專利名稱：用于生理體液多指標聯合檢測的半導體芯片及系統的制作方法
用于生理體液多指標聯合檢測的半導體芯片及系統技術領域：
本發明屬于半導體傳感器及其檢測系統、生物醫學檢驗領域。背景技術：
本發明的理論基礎為免疫分析、光尋址電位傳感器(light addressablepotentiometric sensors, LAPS)、電化學測試技術。1、生理體液中多指標聯合檢測生理體液中多指標聯合分析是現代臨床醫學診斷過程的重要環節之一，特別是在腫瘤類疾病的早期篩查、病程鑒定、療效評估中，具有重要的輔助診療價值[1’2’3]。其中的“指標”是指體液中的某種抗原、抗體、酶等生物物質，此類物質的異常表示人體可能潛在某種疾病。免疫分析是實現此類物質檢驗的理論基礎，即，利用抗體、抗原之間的特異性結合，實現對體液中某項生理指標的檢驗。然而，免疫響應過程是一個微觀過程，為了使檢驗結果具有可測性，傳統的檢驗方法需要借助于示蹤標記物，例如熒光標記^]，電致化學發光標記[5]、化學發光[6]、量子點標記[7]等。傳統免疫分析的過程是一種“生物-光-電”的轉化過程，檢測過程和設備較為復雜，首先需要對探針進行示蹤物標記，這是一個復雜且高成本的過程；其次，根據所使用的示蹤標記物，需要選擇特定波長的激發光源，其目的是使示蹤標記物受激后發出待測光；最后，完成點樣、洗脫后的被測樣本，放入檢測設備中，利用光電轉換器件及其系統，將檢驗結果顯示在用戶終端的電腦上。基于示蹤標記物的傳統檢驗系統，操作復雜，且設備成本較尚ο目前來講，臨床上生理體液中多指標聯合分析，通常是對各個指標分別獨立檢測， 然后再綜合分析。為實現生理體液中多種生理指標的同時檢測，多指標聯合檢測系統成為研究熱點，例如12種腫瘤標志物平行檢測系統[1]，就是一種基于化學發光法的多指標聯合檢測系統。2、LAPS生物敏感機制典型LAPS敏感單元的剖面結構如圖1所示，LAPS敏感單元由電解質溶液1、氮化硅層2、二氧化硅層3、ρ型Si襯底4構成，是整個傳感器敏感機制的核心部分。LAPS生化敏感機制是半導體光電效應、表面電場效應、以及特異性生化反應三方面共同作用的結果， 簡述如下P型Si襯底4下方設有紅外光源5，根據半導體材料的光電效應，硅吸收紅外波段的光子后，將產生“光生電子空穴對”，這些“光生電子空穴對”在濃度梯度的作用下向硅片上方擴散；P型Si襯底4的上方，從下向上依次為二氧化硅層3、氮化硅層2、電解質溶液1， 由于各種材料功函數的不同，在P型Si襯底4與二氧化硅層3的界面處，將產生空間電荷區；同時，利用電解質溶液1上部插入的參比電極6，可在LAPS施加一定的偏置電壓，使得空間電荷區處于多子耗盡的狀態；光照時，“光生電子空穴對”向上擴散，當其接近空間電荷層時，光生多子將被吸引進入空間電荷區，并填充其中的耗盡狀態，而光生少子則堆積在空間電荷層邊緣，形成了對空間電荷層的充電效應；光照停止后，積累在空間電荷層中的載流子就會被釋放出來，形成放電效應。這樣，當紅外光源5，受到光源控制器7的控制，成為具有一定調制頻率的光時，上述充、放電效應也將具有周期性；在工作電極8、對電極9之間構成的電路中，就可以測量到相應的電流或電壓信號，這個信號就是laps的輸出信號，稱為光電流或光電壓。LAPS的生化敏感機制，來自于對氮化硅層2表面的生物功能化處理，使其表面發生特異性生化反應，反應前后氮化硅層2與電解質溶液1之間的界面阻抗發生改變；當參比電極6上的偏置電壓保持不變時，ρ型Si襯底4與二氧化硅層3界面處的有效界面勢，將受到特異性生化反應的調制；與此同時，若紅外光源5的強度、調制頻率均保持不變時，LAPS 的輸出信號就成為受這個特異性生化反應調制的生化敏感信號。3、LAPS的測試體系LAPS常采用三電極電化學測試體系，主要由參比電極6、對電極9 (又稱輔助電極)、以及制作在P型Si襯底4底部的工作電極8構成。其中參比電極6為測量提供偏置電壓，需具有穩定的、已知的電極電位，常采用Ag/AgCl電極、甘汞電極等；對電極9用來與工作電極8構成電流通路，應具有較大的表面積，常用鉬黑電極。目前laps三電極測試體系的工作方式有三種te’9a°]恒壓模式、恒流模式、恒相位模式。恒電壓模式是指，保持參比電極6的電位不變，測量laps的輸出信號變化；恒電流模式是指，利用反饋回路使laps的輸出信號不變，調節參比電極6的電位，將其變化量作為測量結果；恒相位模式是指，利用反饋回路使laps的輸出信號與光源10之間的相位差保持不變，測量參比電極6的電位變化。4、本發明的提出laps陣列型半導體芯片在ph圖像傳感領域[8]得到較多的研究，為實現生理體液中多指標聯合檢測，還有兩個重要問題需要解決①芯片表面的生物功能化問題；②高密度陣列芯片中的點樣問題。針對這些問題，分別從laps和生理體液多指標聯合檢測兩方面，查閱有關文獻和專利如下(1)有關laps的文獻或專利Ddetection method for pathogenic microorganism withlight-addressable
POTENTIOMETRIC SENSOR ；Inventor :KIM HEE CHAN(KR) ；YUM DO YOUNG(KR) ；Publication info :KR20050110973-2005-11-242)METHOD FOR DETECTING SIGNAL FOR MULTI-CHANNEL LAPS；Inventor :BAESANG KON(KR) ；CHO JIN HO(KR) ；Publication info :KR20030086753-2003-l1-123)Genetically biotinylated recombinant antibody in immunofi1tration assay by light addressablepotentiometrie sensor for identification of Venezuelan equine encephalitis virus ；Inventor :FULT0N R ELAINE (CA) ；NAGATA LESLIE P(CA) ；Publication info :US2004229216-2004_11-184)Genetically biotinylated recombinant antibody in immunofiltration assay by light addressablepotentiometrie sensor for identification of Venezuelan equine encephalitis virus ；Inventor HUffEIGANG(CA) ；NAGATA LESLIE P(CA) ；Publication info :CA2462343-2004-09_255)Improvements in transducer devices with LAPS type structure ；Inventor =DELLA CIANALE0P0LD0；F0RTUNAT0 GUGLIELM0 ；Publication info IT1261339-1996-05-146)三維微結構光尋址電位傳感器，發明人韓涇鴻，公開號11689757)多光源尋址電位傳感器及并行處理的氣體圖象測試裝置，發明人王平，張欽濤·公開號=2588448)用于檢測狗的薄膜光尋址電位傳感器及其制備方法，發明人王平，門洪，李毅，許祝安.公開號巧470039)用于檢測Hg的薄膜光尋址電位傳感器及其制備方法，發明人王平，門洪，李毅，許祝安.公開號巧4700410)Torsten Wagner, Carl Frederik fferne, Ko-ichiro Miyamoto. FPGA-based LAPS device for theflexible design of sensing sites on functional interfaces. Applications and Materials Science,4 844 ~ 849(2010)其中，國外專利中1)、5)和國內專利6)、7)、10)為LAPS器件及其檢測技術的發明；3)、4)是在美國和加拿大分別注冊的同一專利，其發明點為使用生物素(biotin)使 LAPS表面生物功能化，檢測腦炎細菌；7)、8)、9)為LAPS在氣體、狗離子、Hg離子檢測中的應用。發明專利1)、6)、7)、10)，采用多路激發光源，每一個激發光源與敏感單元對準，特別是10)采用了新型激光陣列作為LAPS中的激發光源；5)主要采用多晶硅作為柵極，是對 LAPS中部分材料的發明創新。(2)生理體液的多指標聯合檢測是當前的科研熱點，文獻較多，其中與半導體材料或電學檢測相關的文獻，有如下幾篇11) Label-free biomarker detection from whole blood，Nature Nanotechnology，5(2) :138. (2010).12)Direct label-free electrical immunodetection in human serum using a flow-through-apparatusapproach with integrated field-effect transistors， Biosensors and Bioelectronics 25:1767-1773(2010)13) Label-free capacitive biosensor for sensitive detection of multiple biomarkers using goldinterdigitated capacitor arrays, Biosensors and Bioelectronics 25 :2318-2323(2010)14)Label-Free Biomarker Sensing in Undiluted Serum with Suspended MicroChannel Resonators, Anal. Chem. 82(5) :1905-1910(2010)15)Label-Free Electrical Detection of Cardiac Biomarker with Complementary Metal-OxideSemiconductor-Compatible Silicon Nanowire Sensor Arrays, Anal. Chem.，81 :6266-6271 (2009)16) Biogenic nanoporous silica — based sensor for enhanced electrochemical detection ofcardiovascular biomarkers proteins， Biosensors and Bioelectronics 252336-2342(2010)其中，12)以場效應晶體管(field-effect transistor,FET)作為敏感器件；11)、 15)以量子線型 Τ陣列為敏感芯片；13)以電容型敏感陣列為敏感元件；14)為基于微懸臂梁型傳感器的敏感陣列；16)以天然硅藻作為多孔敏感薄膜，并制備了用于心血管疾病標志蛋白的阻抗型器件。尚未發現，基于LAPS的生理體液多指標聯合檢測的報道。從現有的專利和文獻來看，僅發現幻、4)兩項與問題①有關，但這兩項專利提出的表面生物功能化方法進限于腦炎細菌，若要實現生理體液中多指標聯合檢測，仍具有一定局限性；對于問題②，除參考文獻[1]指出使用點樣機“Cartesian inkjet printer, GT5000 Gantry System”外，這種方法點樣成本較高，其它點樣方式未見報道。
發明內容本發明目的是解決現有技術存在的上述不足，提供一種用于生理體液多指標聯合檢測的半導體芯片及其系統。用于生理體液多指標聯合檢測的半導體芯片及系統，依次包括電解質溶液、參比電極、對電極、工作電極、敏感陣列芯片、光源陣列芯片、電化學工作站、鎖相放大器、光源控制器、電腦，敏感陣列芯片由底部至表面依次為，P型Si襯底、二氧化硅層、氮化硅層、左旋多巴敏感薄膜，在P型Si襯底與二氧化硅層之間設有P+-Si區域，相鄰P+-Si區域構成敏感陣列芯片的敏感單元、P型Si襯底的底部設有光源腔體，光源陣列芯片的上部設有光源點、 光源陣列控制電極，其特征為，敏感陣列芯片下底面與光源陣列芯片上表面相連，并且光源點嵌入光源腔體內，光源腔體放置于敏感單元中軸線處，工作電極設于敏感陣列芯片上部并穿過氮化硅層、二氧化硅層與P+-Si區域接觸，工作電極與鎖相放大器的正向輸入端相連，參比電極、對電極分別與電化學工作站的參比電極端口、對電極端口相連，電化學工作站的工作電極端口與鎖相放大器、地電極相連，光源控制器的輸出端口與光源陣列控制電極相連，鎖相放大器的頻率輸出端口與光源控制器的頻率控制端口相連，電腦分別與電化學工作站的USB端口、鎖相放大器的RS-232端口相連。圖2、圖3為本發明提出的用于生理體液多指標聯合檢測的半導體芯片及系統。 光源陣列芯片17位于敏感陣列芯片16的下部，且光源點21嵌入光源腔20內(如圖2所示)，光源陣列芯片17中光源點21的尋址、發光功率、調制頻率由光源控制器7控制。敏感陣列芯片16內制作有900個敏感單元22，并排列為30行X30列矩陣的形式(如圖3所示)，且該矩陣與工作電極8分別制作在敏感陣列芯片16的兩個對角端，以保證電氣連接遠離液態被測環境。參比電極6、對電極9、工作電極8構成三電極測試體系，與鎖相放大器 10、電化學工作站11各指定端口相連(如圖2所示)。下面對其創新點進行說明芯片表面的生物功能化圖2中左旋多巴敏感薄膜19為利用自組裝法制作的生物敏感膜。目前半導體生化傳感器研究中普遍采用的基于化學試劑的化學交聯方法[11’12]，本發明中使用了一種基于左旋多巴的仿生活化新方法，檢索文獻未見報道。左旋多巴是蛘類黏性蛋白質(MAPs)中的一種雙功能氨基酸[13]，是生物分子交聯的良好生物啟動因子[14’15]，是固態載體(如金屬、二氧化硅)上聚合過程的生物啟動因子，它可將無機的固態載體轉化為易于進行聚合反應的活化固態載體。本發明中利用左旋多巴分子M(如圖4所示)作為氮化硅層2的生物啟動因子，利用左旋多巴分子M上的羧基基團與待固定抗體分子25結合，從而在敏感陣列芯片 16上制備出左旋多巴敏感膜19。高密度陣列芯片中的點樣圖2中敏感單元22排列成高密度矩陣形式，為實現高密度陣列的點樣，本發明提供相匹配的微流體芯片30及點樣系統，如圖5、6所示。將微流體芯片30緊壓在敏感陣列芯片16上表面，且流體溝道31 (如圖5所示)與敏感單元22的行或者列重合，其中微流體芯片采用PDMS材料，具有透明性，便于對準操作。這樣，通過微流泵沈，就可以向流體溝道內泵入指定抗體分子25的溶液(或者待測生理體液的樣液)，從而完成對敏感單元22的點樣操作。本發明的優點和積極效果首先，本發明提出的“用于生理體液多指標聯合檢測的半導體芯片及系統”，既解決了芯片表面的生物功能化問題，與傳統的化學交聯方法相比具有較好的生物兼容性；也解決了高密度芯片中敏感單元的點樣問題。其次，本發明提出的“用于生理體液多指標聯合檢測的半導體芯片及系統”，是一種無標記的多指標聯合檢測系統，具有無標記多指標聯合檢測系統的優勢，即擺脫了傳統方法對示蹤標記過程的依賴，具有快速、靈敏、低成本、高通量的優點[16’17]，是研發 POC(point of care)手持式醫學診療設備的核心技術。此外，與文獻報道的其它無標記檢測系統相比，本發明以LAPS作為基本模型，將高密度光源陣列芯片17與敏感陣列芯片16集成于一體，因此具有尋址精度高、點陣密度高、芯片制作工藝簡單、集成度高、等優點[8_⑵。
圖1為現有技術中典型LAPS敏感單元示意圖。圖2為用于生理體液多指標聯合檢測半導體芯片剖面圖及系統結構示意圖。圖3為用于生理體液多指標聯合檢測半導體芯片立體結構示意圖。圖4為左旋多巴敏感膜制備過程示意圖。圖5為用于生理體液多指標聯合檢測半導體芯片的微點樣系統結構示意圖。圖6為用于生理體液多指標聯合檢測芯片及系統的PDMS微流體芯片結構示意圖。其中1 電解質溶液；2 氮化硅層；3 二氧化硅層；4 :p型Si襯底；5 光源；6 工作電極；7 光源控制器；7-1 光源控制器的輸出端口 ；7-2 光源控制器的頻率控制端口 ； 8 工作電極；9 對電極；10 鎖相放大器；10-1 鎖相放大器輸入端(正)；10-2 鎖相放大器輸入端(負)；10-3 鎖相放大器輔助頻率輸出端；10-4 鎖相放大器RS-232通訊端口 ； 11 電化學工作站；11-1 電化學工作站參比電極端口 ；11-2 電化學工作站對電極端口 ； 11-3 電化學工作站工作電極端口 ； 11-4 電化學工作站USB端口 ； 12 電腦；13 =USB電纜； 14 :RS-232電纜；15 地電極；16 敏感陣列芯片；17 光源陣列芯片；18 光源陣列控制電極；19 左旋多巴敏感膜；20 光源腔；21 光源點；22 敏感單元；23 :p+_Si區域；24 左旋多巴分子；25 抗體分子；26 微流泵；27 導管；28 流體入口 ；29 流體出口 ；30 微流體芯片；31 微流體溝道。
具體實施方式實施例1本發明提供的用于生理體液多指標聯合檢測半導體芯片，依次包括左旋多巴敏感膜19、氮化硅層2、二氧化硅層3、ρ型Si襯底4、p+-Si區域23、工作電極8、光源腔20、光源陣列芯片17。采用微米級集成電路工藝，即可完成本發明中半導體芯片的制備，基本工藝順序為Dp+-Si區域23的制備，所需工藝為濕氧氧化工藝、光刻工藝、擴散工藝、清洗工藝；2) 二氧化硅層3的制備干氧氧化工藝；3)氮化硅層2的制備低壓化學氣相淀積工藝；4)光源腔20的制備濕法腐蝕工藝5)光源陣列芯片17的固定粘合工藝(可使用硅膠或環氧樹脂)6)左旋多巴敏感膜19的制備使用左旋多巴的酸性溶液處理氮化硅層2，使左旋多巴分子對以氫鍵固定在敏感陣列芯片16的氮化硅層2表面；使用蛋白質抗體25的溶液處理上一步驟后的敏感陣列芯片，使左旋多巴分子M上的羧基與蛋白質抗體25的羥基發生縮水反應，將蛋白質抗體25固定在敏感陣列芯片16表面。參考文獻_[1]Zhenghong Sun, Xiaoli Fu, Lu Zhang, Xiaoli Yang, Feizhou Liu, Gengxi Hu. A Protein Chip System forParallel Analysis of Multi-tumor Markers and its Application in Cancer Detection. Anticancer Research 24:1159-1166(2004)[2]Quan Liao,Yu-Pei Zhao,Ying-Chi Yang,Li-Jun Li,Xiao Long and Shao-Mei Han. Combined detection ofserum tumor markers for differential diagnosis of solid lesions located at the pancreatic head. HepatobiliaryPancreat Dis. Int. Vol 6(6) :641-645(2007)[3]Martin Donach,Yinhua Yu,Grazia Artioli,Giuseppe Banna, Weiwei Feng, Robert C.Bast, Zhen Zhang, MariaO. Nicoletto. Combined use of biomarkers for detection of ovarian cancer in high-risk women. Tumor Biol. 31 :209-215(2010)[4] J. H. Lee, H. K. Choi, J. H. Chang J. H. Lee, H. K. Choi, J. Ho Chang. Optimization of biotin labeling ofantibodies using mouse IgG and goat anti-mouse IgG-conjugated fluorescent beads and their application ascapture probes on protein chip. Journal of Immunological Methods,vol. 362,pp. 38-42(2010)[5]Ying Xu, Ping Dong, XiaoYan Zhang, PinGang He and YuZhi Fang, "Solid-state electrochemiluminescenceprotein biosensor with aptamer substitution strategy, "Science China Chemistry,vol. 54,no. 7,pp. 1109-1115. (2011)[6]M. T. Hossain, T. Shibata, T. Kabashima, M. Kai, "Aptamer-Mediated Chemiluminescence Detection of PrionProtein on a Membrane Using Trimethoxyphen ylglyoxal, "Analytical Sciences, vol. 26, no. 6,pp.645-647. (2010)[7] J. Liu, Q. Huang, X.Wang, Q. Yang, H. Chen, "Applications of Quantum Dots in Biological Analysis andBiomedical Diagnosis, "Progress in Chemistry,vol. 22, no. 6，pp.1068-1076. (2010)[8]Nakao M, Yoshinobu T, Iwasaki H. Scanning-laser-beam semiconductor pH-imaging sensor. Sensors andActuators B ;20 :119-123(1994)
[9]Tatsuo Yoshinobu, Holger Ecken, Arshak Poghossian, Anette Simonis, Hiroshi IwasakiiHans LuthiMichael J. Schoning. Constant-Current-Mode LAPS (CLAPS) for the Detection of Penicillin. Electroanalysis, 13 :733-736 (2001)[10]Ko-ichiro Miyamoto, Torsten Wagner, Shuhei Mimura， Shin ' ichiro Kanoh, Tatsuo Yoshinobu， MichaelJ. Schoning. Constant-phase-mode operation of the light-addressable potentiometric sensor. Procedia Chemistryl :1487-1490 (2009)[ 11 ] A. Sibbald，A. K. Covington, R. F. Carter. Simultaneous On-Line Measurement of Blood K+，Ca2+，Na+，andpH with a Four-Function Chem FET Integrated-Circuit Sensor. CLIN. CHEM. 30(1) :135-137(1984)[12]顧麗波，韓涇鴻，崔大付，張虹.甲胎蛋白光尋址電位式傳感器的研究.分析化學，33(1) :17-12(2005)[13]Xiaowu Fan，Lijun Lin, Jeffrey L. Dalsin, Phillip B. Messersmith. Biomimetic Anchor for Surface-InitiatedPolymerization from Metal Substrates. J. Am. Chem. Soc. 127 (45)，pp 15843-15847 (2005)[14]Raphae ” 1 Barbey, Laurent Lavanant, Dusko Paripovic, Nicolas Schu.. wer，Caroline Sugnaux, Stefano Tugulu，Harm—Anton KloLPolymer Brushes via Surface-Initiated Controlled Radical Polymerization. Chem. Rev. 109， 5437-5527(2009)[15]Hari Shankar Biswas, Jagannath Datta,D. P. Chowdhury,A. V. R. ReddyiUday Chand Ghosh，ArvindKumar Srivastava, Nihar Ranjan Ray. Covalent Immobilization of Protein onto a functionalizedHydrogenated Diamond-like Carbon Substrate. Langmuir 26(22) :17413-17418(2010)[16] Jay Huiyi Chua, Ru-Ern Chee，Ajay Agarwal，She Mein Wong, Guo-Jun Zhang， Label-Free ElectricalDetection of Cardiac Biomarker with Complementary Metal-Oxide Semiconductor-Compatible SiliconNanowire Sensor Arrays,Anal. Chem., 81 :6266-6271. (2009)[17]Eric Stern，Aleksandar Vacic，Nitin K. Rajan, Jason M. Criscione, Jason Park，Bojan R. Ilic，David J. Mooney, Mark A. Reed, Tarek M. Fahmy, Label-free biomarker detection from whole blood. Nature Nanotechnol，5(2) :138-149. (2010)
權利要求
1.用于生理體液多指標聯合檢測的半導體芯片及系統，依次包括電解質溶液、參比電極、對電極、工作電極、敏感陣列芯片、光源陣列芯片、電化學工作站、鎖相放大器、光源控制器、電腦，敏感陣列芯片由底部至表面依次為，P型Si襯底、二氧化硅層、氮化硅層、左旋多巴敏感薄膜，在P型Si襯底與二氧化硅層之間設有P+-Si區域，相鄰P+-Si區域構成敏感陣列芯片的敏感單元、P型Si襯底的底部設有光源腔體，光源陣列芯片的上部設有光源點、光源陣列控制電極，其特征為，敏感陣列芯片下底面與光源陣列芯片上表面相連，并且光源點嵌入光源腔體內，光源腔體放置于敏感單元中軸線處，工作電極設于敏感陣列芯片上部并穿過氮化硅層、二氧化硅層與P+-Si區域接觸，工作電極與鎖相放大器的正向輸入端相連， 參比電極、對電極分別與電化學工作站的參比電極端口、對電極端口相連，電化學工作站的工作電極端口與鎖相放大器、地電極相連，光源控制器的輸出端口與光源陣列控制電極相連，鎖相放大器的頻率輸出端口與光源控制器的頻率控制端口相連，電腦分別與電化學工作站的USB端口、鎖相放大器的RS-232端口相連。
全文摘要
用于生理體液多指標聯合檢測的半導體芯片及系統，屬于半導體傳感器及其檢測系統和生物醫學檢驗領域。本發明利用免疫分析、半導體器件物理及其工藝，實現多種生理指標的無標記聯合檢測，并具有尋址功能。其中，在p型Si襯底的下表面制作有光源腔，二氧化硅層和氮化硅層由下至上依次位于p型Si襯底上；氮化硅層上表面制備有左旋多巴敏感膜；光源陣列芯片上的光源點嵌入光源腔內部，實現光源點與敏感單元的對準，具有高精度光尋址的優點；芯片的測控系統包括，電化學工作站、鎖相放大器、光源控制器、電腦。本發明的半導體芯片及系統，其點樣過程采用微流體技術，有利于降低點樣成本；檢測過程具有無標記的特點，可將生理體液的多種被測生理指標轉化為工作電極與對電極之間的電信號，并實時采集與記錄；同時，由于采用了左旋多巴敏感膜，具有較好的生物兼容性。
文檔編號G01N33/561GK102360009SQ20111020600
公開日2012年2月22日 申請日期2011年7月22日 優先權日2011年7月22日
發明者賈蕓芳 申請人:南開大學