胱氨酸數量的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種鑒定蛋白質中半胱氨酸數量的方法及其應用，特別是涉及一種快速鑒定小麥高分子量谷蛋白亞基中半胱氨酸數量的方法及其在小麥品質改良中的應用。
背景技術：
小麥是世界上最重要的三大糧食作物之一，其產量僅次于玉米排名第二，我國的小麥種植面積、總產量和消費量居世界首位。小麥種子營養豐富，富含淀粉、蛋白質、脂肪、 礦物質、鈣、鐵、硫胺素、核黃素、煙酸及維生素A等，非常符合人體生理需要，對人體健康十分有益。世界上約有35%的人口以小麥為主食，小麥蛋白是人類重要的植物蛋白質來源，約占谷物蛋白質的38. 4% ；而且小麥面粉可以制作面包、饅頭、餅干、蛋糕、面條、油條、 油餅、火燒、燒餅、煎餅、水餃、煎餃、包子、餛飩、蛋卷、方便面、年糕、意式面食等食物；發酵后可制成啤酒、酒精、伏特加等。小麥這種特殊的和面加工特性主要是由小麥種子貯藏蛋白的結構和特性決定的(Wrigley，Giant proteins with flour power. Nature, 1996, 381:738-739)。小麥貯藏蛋白是指醇溶蛋白(gliadins)和麥谷蛋白(glutenins)，這兩類蛋白的含量較大，約占種子蛋白的85%，其中，麥谷蛋白主要決定面團的彈性，而醇溶蛋白則決定面團的延展性(Payne, Geneticsof wheat storage proteins and the effect of allelic variation on bread making quality. Ann. Rev. Plant Physiol.，198738 141-153)ο自然界中，大多數蛋白質都含有半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基之間可以形成二硫鍵，而二硫鍵對蛋白質的三級和四級結構的穩定性是非常重要的(Thornton， Disulphidebridges in globular proteins. J. Mol. Biol.，1981，151 :261-287 ；Wetzel, Harnessingdisulfide-bonds using protein engineering.Trends Biochem. Sci.， 1987,12 :478-482) 0 二硫鍵可以使蛋白質免受損壞并且可以增加蛋白質的半衰期，因此二硫鍵可以維持蛋白的穩定性(Hogg，Disulfide bonds as switches for protein function. Trends Biochem. Sci.，2003，28 :210-214)。由于二硫鍵對谷蛋白的結構和功能有著非常重要的作用，作物科學研究工作者對二硫鍵非常關注。小麥高低分子量谷蛋白亞基就是通過二硫鍵而形成谷蛋白聚合體的(Masci S，D’ Ovidio R，Lafiandra D， Kasarda DD, Characterization of alow-molecular-weight glutenin subunit gene from bread wheat and the correspondingprotein that represents a major subunit of the glutenin polymer. Plant Physiol.，1998，118 :1147-1158)，而聚合體的大小對面粉品質的影響是巨大的(Masci S, Rovelli L, KasardaDD, Vensel WH, Lafiandra D, Characterisation and chromosomal localization of C~type1ow-molecular~weight glutenin subunits in the bread wheat cultivar Chinese Spring. Theor. Appl. Genet., 2002，104 :422-428)。公認的優質亞基1Dx5就是由于多了一個額外的半胱氨酸殘基導致聚合體變大從而大大提高了面粉的品質。因此，半胱氨酸殘基數目對小麥的品質有著非常重要的影響。檢測半胱氨酸殘基數目對發現優質亞基及小麥的品質改良都具有十分重要的作用，但目前國內外還缺乏快速、高效鑒定小麥高分子量谷蛋白亞基半胱氨酸數量的方法。
發明內容
近年來，隨著生物質譜技術的發展，不同質譜技術已成為鑒定小麥谷蛋白亞基的一種強大工具(Zhang Y, Li X，Yan Y, Xiong X，An X，Zhang Q, Pei Y, Gao L, HsamSLK, Zeller FJ,Molecular characterization of two novel x—type HMW glutenin genesfrom Aegilops tauschii and implications for the evolution of Glu-Dl-I alleles. Genetics,2008,178 :23-33 ；Qian Zhang, Yanmin Dong, Xueli An, Aili Wang, Yanzhen Zhang, Xiaohui Li, Xianchun Xia, Zhonghu He, Yueming Yan Characterization of HMWglutenin subunits in common wheat and related species by matrix-assisted laserdesorption/ionisation time—of—flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS). Journal ofCereal Science,2008,47 :252-261 ；Li Liu, Aili Wang, Rudi Appels, Junhong Ma, Xianchun Xia, Ping Lan, Zhonghu He, Frank Bekes, Yueming Yan, Wujun Ma, AMALDI-TOF based analysis of high molecular weight glutenin subunits for wheatbreeding. Journal ofCereal Science, 2009, 50 J95-301)。和以往的傳統方法相比， 質譜更精確、更靈敏快速。本發明的目的在于建立一種穩定、快速的質譜方法，從而可以對待測蛋白中的半胱氨酸殘基的數目，特別是對小麥高分子量谷蛋白亞基中的半胱氨酸殘基的數目進行鑒定的方法。通過該方法，可以快速、準確的鑒定小麥高分子量谷蛋白亞基和等位基因的組成， 并且能夠確定每個高分子量谷蛋白亞基中含有的半胱氨酸殘基的數目。上述待測蛋白來自小麥或羽扇豆。本發明方法的原理4-乙稀吡啶可以結合半胱氨酸從而阻止半胱氨酸形成二硫鍵，因此，一個4-乙稀吡啶可以和一個半胱氨酸結合。在提取谷蛋白亞基時，一組樣品加入 4-乙稀吡啶，另一組樣品不加4-乙稀吡啶，然后進行質譜鑒定。谷蛋白亞基增加的分子量和該亞基所含有的半胱氨酸數目相關，即高分子量谷蛋白亞基每含有一個半胱氨酸殘基， 其分子量會相應的增加大約105. 14Da(即一個4-乙稀吡啶的分子量)。因此，首先要通過質譜獲得同一種蛋白在兩種處理(用4-乙稀吡啶處理和未用 4-乙稀吡啶處理)下的分子量分別是多少，然后用4-乙稀吡啶處理過的分子量減去未用 4-乙稀吡啶處理的分子量，最后再除以105，得到的結果就是該待測蛋白中所含有的半胱氨酸殘基的數目。所述待測蛋白來自小麥時，本發明方法包括樣品制備、質譜鑒定及數據處理分析與半胱氨酸數目確定，具體包括以下步驟(1)樣品制備取小麥Bumper的面粉15mg兩份，分別放入1. 5ml離心管中；加入體積百分含量為70%的乙醇1ml，渦旋30min，12000rpm離心lOmin，去上清。再分別加入體積百分含量為
的異丙醇lml，65°C水浴30min，12000g離心lOmin，去上清。然后用濾紙吸干殘余上清， 上述步驟重復3次。再加入0.1ml含DTT的溶液A (DTT和溶液A質量百分比為1 100)， 其中溶液A的組成為，異丙醇IM Tris-HCl(pH8)雙蒸水=50 8 42(體積比)；渦旋混勻，65°C水浴30min。
然后，12000g離心lOmin，第一份樣品取上清，用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；第二份樣品加入0. Iml含4-乙烯基吡啶的溶液A(4-乙烯基吡啶和溶液A的體積百分比為1. 4 98. 6)，渦旋混勻，65°C水浴30min ；12000rpm離心IOmin ；取上清用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；過夜沉淀后兩份樣品都12000rpm離心lOmin，棄上清，加入0. Iml含DTT的溶液A (DTT和溶液A質量百分比為1 100)，65°C水浴30min ；第一份樣品取上清用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；第二份樣品再加入0. Iml含4-乙烯基吡啶的溶液A(4-乙烯基吡啶和溶液A的體積百分比為1. 4 98. 6)，渦旋混勻，65°C水浴 30min ；12000rpm離心IOmin ；取上清用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；過夜沉淀后兩份樣品都12000rpm離心lOmin，棄上清，干燥沉淀lOmin，加入70 μ 1色譜級乙腈溶液 (其中含有終濃度為0. 的TFA)，溶解4小時以上，將得到的上清液采用混合上樣法進行質譜分析。⑵質譜鑒定采用4 1化(^丨0巧計_8公司生產的質譜儀器4800，質譜參數為激光強度2，500， 質量范圍65-95kDa，加速電壓25kV，板極電壓92%，尺度0. 3%，延遲時間1，OOOns0對獲得的蛋白質質量譜利用軟件進行數據處理分析。半胱氨酸殘基數目的計算利用樣品制備中4-乙稀吡啶處理和未處理的蛋白質分子量的變化，計算高分子量谷蛋白亞基中半胱氨酸殘基的數目。本發明方法的應用價值(1)不僅可以得到蛋白中含有的半胱氨酸殘基數目，而且可以得到該蛋白的分子量，從而用來鑒定等位基因組成和小麥品種以及實現雜交早期世代優質亞基的快速篩選與選擇，大大提高小麥品質改良的效率。(2)可以對普通小麥及其近緣種的高分子量谷蛋白亞基進行半胱氨酸殘基數目的檢測，從而對進一步研究二硫鍵的功能提供幫助。(3)可以用來大規模的檢測小麥及其近緣種中谷蛋白亞基中半胱氨酸殘基的數目，從而快速篩選新的谷蛋白候選優質亞基，本發明方法比基因鑒定更快速、更準確。本發明正是利用了質譜的精確性，從而發明了一種利用質譜技術鑒定小麥高分子量谷蛋白亞基中半胱氨酸數量的方法，可應用于小麥品質改良和高分子量谷蛋白亞基中半胱氨酸數量的快速檢測，從而發掘和篩選優質亞基，提高品質改良的效率。此外，本發明方法還可以對羽扇豆中鹽溶蛋白和水溶蛋白中所含有的半胱氨酸殘基數目進行鑒定，進而形成半胱氨酸殘基數目鑒定的一套完整的技術體系。
圖1為普通小麥品種Bumper中高分子量谷蛋白亞基用4_乙稀吡啶處理和未處理的質譜比較圖譜；圖2為普通小麥品種aian229中高分子量谷蛋白亞基用4_乙稀吡啶處理和未處理的質譜比較圖譜；圖3為羽扇豆用4-乙稀吡啶處理和未處理的鹽溶蛋白中的半胱氨酸殘基數目鑒定圖譜；圖4為羽扇豆用4-乙稀吡啶處理和未處理的水溶蛋白中的半胱氨酸殘基數目鑒定圖譜。
具體實施例方式本發明中涉及的實驗材料如下普通小麥品種Ajana，Banks, Bullaring, Bumper, Calingiri, Chara, EGA Blanco, Endure, IGW2944, IGW3240, Pugsley, M12, M25, M26, Shan 229, Wanmai 33，Halberd、羽扇豆(王軻，普通小麥及其近緣種谷蛋白編碼基因的分子克隆與系統進化研究，首都師范大學博士學位論文，2011)，上述生物材料由首都師范大學遺傳與生物工程實驗室繁育和保存。實施例1、小麥高分子量谷蛋白亞基中半胱氨酸殘基數量的鑒定1、小麥高分子量谷蛋白亞基的提取與樣品制備取小麥Bumper的面粉15mg兩份，分別放入1. 5ml離心管中；加入體積百分含量為70%的乙醇1ml，渦旋30min，12000rpm離心lOmin，去上清。再分別加入體積百分含量為
的異丙醇lml，65°C水浴30min，12000g離心lOmin，去上清。然后用濾紙吸干殘余上清， 上述步驟重復3次。再加入0.1ml含DTT的溶液A(DTT和溶液A的質量百分比為1 100)， 其中溶液A的組成為，異丙醇IM Tris-HCl(pH8)雙蒸水=50 8 42(體積比)；渦旋混勻，65 °C水浴30min。然后，12000g離心lOmin，第一份樣品取上清，用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；第二份樣品加入0. Iml含4-乙烯基吡啶的溶液A(4-乙烯基吡啶和溶液A的體積百分比為1. 4 98. 6)，渦旋混勻，65°C水浴30min ；12000rpm離心IOmin ；取上清用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；過夜沉淀后兩份樣品都12000rpm離心lOmin，棄上清，加入0. Iml含DTT的溶液A (DTT和溶液A質量百分比為1 100)，65°C水浴30min ；第一份樣品取上清用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；第二份樣品再加入0. Iml含4-乙烯基吡啶的溶液A(4-乙烯基吡啶和溶液A的體積百分比為1. 4 98. 6)，渦旋混勻，65°C水浴 30min ；12000rpm離心IOmin ；取上清用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；過夜沉淀后兩份樣品都12000rpm離心lOmin，棄上清，干燥沉淀lOmin，加入70 μ 1色譜級乙腈溶液 (其中含有終濃度為0. 的TFA)，溶解4小時以上，將得到的上清液采用混合上樣法進行質譜分析。質譜結果如圖1所示。其中，圖IA為普通小麥品種Bumper中高分子量谷蛋白亞基用4-乙稀吡啶處理的質譜，圖IB為普通小麥品種Bumper中高分子量谷蛋白亞基未用 4-乙稀吡啶處理的質譜。2、谷蛋白亞基中半胱氨酸殘基數量的鑒定(1)儀器設備采用AppliedBiosystems公司生產的質譜儀器4800。(2)質譜參數激光強度2，500，質量范圍65_951^￡1，加速電壓251^，板極電壓 92%，尺度0. 3%，延遲時間1，000ns。(3)數據處理與半胱氨酸殘基數量確定利用軟件進行數據處理分析。半胱氨酸殘基數目的計算從圖1中可以看出，小麥Bumper中1Dx5亞基加入4-乙稀吡啶后分子量增加了 517. 67Da ；而其它的用4-乙稀吡啶處理的χ-型和y-型HMW-GS比未用4-乙稀吡啶處理的分子量分別增加大約400Da和700Da，這些結果說明，1Dx5亞基含有5個半胱氨酸殘基，其它的χ-型和I—型HMW-GS中的半胱氨酸殘基的數目分別為4和7個。這些結果與已知的結果一致，說明了該方法的可靠性。實施例2、利用17個已知亞基組成的小麥品種對本發明方法進行驗證1、小麥高分子量谷蛋白亞基的提取與樣品制備 |χ Ajana, Banks, Bullaring, Bumper, Calingiri, Chara, EGA Blanco, Endure, IGW2944, IGW3240, Pugsley, M12, M25, M26, Shan229, Wanmai33, Halberd 等 17 個不同品種的小麥種子，取樣及樣品制備和質譜鑒定等同實施例1。小麥品種》^11229的質譜結果如圖2所示。其中，圖2A為普通小麥品種aian229 中高分子量谷蛋白亞基用4-乙稀吡啶處理的質譜，圖2B為普通小麥品種aian229中高分子量谷蛋白亞基未用4-乙稀吡啶處理的質譜。17個不同小麥品種的質譜結果如表1和表2所示。表117個已知高分子量谷蛋白亞基組成的小麥品種中Glu-Al和Glu-Bl位點編碼
的高分子量谷蛋白中半胱氨酸殘基數目檢測結果
權利要求
1.一種鑒定待測蛋白中半胱氨酸殘基數量的方法，是利用生物質譜方法根據用4-乙稀吡啶處理和未用4-乙稀吡啶處理的待測蛋白分子量的變化，確定待測蛋白中半胱氨酸殘基的數量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述待測蛋白來自小麥或羽扇豆。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述待測蛋白來自小麥，所述待測蛋白的提取方法包括如下步驟取15mg小麥面粉兩份，兩份都加入Iml體積百分含量為70%的乙醇，渦旋，離心，去上清；再分別加入體積百分含量為陽％的異丙醇lml，65°C水浴30min，去上清；再加入0. Iml 含DTT的溶液A，DTT和溶液A質量百分比為1 100，其中溶液A的組成為，異丙醇pH8的 IM Tris-HCl 雙蒸水的體積比為50:8:42 ；渦旋混勻，65°C水浴30min，然后，12000g離心 IOmin,第一份樣品取上清，用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；第二份樣品加入0. Iml 含4-乙烯基吡啶的溶液A，4-乙烯基吡啶和溶液A的體積百分比為1.4 :98. 6，渦旋混勻， 65°C水浴30min ；離心；取上清用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；過夜沉淀后兩份樣品都離心，棄上清，加入0. Iml含DTT的溶液A，DTT和溶液A質量百分比為1 :100，65°C水浴30min ；第一份樣品取上清用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；第二份樣品再加入 0. Iml含4-乙烯基吡啶的溶液A，4-乙烯基吡啶和溶液A的體積百分比為1. 4 :98. 6，渦旋混勻，65°C水浴30min ；離心；取上清用40%體積百分含量的丙酮室溫沉淀過夜；過夜沉淀后兩份樣品都離心，棄上清，干燥沉淀，加入70μ1色譜級乙腈溶液，其中含有終濃度為0. 1% 的TFA，溶解4小時以上，將得到的上清液采用混合上樣法進行質譜分析。
4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述生物質譜方法的測定條件為 采用AppliedBiosystems 4800質譜儀，質譜參數為激光強度2，500，質量范圍65-95 kDa, 加速電壓25 kV，板極電壓92%，尺度0.3%，延遲時間1,000 ns。
5.權利要求1-4任一所述方法在半胱氨酸殘基數目鑒定中的應用。
6.權利要求1-4任一所述方法在小麥品種鑒定和品質改良中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種鑒定蛋白質中半胱氨酸數量的方法，特別是公開了一種鑒定小麥高分子量谷蛋白亞基中半胱氨酸數量的方法。通過該方法可以快速、準確的鑒定小麥高分子量谷蛋白亞基和等位基因的組成，并且能夠確定每個高分子量谷蛋白亞基中含有的半胱氨酸殘基的數目。本發明方法可應用于小麥品質改良和高分子量谷蛋白亞基中半胱氨酸殘基數量的快速檢測，從而發掘和篩選優質亞基，提高品質改良的效率。此外，本發明方法還可以對羽扇豆中鹽溶蛋白和水溶蛋白中所含有的半胱氨酸殘基數目進行鑒定，進而形成半胱氨酸殘基數目鑒定的一套完整的技術體系。
文檔編號G01N27/62GK102313773SQ20111021643
公開日2012年1月11日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年7月29日
發明者晏月明, 李小輝, 王軻, 馬武軍 申請人:首都師范大學