專利名稱：一種食品防腐劑-乳酸鏈球菌素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，獲取的食品天然防腐劑一乳酸鏈球菌素酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，尤其適用于乳制品及飲料與肉制品中的乳酸鏈球菌素含量的測(cè)定。
背景技術(shù)：
乳酸鏈球菌素(Nisin)是從乳酸乳球菌或乳酸鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物中提制的一種多肽抗菌素類物質(zhì)，是一種世界公認(rèn)的安全的天然生物性食品防腐劑和抗菌劑。我國(guó)于1990年開(kāi)始批準(zhǔn)使用Nisin，到目前為止，全世界約有50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛使用Nisin。Nisin是由34個(gè)氨基酸組成的多肽，其分子量為3510，屬于羊毛硫抗生素 (Lantibiotics),活性部位含有大量的稀有氨基酸，包括羊毛硫氨酸、β _甲基羊毛硫氨酸、脫氫丙氨酸、甲基脫氫丙氨酸等一些非編碼的氨基酸。Nisin的活性分子常以二聚體和四聚體的形式存在，其分子量為7000和14000。乳酸鏈球菌素能有效殺死或抑制引起食品腐敗變質(zhì)的革蘭氏陽(yáng)性菌，特別是細(xì)菌孢子如葡萄球菌、鏈球菌、乳桿菌、小球菌、明串珠菌、芽孢桿菌等，對(duì)乳酸鏈球菌素很敏感。乳酸鏈球菌素定量分析的最初測(cè)定的方法為1934年Cox GA等人建議采用的甲基藍(lán)還原法，后來(lái)相繼開(kāi)發(fā)了用于Nisin定量的生物分析方法，包括試管稀釋法、 濁度分析法、瓊脂擴(kuò)散法、ATP生物發(fā)光測(cè)定法、綠光熒光蛋白測(cè)定法和微量滴定法等。 1990年!^alahee發(fā)展了多克隆抗血清分析乳酸鏈球菌素的酶聯(lián)免疫分析法。1996年 Suacrez, Rodriguez設(shè)計(jì)了多克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附法。Bouksaim報(bào)道多克隆抗體的酶聯(lián)免疫分析法。目前，我國(guó)關(guān)于乳酸鏈球菌素的測(cè)定有兩種方法，其一是瓊脂擴(kuò)散法，該方法是依據(jù)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB 2394-2007((食品添加劑乳酸鏈球菌素》，采用瓊脂擴(kuò)散法的原理在瓊脂表面利用檢測(cè)菌的生長(zhǎng)顯示抑菌效果，由抑菌圈直徑及標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)換算出效價(jià)，確定其含量，由于該方法具有靈敏度低、無(wú)法精確定量、易受干擾因素的影響、易于污染環(huán)境等缺點(diǎn)，不易于各檢測(cè)機(jī)構(gòu)推廣使用。其二是液相色譜法，經(jīng)查2010年建立了液相色譜檢測(cè)方法并申請(qǐng)了專利，該方法由于所需儀器及耗材均較昂貴，檢出限低，且耗時(shí)長(zhǎng)，不易大范圍推廣。本次文獻(xiàn)檢索披露的內(nèi)容有《天然防腐劑一乳酸鏈球菌素》)(中國(guó)食品與營(yíng)養(yǎng)，2008年第4期) 和《乳酸鏈球菌素檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展》(中國(guó)食品添加劑，2008年第5期)。本發(fā)明所建立的食品中乳酸鏈球菌素酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)方法，既定性也能夠定量，是目前國(guó)際公認(rèn)的用于測(cè)定食品中添加劑含量的方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、快速簡(jiǎn)便、無(wú)污染、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，適宜普遍推廣和應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供乳酸鏈球菌素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法及試劑盒為食品安全保駕護(hù)航，所建立的簡(jiǎn)單、敏感、直接的免疫學(xué)方法有重要的實(shí)踐意義。
本發(fā)明目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種食品防腐劑-乳酸鏈球菌素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，用乳酸鏈球菌素作為抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫得到多克隆抗體，以乳酸鏈球菌素半抗原與卵清蛋白ο V A的偶聯(lián)物作為包被抗原，以乳酸鏈球菌素為標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建免疫檢測(cè)及對(duì)樣品的處置方法，即獲取該方法的載體試劑盒；
1)檢測(cè)方法的構(gòu)建
包被抗原的制備用PH值為9. 6的0. 01-0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原 1000倍，加入酶標(biāo)板，每孔100μ1，37 孵育池，傾去包被液，用含有0. 05°/%疊氮化鈉、0. 1% 明膠和0. 05%吐溫的磷酸鹽緩沖液，即0. 02Μ、PH 7. 4，洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150 μ 1封閉液，即0. 1%0疊氮化鈉和10%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，37°C 溫育池，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存；
多克隆抗體的制備將1.0mg/ml的乳酸鏈球菌素溶液與等量的弗氏佐劑混合均勻， 對(duì)首次免疫的兔子實(shí)施頸背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0. 2ml ；第二次免疫，將1. Omg/ml乳酸鏈球菌素溶液與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻，對(duì)兔子實(shí)施頸背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn) 0. 2ml ；每次注射間隔2周，采血檢測(cè)抗血清效價(jià)，直到抗體效價(jià)大于1 :3000為止；
競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)用0. 1%牛血清白蛋白的0. 03-0. 06mol/L的磷酸鹽緩沖液，對(duì)乳酸鏈球菌素的標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)施梯度稀釋，其梯度為0. 1,0. 5,2. 5、12. 5,62. 5Pg/ml，每孔加50μ1 ；將制備的多克隆抗體以2. 5%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液按1 :1000比例稀釋后加入，每孔加入50μ1， 37°C溫育30min，然后用PBST洗滌3_5次；
加酶標(biāo)二抗將0. 5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體以1 :5000稀釋后加入，每孔加入100Pl，37°C，30min后，用PBST洗滌3-5次;
顯色每孔加入顯色液100μ1，37 顯色15min ；最后每孔加入終止液2 M硫酸溶液 50 μ L ；用酶標(biāo)儀450nm測(cè)吸光值A(chǔ)45tl，與所作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比算出待測(cè)樣品的乳酸鏈球菌素的含量；
上述乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)置于sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體購(gòu)置于 Jackson ImmnoResearch LABORATORIES, INC ；
2)對(duì)檢測(cè)樣品的處置
乳飲料將0. 1%牛血清白蛋白的0. 03-0. 06mol/L磷酸鹽緩沖液，即為復(fù)溶工作液，對(duì)樣品處置，即稀釋10倍；
肉制品將樣品制成粉末狀，取Ig樣品置于50ml離心管里，加入5ml的復(fù)溶工作液，充分震蕩混勻，后靜置lOmin，提取上清Ι-aiil，用于分析。所述的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，該方法的檢測(cè)試劑盒包括
1)包被原的酶標(biāo)板1塊，其包被原為乳酸鏈球菌素與載體蛋白偶聯(lián)物；
2)酶標(biāo)二抗工作液1瓶，其工作液用0.5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液稀釋5000倍的酶標(biāo)二抗獲取，7ml/瓶；
3)抗體工作液1瓶，其工作液用2.5%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍的抗體獲取， 8ml/ 瓶；
4)乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，共6瓶，濃度分別為Omg/L，0. Img/L,0. 5mg/L, 2. 5mg/L, 12. 5mg/L，62. 5mg/L ；
5)底物顯色液2瓶，由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲，7ml/瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺，7ml/瓶；
6)終止液1瓶，含l-2mol/L硫酸，7ml/瓶；
7)濃縮洗滌液1瓶，含0.05%吐溫、0. 1%明膠、0. 05%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液0. 02M、 pH 7. 4，40ml/瓶；
8)復(fù)溶工作液1瓶，50ml/瓶。本發(fā)明方法的檢測(cè)原理在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被乳酸鏈菌素與載體蛋白的偶聯(lián)物，加入樣品溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入乳酸鏈球菌素抗體溶液，樣品中的乳酸鏈球菌素或標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的乳酸鏈球菌素偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)乳酸鏈球菌素抗體，加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用顯色液顯色，樣品吸光值與樣品中乳酸鏈球菌素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣品中乳酸鏈球菌素的含量，同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺， 與系列濃度乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中乳酸鏈球菌素含量的濃度范圍。本發(fā)明構(gòu)建并實(shí)現(xiàn)的定量檢測(cè)食品中乳酸鏈球菌素的快速檢測(cè)方法一酶聯(lián)免疫法及市場(chǎng)銷售的試劑盒，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)的空白，為行業(yè)的食品檢測(cè)提供了快速精準(zhǔn)的檢測(cè)新產(chǎn)品，彰顯技術(shù)進(jìn)步。
本發(fā)明對(duì)照說(shuō)明書(shū)附圖作進(jìn)一步說(shuō)明。附圖1為乳酸鏈球菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖所示X軸為濃度的半對(duì)數(shù)值，Y軸為百分吸光度值。附圖2為技術(shù)路線實(shí)施示意如圖所示本技術(shù)路線以乳酸鏈球菌素為免疫原制得了高效價(jià)的抗乳酸鏈球菌素的多克隆抗體，以乳酸鏈球菌素與卵清蛋白的偶聯(lián)物作為包被原建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法，用此方法檢測(cè)乳制品及肉制品中的乳酸鏈球菌素。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明對(duì)照實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明方法的實(shí)施步驟 1)檢測(cè)方法的構(gòu)建
包被抗原的制備用PH值為9. 6的0. 03mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原1000倍， 加入酶標(biāo)板，每孔100μ1，37 孵育池，傾去包被液，用含有0. 05%0疊氮化鈉、0. 1%明膠和 0. 05%吐溫的磷酸鹽緩沖液，即0. 02Μ、pH 7. 4，洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150 μ 1封閉液，即0. 1%。疊氮化鈉和10% (質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，37°C溫育池，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存；
乳酸鏈球菌素多克隆抗體的制備取1.0mg/ml的乳酸鏈球菌素溶液與等量的弗氏佐劑(自配，液體石蠟與羊毛脂混合液，組分比為2 :1，加10mg/ml卡介苗)混勻，首次免疫時(shí)每只兔子2. 0ml，頸背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0. anl，第二次免疫時(shí)取乳酸鏈球菌素溶液與等量的弗氏不完全佐劑(自配，液體石蠟與羊毛脂混合液，組分比為2 10)混勻，每只兔子 2. 0ml，頸背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0. anl。每次注射間隔2周，免疫期間采血，檢測(cè)抗血清效價(jià)，連續(xù)加強(qiáng)免，直到獲得滿意的抗體效價(jià)(大于1 :3000)為止。最后一次無(wú)佐劑用1. Omg 抗原直接腹腔注射。競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)用0. 1%牛血清白蛋白的0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液，對(duì)乳酸鏈球菌素的標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)施梯度稀釋，其梯度為0. 1,0. 5,2. 5、12. 5,62. 5Pg/ml，每孔加50μ1 ；將制備的多克隆抗體以2. 5%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液按1 :1000比例稀釋后加入，每孔加入50μ1， 37°C溫育30min，然后用PBST洗滌4次；
加酶標(biāo)二抗將0. 5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體以1 :5000稀釋后加入，每孔加入100μ1，37 ，30π η后，用PBST洗滌5次；
顯色每孔加入顯色液100μ1，37 顯色15min ；最后每孔加入終止液2 M硫酸溶液 50 μ L ；用酶標(biāo)儀450nm測(cè)吸光值A(chǔ)45tl，與所作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比算出待測(cè)樣品的乳酸鏈球菌素的含量；
其中選用的乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)置于sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體購(gòu)置于 Jackson ImmnoResearch LABORATORIES, INC。2)檢測(cè)樣品的處理
乳飲料用復(fù)溶工作液將樣品稀釋10倍，其中含0. 1%牛血清白蛋白的0. 06mol/L的磷酸鹽緩沖液即為復(fù)溶工作液；
肉制品將樣品剁碎成粉末狀，取Ig樣品至50ml離心管里，加入5ml的復(fù)溶工作液，充分震蕩混勻后靜置lOmin，小心的提取上清2ml用于分析，注意不要吸到表層的油脂和底層的沉淀。3)酶聯(lián)免疫試劑盒的制備；以乳酸鏈球菌素與卵清蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括
<1>包被原的酶標(biāo)板1塊，其包被原為乳酸鏈球菌素與載體蛋白偶聯(lián)物； <2>乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液共6瓶，濃度分別為0 mg /L (mg/kg),0. 1 mg /L (mg/ kg), 0.5 mg /L (mg/kg), 2. 5 mg /L (mg/kg), 12. 5 mg /L (mg/kg),62. 5 mg /L (mg/kg);
<3>底物顯色液共2瓶底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲，1 瓶，7ml/瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺，1瓶，7ml/瓶；
<4>乳酸鏈球菌素抗體工作液1瓶抗體稀釋液為含有2. 5% (質(zhì)量百分含量)酪蛋白的磷酸鹽緩沖液，抗體工作液稀釋濃度為1 1000，8ml/瓶；
<5>辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體工作液1瓶酶標(biāo)二抗稀釋液為含有0. 5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，羊抗兔抗抗體稀釋濃度為1:5000 (質(zhì)量百分含量)，7ml/瓶； <6>濃縮洗滌液1瓶含0. 05%吐溫、0. 1%明膠、0. 05% (質(zhì)量百分含量)疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液(0. 02M、pH 7.4);40ml/瓶;
<7>終止液1瓶含有2mol/L硫酸，7ml/瓶；
<8>復(fù)溶工作液1瓶含0. 1% (質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白的0. 06mol/L磷酸鹽緩沖液，50ml/瓶。4)采用試劑盒對(duì)樣品中乳酸鏈球菌素含量的檢測(cè)
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)乳酸鏈球菌素的含量；向包被有乳酸鏈球菌素與卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板微孔中加入乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μ1，再加入乳酸鏈球菌素抗體工作液50μ1，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min ；倒出孔中液體，每孔加入250μ1洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干；每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體工作液100ml， 37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟；每孔加入底物顯色液A液過(guò)氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，各50μ1，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色 15min,每孔加入2mol/L終止液硫酸50ml，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測(cè)定每孔吸光度值。所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0 標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Btl)再乘以100 %，即為百分吸光度值。公式百分吸光度值(％) = B/B0X100%
公式中B為標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液的平均吸光度值，B0為Omg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均吸光度值。以乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/L)的半對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示；相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中乳酸鏈球菌素的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，用同樣的方法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品中乳酸鏈球菌素的含量。
將附圖1中各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)的吸光度的平均值列表，見(jiàn)表1。
權(quán)利要求
1.一種食品防腐劑-乳酸鏈球菌素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于用乳酸鏈球菌素作為抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫得到多克隆抗體，以乳酸鏈球菌素半抗原與卵清蛋白O V A的偶聯(lián)物作為包被抗原，以乳酸鏈球菌素為標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建免疫檢測(cè)及對(duì)樣品的處置方法，即獲取該方法的載體試劑盒；1)檢測(cè)方法的構(gòu)建包被抗原的制備用PH值為9. 6的0. 01-0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原 1000倍，加入酶標(biāo)板，每孔100μ1，37 孵育池，傾去包被液，用含有0. 05%0疊氮化鈉、0. 1% 明膠和0. 05%吐溫的磷酸鹽緩沖液，即0. 02Μ、PH 7. 4，洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150 μ 1封閉液，即0. 1%0疊氮化鈉和10%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，37°C 溫育池，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存；多克隆抗體的制備將1.0mg/ml的乳酸鏈球菌素溶液與等量的弗氏佐劑混合均勻， 對(duì)首次免疫的兔子實(shí)施頸背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0. 2ml ；第二次免疫，將1. Omg/ml乳酸鏈球菌素溶液與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻，對(duì)兔子實(shí)施頸背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn) 0. 2ml ；每次注射間隔2周，采血檢測(cè)抗血清效價(jià)，直到抗體效價(jià)大于1 :3000為止；競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)用0. 1%牛血清白蛋白的0. 03-0. 06mol/L的磷酸鹽緩沖液，對(duì)乳酸鏈球菌素的標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)施梯度稀釋，其梯度為0. 1,0. 5,2. 5、12. 5,62. 5Pg/ml，每孔加50μ1 ；將制備的多克隆抗體以2. 5%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液按1 :1000比例稀釋后加入，每孔加入50μ1， 37°C溫育30min，然后用PBST洗滌3_5次；加酶標(biāo)二抗將0. 5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體以1 :5000稀釋后加入，每孔加入100μ1，37 ，30π η后，用PBST洗滌3-5次；顯色每孔加入顯色液100μ1，37 顯色15min ；最后每孔加入終止液2 M硫酸溶液 50 μ L ；用酶標(biāo)儀450nm測(cè)吸光值A(chǔ)45tl，與所作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比算出待測(cè)樣品的乳酸鏈球菌素的含量；上述乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)置于sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體購(gòu)置于 Jackson ImmnoResearch LABORATORIES, INC ；2)對(duì)檢測(cè)樣品的處置乳飲料將0. 1%牛血清白蛋白的0. 03-0. 06mol/L磷酸鹽緩沖液，即為復(fù)溶工作液，對(duì)樣品處置，即稀釋10倍；肉制品將樣品制成粉末狀，取Ig樣品置于50ml離心管里，加入5ml的復(fù)溶工作液，充分震蕩混勻，后靜置lOmin，提取上清Ι-aiil，用于分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于該方法的檢測(cè)試劑盒包括1)包被原的酶標(biāo)板1塊，其包被原為乳酸鏈球菌素與載體蛋白偶聯(lián)物；2)酶標(biāo)二抗工作液1瓶，其工作液用0.5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液稀釋5000倍的酶標(biāo)二抗獲取，7ml/瓶；3)抗體工作液1瓶，其工作液用2.5%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍的抗體獲取， 8ml/ 瓶；4)乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，共6瓶，濃度分別為Omg/L，0. Img/L,0. 5mg/L, 2. 5mg/L, 12. 5mg/L，62. 5mg/L ；5)底物顯色液2瓶，由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲，7ml/瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺，7ml/瓶；6)終止液1瓶，含l-2mol/L硫酸，7ml/瓶；7)濃縮洗滌液1瓶，含0.05%吐溫、0. 1%明膠、0. 05%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液0. 02M、 pH 7. 4，40ml/瓶;8)復(fù)溶工作液1瓶，50ml/瓶。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種食品防腐劑-乳酸鏈球菌素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，用乳酸鏈球菌素作為抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫得到多克隆抗體，以乳酸鏈球菌素半抗原與卵清蛋白ＯＶＡ的偶聯(lián)物作為包被抗原，以乳酸鏈球菌素為標(biāo)準(zhǔn)品，建立免疫檢測(cè)及對(duì)食品樣品的處理方法，提供其方法的載體試劑盒。該檢測(cè)方法的構(gòu)建包括對(duì)檢測(cè)樣品的處置；包被抗原的制備；多克隆抗體的制備及競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)；加酶標(biāo)二抗、顯色等。獲得的檢測(cè)試劑盒包括包被原的酶標(biāo)板1塊；酶標(biāo)二抗工作液1瓶；抗體工作液1瓶；乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶；底物顯色液2瓶；終止液1瓶；濃縮洗滌液1瓶；復(fù)溶工作液1瓶。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102401830SQ20111020784
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月25日
發(fā)明者孟茹, 王振寶 申請(qǐng)人:伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心