專利名稱:一種胰島素抵抗動物模型的構建方法
技術領域:
本發明涉及一種胰島素抵抗動物模型的構建方法,具體說,是涉及一種大鼠胰島素抵抗模型的構建方法。
背景技術:
動物模型的構建是醫學研究中的一項很重要的技術。構建與人類發病相似的疾病模型,可以克服人類本身發生疾病潛伏期長、影響因素多、發生發展緩慢、發病機制復雜等因素的制約,更好地反應疾病發生、發展的規律,并有利于研究不便于在人類本身進行研究的疾病。常用的動物模型主要包括自發性動物模型、轉基因動物模型和實驗性動物模型。 自發性動物模型、轉基因動物模型應用價值較高,但其造模成本高、技術飼養條件要求高等特點限制了這些動物模型的普遍應用。實驗性動物模型操作簡單、成本低、成模率較高,目前,這類動物模型被廣泛使用。近年來,隨著人們生活方式的轉變,糖尿病的發病率逐年增加。美國糖尿病協會推測,至2030年,全球將有35億人患有糖尿病及其并發癥。最近,我國的一項調查顯示,目前我國糖尿病患病人數已達9200萬,僅次于印度。糖尿病對全球尤其是發展中國家的經濟發展產生了巨大的壓力,據統計,發展中國家用于糖尿病方面的費用支出超出了衛生費用預算的10%。糖尿病患者中90%以上是2型糖尿病患者,胰島素抵抗是2型糖尿病的基本特征。 胰島素抵抗是指肝、肌肉、脂肪等胰島素作用的靶組織,不能響應胰島素導致胰島素的功能減弱甚至缺失的病理狀態。除2型糖尿病之外,胰島素抵抗還與高血壓、動脈粥樣硬化、代謝綜合征的發生發展密切相關。因此,對胰島素抵抗的發病機制及防治研究顯得尤為重要。 目前,胰島素抵抗的發病機制還不明確,但可以確定的是,氧化應激在胰島素抵抗的發生中扮演著重要的角色。在正常的胰島素信號傳導中,胰島素與其受體結合啟動胰島素信號,激活受體內源性蛋白酪氨酸激酶活性,導致受體細胞質一側的酪氨酸磷酸化。激活的受體,又募集并磷酸化一系列底物分子。進而激活磷脂酰肌醇-3-激酶(Ph0Sph0in0Sitide-3-kinase,PI3K) /蛋白激酶B (Protein kinase B,Akt)。蛋白激酶B是胰島素信號傳導過程中的一種重要的激酶,胰島素刺激條件下其磷酸化水平的高低常被用來作為胰島素信號傳導是否正常的指標。胰島素抵抗發生時,胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平明顯降低。現有的胰島素抵抗動物模型主要是以高脂飲食長期喂養誘導,實驗周期過長,不適于進行大量胰島素抵抗防治藥物的篩選。
發明內容
本發明的目的是提供一種胰島素抵抗動物模型的構建方法成模率高,它造模周期短以及成本低的。為實現上述發明目的,本發明的技術方案如下一種胰島素抵抗動物模型的構建方法,其特征在于尾靜脈注射葡萄糖氧化酶誘導動物產生氧化應激,得到胰島素抵抗動物模型。
所述的胰島素抵抗動物模型的構建方法,它包括以下步驟
(1)選用SD大鼠,清潔級,雄性,體重180 士 220 g,動物自由攝食飲水。(2)以400 U/kg體重的劑量尾靜脈注射葡萄糖氧化酶,連續給藥三天后,得到動物模型。所述的選用SD大鼠,清潔級、雄性、體重180 士 220 g,分別標記;尾靜脈注射葡萄糖氧化酶(400 U/kg),對照組注射等量生理鹽水,自由攝食飲水。連續給藥3天后,進行腹腔注射糖耐量和胰島素耐量試驗,得到動物模型。上述方法所得到的動物模型的驗證方法包括測定腹腔注射糖耐量、胰島素耐量水平以及胰島素刺激的蛋白激酶B的磷酸化水平。血糖水平采用常規方法進行測定。腹腔注射葡萄糖耐量試驗(Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)的試驗方法為分別將正常對照組和模型組動物禁食6 小時,測定空腹血糖值,以100mg/ml葡萄糖溶液腹腔注射,葡萄糖用量為lg/kg體重,分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測定各組動物的血糖值。以各個時間點的血糖值做糖耐量曲線,對模型組和正常對照組各時間點進行t檢驗,進行統計分析。胰島素耐量試驗(Insulin tolerance test, ITT)的試驗方法為分別將正常對照組和模型組動物禁食4小時,測定空腹血糖值,腹腔注射胰島素,注射劑量為0. 75U/kg體重,分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測定各組動物的血糖值。以各個時間點的血糖值做胰島素耐量曲線,對模型組和正常對照組各時間點進行t檢驗,進行統計分析。胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平由Western blot進行測定。本發明構建的胰島素抵抗動物模型的測定結果表明模型組動物糖耐量和胰島素耐量與正常對照組動物有顯著差異,模型組動物胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平顯著降低,表明模型組動物已經發生明顯的胰島素抵抗,從而驗證了本發明建立的胰島素抵抗動物模型。本發明方法的特點為使用葡萄糖氧化酶在動物體內產生過量自由基,誘導氧化應激損傷,進而誘導胰島素抵抗的發生。應用本方法構建的胰島素抵抗動物模型具有與人類胰島素抵抗相似的特征表現,是研究胰島素抵抗和2型糖尿病發病機制以及進行防治藥物篩選的理想模型。與現有技術相比,本發明構建的大鼠胰島素抵抗模型,具有造模方法簡單、成模率高、成本低、周期短、及重現性好等優點。
下面結合實施例附圖對本發明做進一步說明
圖1腹腔注射葡萄糖耐量試驗中,模型組與正常組相比,各時間點血糖顯示圖; 圖2胰島素耐量試驗中,模型組與正常組相比,各時間點血糖顯示圖; 圖3與正常對照相比,模型組胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化顯示圖。
具體實施例方式下面通過實例對本發明做進一步說明,其目的在于更好的理解本發明的內容,而非限制本發明的保護范圍。
實施例1
(1)選用SD大鼠,清潔級,雄性,體重180 士 220 g,動物自由攝食飲水。(2)以400 U/kg體重的劑量尾靜脈注射葡萄糖氧化酶,連續給藥三天后,得到動物模型。所述的選用SD大鼠,清潔級、雄性、體重180 士 220 g,分別標記;尾靜脈注射葡萄糖氧化酶(400 U/kg),對照組注射等量生理鹽水,自由攝食飲水。連續給藥3天后,進行腹腔注射糖耐量和胰島素耐量試驗,得到動物模型。上述方法所得到的動物模型的驗證方法包括測定腹腔注射糖耐量、胰島素耐量水平以及胰島素刺激的蛋白激酶B的磷酸化水平。血糖水平采用常規方法進行測定。腹腔注射葡萄糖耐量試驗(Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)的試驗方法為分別將正常對照組和模型組動物禁食6 小時,測定空腹血糖值,以100mg/ml葡萄糖溶液腹腔注射,葡萄糖用量為lg/kg體重,分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測定各組動物的血糖值。以各個時間點的血糖值做糖耐量曲線,對模型組和正常對照組各時間點進行t檢驗,進行統計分析。實施例2
1.實驗儀器
血糖測定儀(美國強生公司)、精密電子天平、Iml注射器等。2.實驗動物與材料
2.1實驗動物
SD大鼠,清潔級,雄性,體重180 士 220 g,有第四軍醫大學實驗動物中心提供。2.2實驗材料
葡萄糖氧化酶、生理鹽水、苦味酸、血糖試紙、胰島素、葡萄糖。3.實驗方法
30只SD大鼠隨機分為正常對照組和模型組,各15只。以400U/kg的劑量尾靜脈注射葡萄糖氧化酶(生理鹽水溶解,600U/ml),對照組注射相同體積生理鹽水。連續給藥三天后, 于第4天,正常對照組和模型組各取10只動物,進行腹腔注射葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗。腹腔注射葡萄糖耐量試驗(Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT) 的試驗方法為分別將正常對照組和模型組動物禁食6小時,測定空腹血糖值,以100mg/ml 葡萄糖溶液腹腔注射,葡萄糖用量為lg/kg體重,分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測定各組動物的血糖值。以各個時間點的血糖值做糖耐量曲線,對模型組和正常對照組各時間點進行t檢驗,進行統計分析。胰島素耐量試驗(Insulin tolerance test, ITT)的試驗方法為分別將正常對照組和模型組動物禁食4小時,測定空腹血糖值,腹腔注射胰島素,注射劑量為0. 75U/kg體重,分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測定各組動物的血糖值。以各個時間點的血糖值做胰島素耐量曲線,對模型組和正常對照組各時間點進行t檢驗,進行統計分析。正常對照組和模型組各取5只動物,以10IU/kg的劑量腹腔注射胰島素,45分鐘后,處死動物,取肝臟進行Western blot試驗,檢測蛋白激酶B的磷酸化水平。4.實驗結果
4. 1如圖1所示,腹腔注射葡萄糖耐量試驗中,模型組與正常組相比,各時間點血糖水平差異顯著。
4. 2如圖2所示,胰島素耐量試驗中,模型組與正常組相比,各時間點血糖水平差異顯著。4.3如圖3所示,與正常對照相比,模型組胰島素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平明顯降低。可見,本發明利用尾靜脈注射葡萄糖氧化酶誘導胰島素抵抗動物模型是可行的, 該模型可作為胰島素抵抗以及2型糖尿病的發病機制和藥物作用機理研究模型。
權利要求
1.一種胰島素抵抗動物模型的構建方法,其特征在于尾靜脈注射葡萄糖氧化酶誘導動物產生氧化應激,得到胰島素抵抗動物模型。
2.根據權利要求書1所述的一種胰島素抵抗動物模型的構建方法,其特征在于包括以下步驟1)選用SD大鼠,清潔級,雄性,體重180士 220 g,動物自由攝食飲水;2)以400U/kg體重的劑量尾靜脈注射葡萄糖氧化酶,連續給藥三天后,得到動物模型。
3.根據權利要求書2所述的一種胰島素抵抗動物模型的構建方法,其特征在于所述的選用SD大鼠,清潔級、雄性、體重180 士 220 g,分別標記;尾靜脈注射葡萄糖氧化酶 (400 U/kg),對照組注射等量生理鹽水,自由攝食飲水;連續給藥3天后,進行腹腔注射糖耐量和胰島素耐量試驗,得到動物模型。
4.根據權利要求書1所述的一種胰島素抵抗動物模型的構建方法,其特征在于上述方法所得到的動物模型的驗證方法包括測定腹腔注射糖耐量、胰島素耐量水平以及胰島素刺激的蛋白激酶B的磷酸化水平。
5.根據權利要求書1所述的一種胰島素抵抗動物模型的構建方法,其特征在于血糖水平采用常規方法進行測定,即腹腔注射葡萄糖耐量試驗的試驗方法為分別將正常對照組和模型組動物禁食6小時,測定空腹血糖值,以100mg/ml葡萄糖溶液腹腔注射,葡萄糖用量為lg/kg體重,分別于30分鐘、60分鐘、120分鐘測定各組動物的血糖值;以各個時間點的血糖值做糖耐量曲線,對模型組和正常對照組各時間點進行t檢驗,進行統計分析。
全文摘要
本發明涉及一種胰島素抵抗動物模型的構建方法,具體指利用SD大鼠,尾靜脈注射葡萄糖氧化酶(400U/kg體重)誘導產生胰島素抵抗。對糖耐量和胰島素耐量的統計分析以及胰島素信號傳導的測定表明本發明利用葡萄糖氧化酶構建的胰島素抵抗大鼠模型是可行的,可作為胰島素抵抗以及2型糖尿病的發病機制和藥物作用機理的研究模型。與現有的模型構建技術相比,本發明構建的胰島素抵抗大鼠模型具有造模方法簡單、成模率高、成本低、周期短、及重現性好等優點。
文檔編號G01N33/66GK102228700SQ20111017593
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月28日 優先權日2011年6月28日
發明者海春旭, 王欣 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學