專利名稱：一種血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子酶聯免疫試劑盒的制作方法
技術領域：
^^BJMTBIK^^^tlT ( enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) ^ 術，具體涉及一種檢測血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子活性的試劑盒，采用抗血小板糖蛋白(glycoprotein，GP) Iba 單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb) SZ-151 作為包被抗體來捕捉結合真核表達重組人GPrt α氨基端His1-Val289片段的-Fc融合蛋白 (rfGPIba Hl-M89_Fc)，再捕獲血漿中的血管性血友病因子(VWF)，然后應用酶標檢測儀檢測血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子活性。
背景技術：
血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)是一種大分子量的具有粘附功能的多聚體糖蛋白，在初期止血過程中發揮著重要怍用。它既可與血小板受體糖蛋白 (GP)Ib/IX/V、GP II b/III a結合，又能與膠原等細胞外基質(ECM)結合，從而介導血小板的粘附與聚集。而且vWF還能與凝血因子VDI結合，保護因子VDI免受APC滅活。vWF量的減少或質的異常均能導致血管性血友病(von Willebrand' s diseases, vffD)的發生。血管性血友病(von willebrand's disease,vffD)是最常見的一種遺傳性出血性疾病，國外文獻報道vWD發病率為0. 1%-1%，其發病機制為患者的vWF基因突變，導致血漿中vWF數量減少或質量異常。vWD主要分為3型，其中1型與3型為量的減少，2型為質的異常。2型又可進一步分為四種亞型(A，B，M和N)。(1)2A型為vWF前體裝配異常或對蛋白水解酶的敏感性增加導致缺乏vWF高、中分子多聚體缺乏；(2)2B型發病機制為vWF與血小板膜GP I b親和性增加以致自發結合，導致血小板聚集、減少，vWF清除加速，特征為缺乏vWF高分子多聚體；(3)2M型是由于vWF基因Al區突變，導致對血小板膜GP I b親和性降低，vWF多聚體分析正常；(4) N型特征為vWF基因D'區或D3區突變，導致與因子VDI親和力降低，血漿F VDI失去保護而被降解。在大部分國家，疑似vWD患者的篩查試驗包括出血時間(BT)，vWF抗原水平 (vffF:Ag)和vWF瑞斯托霉素輔因子活性試驗(vWF:RCof)等。要做出準確、恰當的治療尚需結合其他分型試驗如瑞斯托霉素誘導的血小板聚集(RIPA)、膠原結合試驗(vWF:CB)、vWF 多聚體凝膠電泳和基因分析等。現有實驗室檢查方法各有一定局限性，因此不能僅憑單項實驗做出可靠的診斷，需組合應用一系列檢測方法才能較好地對vWD進行篩查、診斷和分型。vWF:Ag試驗可較好的反映vWF量的異常但無法體現出vWF質的缺陷，其結果有助于診斷所有3型和大部分1型患者，由于部分2型患者vWF:Ag水平可能正常，因此該實驗僅能輔助診斷部分2型患者。對于2型患者，反映vWF功能的主要試驗vWF:RC0f就變得尤為重要。瑞斯托霉素是一種抗生素，可誘導vWF和血小板GPrt/V/IX復合物的結合。已證實與vWF的Al區結合的部位為血小板GPrt α氨基末端分子量42kD的片段(H1-M89)。國內目前主要應用血液凝集儀檢測vWF :Rcof，該方法需使用血小板聚集儀，其主要將固定正常血小板，患者血漿及一定濃度瑞斯托霉素混合，測定血小板凝集情況。由于該方法使用固定的正常血小板，存在重復性較差、批內變異和批間變異都較大的固有缺點，且血小板聚集程度有時難以判定，因此常導致部分vWD患者的誤診。2000年Vanhoorelbeke等首次報道了應用抗GPrt α單克隆抗體2D4包被96孔聚苯乙烯酶標板，加入重組的GPrta，在小劑量瑞斯托霉素存在下建立了血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子活性測定的酶聯免疫分析(vWF:RCOf -ELISA);國內2007年徐海燕等應用該進口抗體2D4也報道了該方法vWF Rcof-ELISA法建立，以抗GPIki的單克隆抗體 2D4為包被抗體，捕獲重組的GPIki氨基端片斷(ν GPlba)，該片段在瑞斯托霉素存在的情況下與vWF結合(參見徐海燕.血管性血友病分型組合實驗的建立和臨床應用.《蘇州大學》2007年碩士論文)。但是，現有技術中至今未見商品化的vWF:RCOf -ELISA診斷試劑盒。
發明內容
本發明的發明目的是提供一種血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子酶聯免疫試劑盒。為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是一種血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子酶聯免疫試劑盒，包括固相化包被抗體的酶標板，辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，標準品，瑞斯托霉素，重組GPrt α H1-M89片段-Fc融合蛋白(rfGPrt α Hl-M89-Fc)，樣品稀釋緩沖液，顯色液，終止液，其中，所述包被抗體為抗血小板膜糖蛋白 Iba的單克隆抗體SZ-151 ；所述檢測抗體為兔抗人VWF多抗(RAH-vWF-HRP)；所述標準品為混合標準血漿；
所述單克隆抗體SZ-151由雜交瘤細胞SZ-151制備得到，所述雜交瘤細胞SZ-151的保藏信息為保藏日期2011年5月M日；保藏單位中國典型培養物保藏中心；保藏地址 中國武漢武漢大學；保藏編號CCTCC C201131 ；分類命名雜交瘤細胞SZ-151。上述技術方案中，所述重組GPIba H1-M89片段-Fc融合蛋白rfGPIb a H1-M89-FC可參考文獻楊劍峰，抗血小板膜糖蛋白rta單克隆抗體的人源化及基于膜糖蛋白Λ α結構的活性小分子化合物研究，2010年蘇州大學內科血液病學專業博士論文， P48。上述技術方案中，所述檢測抗體為兔抗人VWF多抗RAH-vWF-HRP可參見文獻 Vanhoorelbeke K, et al, 2000, Thromb Haemost, 83:107—13。上述技術方案中，所述固相化包被抗體的酶標板為單抗SZ-151固相化的酶標板，即表示抗血小板膜糖蛋白Λα的單克隆抗體SZ-151已包被在酶標板上，所述酶標板選自但不限于可拆卸的96孔聚苯乙烯酶標板。所述設有固相化的抗人血小板膜糖蛋白(GP) Iba的單克隆抗體SZ-151的96孔聚苯乙烯酶標板，即每一個孔內都包被上 SZ-151 IgG，每一個孔內的雙-151 IgG能夠在體外分別特異性捕捉結合重組真核表達重組 GPIb a H1-V289 片段-Fc 融合蛋白(rfGPIb a Hl-V289-Fc)抗原分子。上述技術方案中，所述樣品稀釋緩沖液為含有質量分數0. 2%的BSA的PBS緩沖液；所述顯色液為TMB顯色液；所述終止液為3M的硫酸溶液。上述技術方案中，正常混合標準血漿的制備方法為(1)取外周靜脈血，采用枸櫞酸三鈉抗凝，離心后取貧血小板血漿(PPP) ； O)取兩名以上正常人的血漿等量混合后分裝，得到正常混合標準血漿，置一 80°C備用。優選的技術方案中，SZ-151包板濃度為10 μ g/mL，重組GPIb α H1-M89片段_Fc 融合蛋白rfGPrt α Hl-V289-Fc濃度為4 μ g/mL,瑞斯托霉素濃度為760 μ g/mL。應用上述試劑盒檢測血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子活性的方法，包括以下步驟
(1)取單抗SZ-151固相化的酶標板，每孔加入100μ 1重組GPIb α H1-V289片段-Fc 融合蛋白(rfGPIb α Hl-V289-Fc), 4 °C靜置過夜；
(2)以洗液洗板6次(TBS(0. 02 mol/L Tris-HCL，ρΗ7· 4)-0. l%Tween_20 洗滌 6 次)， 取正常混合標準血漿，用樣品稀釋緩沖液按照1 50、1 IOOU 200,1 400,1 800、 1 1600,1 3200共7個倍比稀釋，稀釋后的以50 μ L/孔加入ELISA板；將枸櫞酸三鈉抗凝的待測血漿用樣品稀釋緩沖液按照1 50稀釋，稀釋后的以50yL/孔加入ELISA板； 同時按照50μ L/孔的用量加入終濃度760μ g/mL的瑞斯托霉素；同時設立空白對照孔，所述空白對照孔為 0. 01mol/L ρΗ7· 4 TBS-lmL/L Tween-20 ；37°C溫育 2 小時；
(3)以洗液洗板6次，每孔再加入100μ 1辣根過氧化物酶標記兔抗人vWF多抗 (RAH-vWF-HRP)，37°C 溫育 1 小時;
(4)以洗液洗板9次，每孔加入100μ 1顯色液，顯色10分鐘；
(5)按照50μ1/孔的用量加入終止液以終止反應，在酶標儀上450 nm處測定各孔光吸收(0D 450 nm)值;
(6)計算和結果判定以正常混合血漿的7個倍比稀釋度的對數為橫坐標，相應0D450 nm值為縱坐標，作標準曲線和直線回歸方程后計算含量；以正常混合標準血漿的vWF =Rcof 定為100 U/dL，根據標準曲線和直線回歸方程，根據待測血漿測定的OD值計算出待檢測孔內vWF :Rcof，再乘上50 (待測樣本的稀釋倍數)，即為待測血漿內的vWF =Rcof0進一步的技術方案中，采用現有技術測得待測血漿的vWF:Ag以及vWF:CBA，結合上述待測血漿的vWF =Rcof比值判定血管性血友病的分型，具體方法為(vWF =RCof) / (vWF =Ag)比值常用于區分1型和2型vWD，1型患者該比值一般大于0. 6，2型患者該比值一般小于 0. 6 ；vWD，3 型患者，其 vWF :Ag, vWF =Rcof 和 vffF:CBA 均小于 5 U/dL。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點
(1)本發明中包被抗GPrta單抗SZ-151由本發明人研制，具有自主知識產權，使得本試劑盒國產化，降低了試劑成本，與國外的抗GPrt α單抗2D4包板所測結果進行對比，結果顯示兩種方法檢測vWFRCof較為相符(r=0.96)。該方法具有較好的重復性(批內和批間差異分別為8%和1洲)，且靈敏度更高(其DL為0. 01 U/dL)。(2)該方法檢測結果與vWF:Ag (r = 0. 91)和vWF:CBA (r = 0.85)具有良好的
相關性。(3)該方法血漿用量少，只需5μ 1。對于vWF抗原水平極低的患者，由于該方法靈敏度更高，因此可為其提供更準確的診斷和分型依據。 (4)我們用未經過純化的表達rfGPrt α的CHO培養上清液代替純化的rfGPrt α 蛋白進行vWF:RCof-ELISA試驗，同樣具有較好的結果，這提示今后或可直接使用未純化的 CHO培養上清液，簡化試驗步驟并避免rfGPrt α蛋白在純化過程中的損失，節省成本。
雜交瘤細胞SZ-151的保藏信息為保藏日期2011年5月M日；保藏單位中國典型培養物保藏中心；保藏地址中國武漢武漢大學；保藏編號CCTCC C201131 ；分類命名雜交瘤細胞SZ-151 ；
圖1為實施例六中不同瑞斯托霉素濃度的測試效果； 圖2為實施例六中兩種試劑盒的測試靈敏度對比圖； 圖3為實施例六中兩種試劑盒的測試結果相關性圖； 圖4為實施例七中VffFiRiCof與vffF:Ag相關性圖； 圖5為實施例七中vWF:RiCof與vWF:CBA相關性圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述 實施例一制備雜交瘤細胞株SZ-151。使用正常人混合血小板作為免疫原，常規三次免疫接種8周齡雌性Balb/c小鼠 (每次間隔4周)，用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測被免疫動物血清中單克隆抗體的存在和濃度。免疫完成后，選擇產生足夠高濃度(血清內抗體效價為1 :20000以上)抗血清的小鼠， 分離動物脾臟并制備脾細胞懸液。按照已知的雜交瘤技術(Kohlerand Milstein, Nature 215 :495-497,1975 ； Kohler et al, Immunology iTodayJ :72_76，1983)將所得到的小鼠脾細胞與適當的骨髓瘤 (SP2/0)相融合，應用ELISA法和Western印跡法等生化和免疫學技術篩選和鑒定后，挑選出具有高抗體分泌水平的雜交瘤，制備得到可持續傳代并分泌抗血管性血友病因子A3區單克隆抗體的雜交瘤細胞系。上述雜交瘤細胞系已于2011年5月M日將產生并分泌本發明單克隆抗體的雜交瘤細胞株保存在中國典型培養物保藏中心，其保藏登記號為CCTCC C201131。實施例二 純化單抗SZ-151。按照常規技術制備單抗SZ-151腹水，在PH8. 0,0. IM的PBS緩沖液中透析， 8000rpm離心，取腹水上清約Iml過柱(親和層析柱ftx)tein G-Sepharose 4B)使各IgG與蛋白G充分結合，用0. IM pH2. 8甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫，收集各單抗IgG峰。收集IgG用 PEG (分子量約20000)濃縮，在0. OlMPBS中透析4小時，用280nm測蛋白含量，SZ_151_IgG 凍低溫冰箱備用。實施例三SZ-151 IgG固相化包被酶標板。將抗GPrt α單克隆抗體SZ-151-IgG用包被緩沖液(0. 1Μ，ρΗ9. 6碳酸緩沖液) 稀釋，以10 μ g/mL加入96孔聚苯乙烯酶標板孔中，100 μ 1/孔，4°C濕盒過夜；次日，用 PBS-0. 05% Tween洗滌3次后，用封閉液(2% BSA-PBS) 250 μ 1/孔封閉，4°C濕盒過夜；次日，同上洗滌3次后備用或一 20°C凍存。實施例四重組GPIb α Hl-M89_Fc 片段-Fe 融合蛋白(rfGPIb α Hl-V289-Fc) 的真核表達、純化。將穩定表達重組人GPIb α氨基端His1-Val289片段的-Fc融合蛋白(rfGPIb α Hl-W89-Fc)的CHO細胞用含10%胎牛血清的IMDM培養液37°C培養，細胞生長旺盛后棄去上清，加入SFM培養基繼續培養五天，收獲上清，將高表達rGPrt α H1-V289的培養上清液用Protein A - Sepharose 4B親和層析柱純化。實施例五正常混合標準血漿的制備。取外周靜脈血anl，枸櫞酸三鈉(1:9)抗凝，3000 rpm/min，離心10 min，取貧血小板血漿(PPP)。本研究取40名正常獻血員的血漿等量混合后分裝，置一 80°C備用，為正常混合標準血漿。待測血漿分離方法同上。實施例六
一種vWF:Rcof - ELISA試劑盒，包括以下組分
(1)單抗SZ-151固相化的酶標板，抗血小板膜糖蛋白Λα的單克隆抗體SZ-151已包被在可拆卸的96孔聚苯乙烯酶標板上；
(2)重組GPIb α H1-V289 片段-Fc 融合蛋白(rfGPIb α Hl-V289-Fc)純品一瓶，10 ml, 4 μ g / ml ；
(3)混合的標準血漿4瓶，50μ /瓶；
(4)瑞斯托霉素一瓶，5ml，1. 5 ang / ml ；
(5)辣根過氧化物酶標記的兔抗人VWF多抗(RAH-vWF-HRP)，IOml；
(6)樣品稀釋緩沖液(0.2%BSA-PBS)—瓶，10 ml ；
(7)TMB 顯色液一瓶，10 ml ；
(8)終止液一瓶(3MH2SO4), 5 ml。(—)、確定上述試劑盒的最佳瑞斯托霉素濃度正常混合標準血漿分別作1/32 1/512稀釋后，分別以終濃度為1 π^/πι1，760μβ/πι1，500μβ/πι1* 250μβ/πι1瑞斯托霉素 37°C溫育2小時后，測定vWF:RC0f ；所述測定vWF:RC0f的方法包括以下步驟
(1)取單抗SZ-151固相化的酶標板，每孔加入100μ 1重組GPIb α H1-V289片段-Fc 融合蛋白，4 °C濕盒過夜；
(2)次日，以TBS (0. 02 mol/L Tris-HCL, ρΗ7· 4) -0. l%Tween-20 洗滌 6 次，正常混合標準血漿分別作1/32 1/512稀釋后，按50yL/孔的量加入酶標板；同時加入瑞斯托霉素50 μ 1/孔，終濃度分別為1 mg/ml，760 μ g/ml，500 μ g/ml和250 μ g/ml ；空白對照孔為 0. 01mol/L ρΗ7· 4 TBS-lmL/L Tween-20，37°C溫育 2 小時；
(3)同上洗滌6次；每孔再加入100μ 1辣根過氧化物酶標記兔抗人vWF多抗，37°C溫育1小時；
(4)同上洗滌9次，每孔加入100μ 顯色液TMB，顯色10分鐘了；
(5)以50μ /孔的用量加入終止液以終止反應，在酶標儀上450 nm處測定各孔光吸收(0D 450 nm)值;
(6)計算和結果判定以正常混合血漿的7個倍比稀釋度的對數為橫坐標，相應0D450 nm值為縱坐標，作標準曲線和直線回歸方程后計算含量。結果顯示瑞斯托霉素濃度為1 mg/ml和760 μ g/ml時測定的稀釋血漿的vffF:RCof明顯高于500 μ g/ml和250 μ g/ml的 vWF:RCof。我們選擇瑞斯托霉素760 μ g/ml為試驗濃度(圖1)。(二)、測定上述vWF:RCOf -ELISA試劑盒的靈敏度分別用抗GP I ba單抗 SZ-151和國外進口的單抗2D4包板，正常混合血漿作1 :50 1 :1觀00九個倍比稀釋度，同
7樣采用上述方法檢測vWF :RCof，并以混合血漿的vWF =Rcof定為100 U/dL。結果顯示SZ-151包板的靈敏度為0. 03 U/dL (圖2)，高于2D4包板(0. 05 U/dL)。(三)、測定上述vWF:RCOf-ELISA試劑盒的重復性
(1)批內重復性同一份標本在相同條件下重復測定10次，觀察批內重復性。(2)批間重復性同一正常獻血員標本在不同時間、相同條件下進行重復試驗10次，觀察批間重復性。結果表明SZ_151包板測定血漿vWF:RiCof的批內差異和批間差異分別為7. 8% 和9. 4%，而同等條件下，2D4包板的批內差異和批間差異分別為9. 6%和12. 8%。(四)、測定上述vWF:RCOf- ELISA技術(SZ-151包板)與2D4包板方法的相關性 結果如圖4所示，表明上述vWF:RCOf -ELISA技術(SZ-151包板)與2D4包板方法具
有良好的相關性，其結果經直線回歸分析得r=0. 96 (圖3)，可見所述單抗SZ-151完全可以替代2D4包板用于檢測vWF:RiCof。(五)、用未經過純化的表達rfGPrta的CHO培養上清液代替純化的rfGPrtα蛋白進行vWF:RCof-ELISA試驗，同樣具有較好的結果，這提示今后或可直接使用未純化的CHO 培養上清液，簡化試驗步驟并避免rfGPrta蛋白在純化過程中的損失，節省成本。實施例七臨床標本采集和正常人及vWD患者的血漿VWF:RCof與vWF:CBA、 vWFAg的測定和比較。所述vWF:Ag測定方法為(奚曉東，等，1988，中華醫學檢驗雜志，12 :272-275) 包板將抗人vWF單克隆抗體SZ-四溶于包被緩沖液，以2 μ g/mL包被于96孔ELISA
板，100 μ 1/孔，4°C濕盒過夜；次日，用PBS-0. 05%Tween洗滌3次后，用封閉液200 μ 1/孔封閉，4°C濕盒過夜；次日同上洗滌3次后備用或一 20°C凍存。檢測正常混合血漿以1 :20,1 :50,1 :100,1 :200,1 :500,1 :1000六個稀釋度作為
標準曲線，100 μ L/孔，待測血漿作1 :50稀釋亦可按實際需要提高或降低稀釋度，均以0. 2% BSA-PBS為稀釋液，空白對照孔加入0. 2 %BSA-PBS溶液，37°C溫育2 h ；同上洗滌3次后加入HRP標記的抗人vWF單抗-34，10(^17孔，371溫育2 h;同上洗滌6次后以TMB顯色， 3M H2SO4終止反應，在酶標儀上測定450 nm處各孔OD值。以正常混合血漿的6個稀釋度的對數為橫坐標，相應OD值為縱坐標，作直線回歸方程后計算含量，以混合血漿的vWF =Ag定為 100 U/dL。所述vWF: CBA測定方法為(徐海燕，等，中華血液學雜志，2007，觀:637-639) 包板將牛皮膚III型膠原(Sigma公司)用包被緩沖液稀釋，以20 μ g/mL包被于96
孔ELISA板，100 μ 1/孔，4 °C濕盒過夜；次日，用PBS-0. 05%Tween洗滌3次后，用封閉液 200 μ 1/孔封閉，4°C濕盒過夜；次日同上洗滌3次后備用或一 20°C凍存。檢測正常混合血漿以1 :80,1 :160,1 :320,1 :640,1 :1280,1 :2560六個倍比稀釋度作為標準曲線，100μ L/孔，待測血漿作1 :200稀釋或根據實際需要確定稀釋度，均以m BSA-PBS為稀釋液，空白對照孔加入2%BSA-PBS溶液，37°C溫育2 h ；同上洗滌3次后加入 HRP標記兔抗人vWF多抗，37°C溫育Ih ；同上洗滌6次后以TMB顯色，3M H2SO4終止反應，在酶標儀上測定450 nm處各孔OD值。以正常混合血漿的6個稀釋度的對數為橫坐標，相應 OD值為縱坐標，作直線回歸方程后計算含量，以混合血漿的vWF =CBA定為100 U/dL。36例按國家規定體檢合格的健康志愿者(正常組)。VffD患者25例(vWD組)，符合2008年美國國家心肺和血液研究所(NHLBI)頒布的血管性血友病診斷與治療指南。
分別測定36例正常人和25例vWD患者的血菜中VWF:RCof與vWF:CBA、vffF:Ag 的含量，并分別計算VWF:RCof/vffF:Ag和vffF:RCof /vffF:CBA的比值(見表· 1.)。本研究中36名正常人血漿vWF:RCof > 50U/dL (僅兩名例外)，與vWF:Ag、vWF:CBA檢測結果一致，vffF:RCof / vWF:Ag 禾口 vffF:CBA/vffF:Ag 比值接近 1 (均值分別為 0. 92 禾口 1. 06)。1 型 vWD患者vWF:RCof <50U/dL (僅1名例外，為57 U/dL)，由于1型vWD主要是vWF量的減少而非質的缺失，vWF:Ag和vWF:CBA、vWF:RCof檢測結果較為相當，vWF:RCof / vWF:Ag禾口 vffF:CBA/vffF:Ag 比值均 >0. 7。2 型 vWD 患者 vWF: RCof 與 vWF: Ag 相比明顯更低，vWF: RCof/ vWF Ag 比值均 <0.6。3 型 vWD 患者其 vWF RCof, vWF CBA 和 vWF Ag 均極低(<5U/dL)。
表1 36名健康志愿者和25名vWD患者的血漿vWF RCof、vWF Ag及vWF CB( U/ dL)的均值(范圍)和比值
權利要求
1.一種血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子酶聯免疫試劑盒，包括固相化包被抗體的酶標板，辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，標準品，瑞斯托霉素，重組GPrt α H1-V289片段-Fc融合蛋白，樣品稀釋緩沖液，顯色液，終止液，其特征在于，所述包被抗體為抗血小板膜糖蛋白Λα的單克隆抗體SZ-151 ；所述檢測抗體為兔抗人VWF多抗；所述標準品為混合標準血漿；所述單克隆抗體SZ-151由雜交瘤細胞SZ-151制備得到，所述雜交瘤細胞SZ-151的保藏信息為保藏日期2011年5月M日；保藏單位中國典型培養物保藏中心；保藏地址 中國武漢武漢大學；保藏編號CCTCC C201131 ；分類命名雜交瘤細胞SZ-151。
2.根據權利要求1所述血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子酶聯免疫試劑盒，其特征在于，正常混合標準血漿的制備方法為(1)取外周靜脈血，采用枸櫞酸三鈉抗凝，離心后取貧血小板血漿；( 取兩名以上正常人的血漿等量混合后分裝，得到正常混合標準血漿。
全文摘要
本發明公開了一種血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子酶聯免疫試劑盒，包括固相化包被抗體的酶標板，辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，標準品，瑞斯托霉素，重組GPIbαH1-V289片段-Fc融合蛋白，樣品稀釋緩沖液，顯色液，終止液，其中，所述包被抗體為抗血小板膜糖蛋白Ibα的單克隆抗體SZ-151；所述檢測抗體為兔抗人VWF多抗；所述標準品為混合標準血漿。采用該試劑盒檢測檢測vWF:RCof時具有良好的重復性、靈敏度，且測試結果和vWF:Ag、vWF:CBA具有良好的相關性。
文檔編號G01N33/68GK102279273SQ20111020232
公開日2011年12月14日 申請日期2011年7月19日 優先權日2011年7月19日
發明者季順東, 楊劍鋒, 趙益明, 阮長耿 申請人:蘇州大學