專利名稱：一種甲胎蛋白的均相時間分辨熒光分析方法
技術領域：
本發明屬于生物分析化學、納米生物技術領域，具體涉及生物物質的免疫測定法。
背景技術：
人體甲胎蛋白(AFP)來源于胎兒的糖蛋白，分子量約為70KDa，成人的甲胎蛋白可由惡性腫瘤產生，特別是肝癌和胚胎細胞腫瘤，70-95 %的原發性肝癌患者血清中AFP含量有明顯升高，在肝炎和肝硬化的患者中甲胎蛋白也常有輕微的升高。因此，對AFP的臨床分子診斷顯得十分重要，其中的最低靈敏度檢測對及早發現腫瘤并制定治療方案尤為重要。目前，測定AFP免疫檢測方法較多，最常用的血清檢測方法有酶免疫法(EIA)、放射免疫法(RIA)、化學發光法以及時間分辨免疫熒光分析法 (TRFIA)。其中，酶標法為半定量試劑，在準確性、靈敏度上存在很大的局限性，并且對于酶的活性極易受標記反應以及溫度、PH值及溶液中離子濃度等因素的影響、線性范圍窄、費事等缺點；放射性免疫法操作帶放射性以及標志物放置時間短，試劑有效期較短等缺點；化學發光法的優點是靈敏度高、線性范圍寬、分析時間短，但它的缺點化學發光的產生通常是瞬間完成的，發光峰值很快衰減，而且成本較高；溫度和PH值對發光有很大影響等，這些因素影響了該類方法的進一步使用。TRFIA以稀土離子作為標記物，具有制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、重復性好、操作流程短、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應用范圍十分廣泛等優點；但是，因為需要沖洗未標記物，操作較為繁瑣，很難高通量化和微量化。這些方法為非均相分析方法，雖然其檢測性能也都能滿足臨床要求，但靈敏度相對依然較低。非均相分析方法一般是在一個固定的平臺上反應，然后，通過沖洗的方法將游離而未參與免疫反應的標記物除去，然后檢測剩余的有效標記物。伴有沖洗的方法，不僅可能破壞有效標記物，而致使靈敏度不高，不僅費事，操作也較為繁瑣，很難高通量化、自動化和微量化。而均相時間分辨熒光分析就可以克服這些缺點，分析操作簡單，不需要洗滌分離游離標記物，分析速度快，易自動化等優點，在生物分析領域其應用越來越廣泛。現有均相時間分辨熒光分析(HTRFA)技術，能量供體與受體是一對一的分子相互作用形成能量轉移，從而實現定性定量分析。其技術難題在于一對一的分子能量共振能量轉移(FRET)效率很低，供體的能量不能充分利用，其靈敏度受到一定的限制。導致FRET效率低下還有一個原因就是，目前這些分析方法用到的能量受體是熒光素(fluorescein)、青色素(cyanine，cy)，亞歷克撒染料(Alexa)，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)或別藻紅蛋白 (allophycocyanin, APC)等有機染料。盡管有機染料已使用數十載，然而，眾所周知，有機染料致命的缺點就是光譜的^ock位移比較短，熒光發射峰不對稱且有明顯拖尾，最致命的是抗光漂白性極差，使得基于熒光值分析測試方法的生物分析，尤其是HTRFA很不穩定， 效率低下，間內和間外分析偏差較大。因此，有機染料并非HTRFA能量受體的最佳選擇。另一方面，現有HTRFA技術得以實現歸功于稀土金屬螯合物的使用，一般的能量供體是稀土金屬銪螯合物，要求能量受體發射近紅外波(比如665nm)，這需要昂貴的近紅外敏感檢測器件。即使使用鋱螯合物，由于大多數有機染料熒光發射光譜寬而且有明顯拖尾，與鋱螯合物時間分辨熒光譜有較大重疊，僅適合在長波長或近紅外波段進行分析，對昂貴的近紅外敏感檢測器要求依然存在。因此，為彌補現有技術的不足，需改變現有技術能量配體一對一的方式，采用一個能量供體同時向數個能量受體同時進行時間分辨能量轉移。更需要尋求一種具有新奇的光學特性的能量受體其光譜的Stock位移比較寬，熒光發射峰對稱且無明顯拖尾，更重要的是抗光漂白性極強，而且該能量受體不依賴于昂貴的紅敏檢測器。
發明內容
鑒于現有技術的不足，本發明所要解決的技術問題是提供一種甲胎蛋白的均相時間分辨熒光分析方法，該方法特異性強和檢測靈敏度高。本發明解決上述問題采用的技術方案是，一種甲胎蛋白的均相時間分辨熒光分析方法，該方法由以下步驟組成 (a)定量標準曲線制備將HFRFA能量受體、HFRFA能量供體和甲胎蛋白標準品一起孵育，進行均相時間分辨熒光檢測和分析，得到甲胎蛋白濃度與熒光值的標準曲線；(b)樣品檢測將HFRFA能量受體、HFRFA能量供體和待測甲胎蛋白樣品一起孵育， 進行均相時間分辨熒光檢測和分析，將檢測樣品得到的熒光值與步驟(a)得到的標準曲線比較計算待測甲胎蛋白樣品濃度；其中，所述的HFRFA能量受體由以下方法制備得到(I)將水溶性量子點、物質的量為水溶性量子點0. 02倍的三辛基膦和CPs納米乳膠球加入熱溶脹劑中，用0. IMNaOH調整溶液pH為9，其中水溶性量子點濃度為0. 25 μ Μ, CPs納米乳膠球濃度為2mg/mL ；在105度下反應30min，冷卻到室溫，離心沉淀分離得到量子點納米乳膠球；所述的熱溶脹劑由苯甲醇，乙二醇和水組成，三者之間的體積比為苯甲醇乙二醇水=1 1.4 0. 15 ；(II)將分子量為IOOkDa的氨基化葡聚糖水溶膠在1_乙基-(3_二甲基氨基丙基) 碳酰二亞胺鹽酸鹽作用下與量子點納米乳膠球偶聯，透析分離，得到量子點納米水溶膠；(III)在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽作用下將量子點納米水溶膠與甲胎蛋白抗原的單克隆抗體EOlO偶聯，得到HFRFA能量受體；所述的HFRFA能量供體由以下方法制備得到將稀土金屬鋱螯合物與待測抗原的單克隆抗體E014偶聯，得到HFRFA能量供體。本發明所述的水溶性量子點是本領域常用的水溶性量子點，可以依據本領域常用的方法制備得到。本發明推薦的制備方法是將巰基丁二酸和油溶性量子點按照摩爾比為 1000 15加入三氯甲烷中，混合均勻后加入氫氧化鈉調整PH為9，室溫反應2小時；反應結束后加入去離子和丙酮，沉淀，離心，即得到水溶性量子點。本發明所述的油溶性量子點可以是硒化鎘、硫化鎘或碲化鎘為核的各種半導體納米晶體，其發射波長為525nm，565nm, 605nm或者635nm，其中以美國hvitrogen公司的核殼型硒化鎘/硫化鋅量子點為最好。
本發明所述的CPs納米乳膠是Thermo Fisher kientific公司的聚苯乙烯-二乙烯基苯羧酸改性膠乳。HTRFA是稀土螯合物，其優異的時間分辨熒光性質結合量子點的抗光漂白性及其特異性光學性質，大大提高了能轉移效率，克服了水溶膠表面基團對能量轉移的空間障礙; 同時，因為納米水溶膠表面有多個稀土螯合物同時向量子點進行能量轉移，大大提高了檢測的靈敏度。本發明所述的功能量子點納米水溶膠的均相時間分辨分析方法是一種利用時間分辨熒光共振能量轉移原理進行的免疫分析血清中的甲胎蛋白抗原的分析方法，在該分析方法中，采用雙抗體夾心一步法，將能量受體與供體偶聯到抗原的兩個單克隆抗體上，借助抗體與抗原的免疫反應，將能量受體與供體靠近，當受體的激發波譜與供體的發射波譜有較大重疊時，即可發生時間分辨熒光共振能量轉移(HTR-FRET)。根據熒光共振能量轉移原理，本發明使用到的稀土鋱金屬螯合物與量子點之間發生能量轉移的佛斯特距離(F0rster distance)為
權利要求
1.一種甲胎蛋白的均相時間分辨熒光分析方法，該方法由以下步驟組成(a)定量標準曲線制備將HFRFA能量受體、HFRFA能量供體和甲胎蛋白標準品一起孵育，進行均相時間分辨熒光檢測和分析，得到甲胎蛋白濃度與熒光值的標準曲線；(b)樣品檢測將HFRFA能量受體、HFRFA能量供體和待測甲胎蛋白樣品一起孵育，進行均相時間分辨熒光檢測和分析，將檢測樣品得到的熒光值與步驟(a)得到的標準曲線比較計算待測甲胎蛋白樣品濃度；其中，所述的HFRFA能量受體由以下方法制備得到(I)將水溶性量子點、物質的量為水溶性量子點0.02倍的三辛基膦和CPs納米乳膠球加入熱溶脹劑中，用0. IMNaOH調整溶液pH為9，其中水溶性量子點濃度為0. 25 μ Μ, CPs納米乳膠球濃度為2mg/mL ；在105度下反應30min，冷卻到室溫，離心沉淀分離得到量子點納米乳膠球；所述的熱溶脹劑由苯甲醇，乙二醇和水組成，三者之間的體積比為苯甲醇乙二醇水=1 1. 4 0. 15 ；(II)將分子量為IOOkDa的氨基化葡聚糖水溶膠在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽作用下與量子點納米乳膠球偶聯，透析分離，得到量子點納米水溶膠；(III)在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽作用下將量子點納米水溶膠與甲胎蛋白抗原的單克隆抗體EOlO偶聯，得到HFRFA能量受體；所述的HFRFA能量供體由以下方法制備得到將稀土金屬鋱螯合物與待測抗原的單克隆抗體E014偶聯，得到HFRFA能量供體。
2.根據權利要求1所述的一種甲胎蛋白的均相時間分辨熒光分析方法，其特征在于， 所述的水溶性量子點由以下方法制備得到將巰基丁二酸和hvitrogen公司的核/殼型硒化鎘/硫化鋅量子按照摩爾比為1000 15加入三氯甲烷中，混合均勻后加入氫氧化鈉調整PH為9，室溫反應2小時；反應結束后加入去離子和丙酮，沉淀，離心，即得。
全文摘要
本發明涉及生物分析化學分析領域，具體涉及一種甲胎蛋白的均相時間分辨熒光分析方法，該方法由以下步驟組成(a)定量標準曲線制備將HFRFA能量受體、HFRFA能量供體和甲胎蛋白標準品一起孵育，進行均相時間分辨熒光檢測和分析，得到甲胎蛋白濃度與熒光值的標準曲線；(b)樣品檢測將HFRFA能量受體、HFRFA能量供體和待測甲胎蛋白樣品一起孵育，進行均相時間分辨熒光檢測和分析，將檢測樣品得到的熒光值與步驟(a)得到的標準曲線比較計算待測甲胎蛋白樣品濃度。本發明所述的方法具有特異性強和檢測靈敏度高的優點，在臨床分子診斷和食品檢測等生物化學分析中具有非常重要的意義。
文檔編號G01N33/68GK102353790SQ20111017455
公開日2012年2月15日 申請日期2011年6月25日 優先權日2011年6月25日
發明者劉天才, 吳英松, 李明 申請人:南方醫科大學