一種綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法

專利名稱：一種綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法
技術領域：
本發明涉及一種微芯片修飾方法，尤其涉及一種綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法。
背景技術：
自20世紀90年代Manz等人首次提出微全分析系統(μ -TAS)的概念以來，經過 20多年的發展，微全分析系統已由最初單一的芯片電泳，發展到面向所有生化領域的芯片實驗室，在藥物篩選與分析、環境監測、材料合成與分析、基因組學、蛋白質組學、臨床診斷等領域得到了廣泛應用。目前，芯片毛細管電泳的研究主要集中在以下幾個方面(1)低成本、多功能芯片的構建；(2)聚合物材質芯片的表面修飾；(3)各種檢測技術與芯片的耦聯；(4)多維多通道、高通量芯片毛細管電泳的開發。微流控芯片的制作材料主要有硅、石英、玻璃和多種高分子聚合物材料等。其中， 高分子聚合物聚二甲基硅氧烷(PDMS)由于其易于制作、可批量生產、光透性好、易與PDMS 及其它材料封合、無毒、低成本、固化溫度低等諸多優點，在多功能芯片構建中得到了廣泛的應用與發展。然而，PDMS芯片表面的強疏水性，不僅使水溶液很難充滿管道，電滲流不易控制，而且非極性疏水物質的強烈吸附還易導致芯片污染，影響了 PDMS在微流控分析中的進一步應用。因此，PDMS芯片表面修飾成為微全分析研究的熱點之一。傳統的PDMS芯片表面修飾方法主要有動態修飾和化學鍵合等。雖然動態修飾可簡單、快速地降低分析物在PDMS表面的吸附，但是動態修飾劑在電泳過程中有一定的流失，穩定性不好。化學共價修飾雖然穩定，然而通常過程繁瑣，耗時長，常常需要使用有機溶劑和有毒試劑。因此，探索簡單、綠色的PDMS表面修飾方法具有非常重要的意義。DA是生物體內的一種重要神經遞質，也是一種綠色仿生材料，在堿性條件下可以自聚合生成PDA而粘附在各種無機和有機材料表面。PDA具有良好的親水性和生物相容性， 其表面含有的氨基和鄰苯二酚等多功能基團還可作為二級反應平臺，通過邁克爾加成或席夫堿反應進一步組裝含氨基或巰基等基團的生物活性物質，應用前景十分廣闊，因此受到了研究者們越來越廣泛的關注。然而，在酸性和中性條件下，DA的自聚合過程非常緩慢或者幾乎不能進行。而本發明在中性條件下，利用HAuCl4的氧化性誘導DA的聚合，使DA發生氧化生成PDA，與此同時，HAuCl4被還原為Au NPs，生成的Au Ws原位負載于PDA膜的內部和表面。在HAuCl4誘導DA聚合的過程中，利用PDA極強的粘附性，將該原位生成的PDA/Au NPs復合材料牢固地固定于PDMS微芯片通道的表面，獲得了連續均一、親水性強和穩定性好的修飾層，整個反應和修飾過程中無需額外添加任何如有機溶劑、偶聯劑等其它化學試劑，操作簡單且快速有效，很好地體現了簡單、綠色、原位的PDMS芯片微通道修飾理念。

發明內容
本發明的目的在于提供了一種綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法，以提高微芯片通道表面的親水性、降低分析物在通道表面的非特異性吸附、獲得穩定的降低的電滲流，改善微芯片對分析物的分離效果，同時，為進一步在微通道內修飾含有氨基和巰基等基團的生物活性物質提供便利的普適性反應平臺。測試結果表明，經PDA/Au M^s復合材料修飾的PDMS芯片微通道親水性強、穩定性好，成功實現了五種氨基酸的有效分離。本發明是這樣來實現的，步驟如下將一定濃度的DA和HAuCl4在磷酸鹽緩沖溶液 (PBS)中超聲混勻，利用真空泵將其注入聚二甲基硅氧烷微芯片分離通道內，連續抽取5分鐘使混合溶液布滿整個分離通道，室溫放置使反應完全，在此過程中，HAuCl4誘導DA聚合生成PDA，而HAuCl4則被還原為Au NPs,生成的Au NPs原位負載于PDA的內部和表面，與此同時，利用PDA極強的粘附性，將原位生成的PDA/Au NPs復合材料牢固地固定于PDMS微芯片通道表面，再用緩沖溶液連續沖洗微通道5分鐘，洗脫掉通道內的殘留物，即獲得親水性強和穩定性好的PDA/Au NPs復合材料修飾的聚二甲基硅氧烷微芯片通道。所述的DA和HAuCl4的摩爾濃度比為7. 5:1。所述的PBS緩沖溶液濃度為0. 10 M，pH為7. 17。所用的超聲波功率為60 W 90 W。所述的使DA和HAuCl4混合溶液布滿整個分離通道，需連續真空抽取5分鐘。所述的室溫放置反應時間為30分鐘。所述Au NPs平均粒徑為40 nm。該PDA/Au NPs復合材料修飾層可作為二級反應平臺，通過PDA和Au NPs進一步與分子內含有氨基和巰基等基團的生物活性物質發生反應。本發明的技術效果是本發明利用DA與HAuCl4之間的氧化還原反應，在PDMS芯片微通道表面原位生成PDA/Au NPs復合材料，提高PDMS微芯片通道表面的親水性、降低分析物在通道表面的非特異性吸附、獲得穩定的降低的電滲流、改善微芯片對分析物的分離效果，同時，還為進一步在微通道內修飾含有氨基和巰基等基團的生物活性物質提供便利的普適性反應平臺。與現有技術相比，本發明操作過程簡單，所需時間短，無需使用有機溶劑和有毒試劑，具有綠色環保、成本低廉、操作簡單、高效等優點，可用于功能化PDMS微流控芯片的大批量生產。本發明所制得的產品不僅可用于對氨基酸的分離及檢測，還在醫藥分析、臨床診斷、環境監測和食品分析等領域有良好的應用前景。


圖1是本發明涉及的PDMS微流控芯片結構示意圖。1、樣品池2、緩沖溶液池3、 樣品廢液池。圖2是(A)PDA和(B)PDA/Au NPs復合材料修飾的PDMS芯片的掃描電子顯微鏡表征。圖3是PDA/Au Ws復合材料形成過程的不同時段的紫外光譜動態分析，內插圖是波長為350 nm-800 nm的紫外光譜放大圖。圖4是PDA/Au NPs復合材料的XRD表征。圖 5 是(a)裸芯片，(b) PDA, (c) PDA + Au NPs 和(d) PDA/Au NPs 復合材料修飾 PDMS芯片的接觸角表征。圖6是(a)裸芯片和(b)PDA/Au NPs復合材料修飾PDMS芯片在不同pH的運行緩沖溶液中的電滲流變化情況。
圖 7 是(a)裸芯片，(b) PDA, (c) PDA + Au NPs 和(d) PDA/Au NPs 復合材料修飾 PDMS芯片上五種氨基酸的分離檢測電泳圖譜。運行緩沖溶液5 mM (pH 9.23) STB ；分離電壓+1200 V ；進樣電壓+600 V ；進樣時間3 s ；檢測電極銅圓盤電極；檢測電位0. 6 V (vs. Ag/AgCl)。圖8是不同檢測電位對五種氨基酸電泳分離檢測影響的考察。圖9是不同分離電壓對五種氨基酸電泳分離檢測影響的考察。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步闡述，本發明并不限于此。實施例1
PDMS微流控通道表面原位修飾PDA/Au NPs復合材料的過程和表征。(1)制作 PDMS 芯片
以GaAs陽模為模板，制作典型的十字型PDMS微流控芯片通道(圖1)。具體制作過程如下取一定量的PDMS單體和固化劑按10:1的質量比混合均勻、除氣，傾注于GaAs模板上， 70 ？ C固化2 h。冷卻后從模板上剝下含十字型通道的PDMS芯片，用刀片切割成所需形狀， 用打孔器在緩沖溶液池2、樣品池1和樣品廢液池3三處打孔，形成直徑為3 mm的孔。同時，以平滑玻璃板為模板，按照同樣的步驟制備不含微通道的PDMS蓋片。將含十字通道的 PDMS芯片和不含通道的PDMS蓋片分別用二次水、甲醇、二次水超聲清洗10分鐘，在紅外燈下烘干，隨即將兩片PDMS封合，形成一塊可逆的PDMS芯片。PDMS分離管道長42 mm (有效分離長度37 mm)，進樣管道長10 mm。所制得的PDMS分離管道呈梯形，上底寬50 μ m，下底寬 65 μ m,深 18 μ m。(2 ) PDA/Au NPs復合材料在PDMS微通道表面的原位修飾過程 (A)單純PDMS微流控芯片的制作過程見上文。(B)PDA/Au NPs復合材料在PDMS微流控通道表面的原位修飾將摩爾濃度比為 7. 5:1的DA和HAuCl4在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中超聲混勻，用真空泵將其注入到聚二甲基硅氧烷芯片分離通道內，連續抽取5分鐘使混合溶液布滿整個分離通道，室溫放置使反應完全。在此過程中，DA發生氧化反應生成PDA，HAuCl4發生還原反應生成Au NPs0在HAuCl4 誘導DA聚合的過程中，利用生成的PDA極強的粘附性，將原位生成的PDA/Au NPs復合材料牢固地固定于PDMS微芯片通道表面，微通道隨后用緩沖溶液連續沖洗5分鐘將殘留物洗脫掉，即獲得連續均一、親水性強和穩定性好的PDA/Au Ws復合材料修飾的聚二甲基硅氧烷微芯片通道。(3 ) PDA/Au NPs 修飾 PDMS 芯片的表征
PDA和PDA/Au NPs復合材料修飾PDMS芯片的掃描電鏡結果如圖2所示。由圖2可見， PDA修飾的PDMS芯片表面光滑；當把DA與HAuCl4均勻混合后，在PDMS表面生成了大量的分布均勻的粒徑為40 nm的Au NPs，且沒有明顯的聚集發生。這是由于PDA所含有的氨基和亞氨基基團與Au Ws之間強烈的相互作用，促進了 Au Ws在PDA膜內部和表面的組裝， 使得Au NPs在PDA膜修飾PDMS芯片通道表面得到高密度的負載。圖3為PDA/Au NPs形成過程中紫外光譜動態分析表征。DA和HAuCl4溶液的顏色分別是無色和亮黃色，當將兩者以摩爾濃度比為7.5:1的比例混合后，混合液的顏色在2 s內迅速變為酒紅色，說明DA和HAuCl4 一經混合即開始發生反應生成PDA和Au NPs ；繼續反應30分鐘后，溶液顏色由酒紅色逐漸變為黑色，說明DA和HAuCl4的反應生成了 PDA/Au NPs復合材料。然而，將DA溶液在空氣中放置幾個小時后顏色幾乎沒有變化，說明在沒有HAuCl4作為氧化劑的條件下，DA 在PH為7. 17時，其自聚合速度非常慢或者幾乎不能進行，不同時段監測的紫外光譜動態分析也充分論證了上述反應過程。圖3中，曲線a為DA溶液的紫外光譜圖，在波長為觀2 nm 處出現了 DA的特征吸收；當DA與HAuCl4以摩爾濃度比為7. 5:1的比例混合反應后，每隔 3分鐘記錄一次紫外吸收曲線，結果如圖;3B (b-i)所示。由圖可見，隨著DA和HAuCl4反應時間的延長，DA的吸收峰(282 nm)逐漸降低，與此同時，在305 nm和474 nm處新出現的 PDA的特征吸收以及680 nm處新出現的Au NPs的特征吸收峰逐漸增強，進一步表明本發明在中性條件下通過將DA與HAuCl4混合，即可在PDMS芯片微通道內原位生成PDA/Au NPs 復合材料。圖4為所制得的PDA/Au NPs復合材料的XRD衍射圖，由圖可見，PDA/Au NPs復合材料在2 θ角為38. 4°，44. 4°，64. 8°，77. 8°和81. 9°處出現了分別對應于Au NPs的 (111)、( 200 )、( 220 )、( 311)和(222 )晶面的衍射峰，表明本發明所合成的Au NPs是立方面
心的單晶結構。PDMS芯片表面經本發明描述的方法處理，可獲得親水性PDA/Au NPs復合材料修飾層，使芯片的接觸角從裸PDMS芯片的111° (圖fe)降低到PDA/Au Ws復合材料修飾后的13° (圖5d)。可見，經PDA/Au NPs復合材料修飾的PDMS芯片表面的親水性得到了顯
著改善。PDMS芯片表面經本發明描述的方法處理，還可獲得穩定的降低的電滲流。由圖6 可見，在PH為9. 23時，電滲流由未經修飾時的5. 33X10 4 cm2 VrpiSm降低到經PDA/Au NPs 復合材料修飾后的4. 17X IO 4 cm2 V 1 s 1，且修飾后的PDMS芯片的電滲流的穩定性也得到了極大提高，說明通過本發明的修飾技術，獲得了穩定的降低的電滲流。實施例2
PDA/Au NPs復合材料修飾PDMS微流控芯片的應用。(1)微流控芯片的一個重要應用是進行分析物的分離，圖7是(a)裸PDMS，(b)PDA， (c)PDA + Au NPs, (d)PDA/Au NPs復合材料修飾PDMS芯片對(1)精氨酸，(2)脯氨酸，(3) 組氨酸，(4)纈氨酸，(5)蘇氨酸等五種氨基酸混合液的電泳分離圖譜。由圖7a可見，在裸芯片上五種氨基酸根本無法達到基線分離，且峰電流低，非特異性吸附極為嚴重；當在微通道表面修飾上PDA (圖7b)或PDA + Au NPs (圖7c)后，非特異性吸附有所改善，但是五種氨基酸仍然無法達到良好的基線分離；在本發明提供的原位生成PDA/Au Ws復合材料修飾的PDMS芯片上，五種氨基酸的分離效果得到顯著改善，不僅峰電流大大提高，而且分離度和分離效率得到了極大的改善，同時分析物的非特異性吸附也得到了有效抑制，五種氨基酸在短短的60 s內即獲得了良好的分離和檢測。測試結果表明，本發明提供的綠色、原位的PDA/Au NPs復合材料表面修飾PDMS芯片微通道的方法在電泳分離中有良好的實際應用價值。(2)檢測電位和分離電壓對電泳分離的影響
圖8考察了檢測電位(0.5 V-0. 8 V)對電泳分離檢測的影響。我們發現隨著檢測電位的增大氨基酸的峰電流逐漸增大，但當檢測電位大于0. 6 V時，脯氨酸和組氨酸基線不能達到較好的分離，并且基線噪音增大，綜合考慮，本發明選擇0.6 V作為檢測電位。圖9考察了不同分離電壓(1100 V-1500 V)對電泳分離檢測的影響。隨著分離電壓的增大，氨基酸的峰電流逐漸增大，出峰時間逐漸縮短，并且峰形變得尖銳而且對稱，但當電壓超過1200 V時，脯氨酸和組氨酸不能很好的達到基線分離，并且噪音也增大，綜合考慮，本發明選擇1200 V作為分離電壓。實施例3
以PDA/Au NPs為二級反應平臺的手性PDMS微芯片系統的構建。在PDA/Au NPs修飾PDMS微芯片通道表面，PDA和Au NPs可以分別通過邁克爾加成反應(或席夫堿反應)和Au-NH2鍵作用，進而將蛋白質修飾在芯片通道表面。具體實例為 將2 mg mL—1的牛血清蛋白(BSA)注入到上述經表面修飾PDA/Au NPs復合材料的PDMS芯片通道內，冰箱中反應12小時，反應后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗通道，將未反應的殘留物清洗掉，獲得PDA/Au NPs/BSA修飾的PDMS微通道，構建了具有手性選擇作用的PDMS微芯片裝置。以手性分子D，L-色氨酸為例，對該修飾芯片的性能進行了評價，D，L-色氨酸在PDA/ Au NPs/BSA修飾的PDMS微芯片上獲得了良好的分離。該PDA/Au NPs/BSA/PDMS微芯片系統的構建，大大拓寬了本發明的應用范圍，進一步說明本發明應用前景廣闊。
權利要求
1.一種綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法，其特征在于步驟如下將一定濃度的DA和HAuCl4在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中超聲混勻，利用真空泵將其注入聚二甲基硅氧烷微芯片分離通道內，連續抽取5分鐘使混合溶液布滿整個分離通道，室溫放置使反應完全，在此過程中，HAuCl4誘導DA聚合生成PDA，而HAuCl4則被還原為Au NPs，生成的Au NPs原位負載于PDA的內部和表面，與此同時，利用PDA極強的粘附性，將原位生成的PDA/ Au NPs復合材料牢固地固定于PDMS微芯片通道表面，再用緩沖溶液連續沖洗微通道5分鐘，洗脫掉通道內的殘留物，即獲得親水性強和穩定性好的PDA/Au NPs復合材料修飾的聚二甲基硅氧烷微芯片通道。
2.根據權利要求1所述的綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法，其特征在于所述的DA和HAuCl4的摩爾濃度比為7. 5:1。
3.根據權利要求1所述的綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法，其特征在于所述的PBS緩沖溶液濃度為0. 10 M，pH為7. 17。
4.根據權利要求1所述的綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法，其特征在于所用的超聲波功率為60 W 90 W。
5.根據權利要求1所述的綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法，其特征在于所述的使DA和HAuCl4混合溶液布滿整個分離通道，需連續真空抽取5分鐘。
6.根據權利要求1所述的綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法，其特征在于所述的室溫放置反應時間為30分鐘。
7.根據權利要求1所述的綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法，其特征在于 Au NPs平均粒徑為40 nm。
8.根據權利要求1所述的綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法，其特征在于該 PDA/Au NI3s復合材料修飾層可作為二級反應平臺，通過PDA和Au Ws進一步與分子內含有氨基和巰基等基團的生物活性物質發生反應。
全文摘要
一種綠色原位的聚二甲基硅氧烷微芯片修飾方法，步驟如下將原位生成的PDA/AuNPs復合材料牢固地固定于PDMS微芯片通道表面，再用緩沖溶液連續沖洗微通道5分鐘，洗脫掉通道內的殘留物，即獲得親水性強和穩定性好的PDA/AuNPs復合材料修飾的聚二甲基硅氧烷微芯片通道。本發明的技術效果是可用于功能化PDMS微流控芯片的大批量生產。本發明所制得的產品不僅可用于對氨基酸的分離及檢測，還在醫藥分析、臨床診斷、環境監測和食品分析等領域有良好的應用前景。
文檔編號G01N27/447GK102435658SQ20111021630
公開日2012年5月2日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年7月29日
發明者劉春鳴, 孟祥英, 梁汝萍, 邱建丁 申請人:南昌大學