專利名稱：一種基于量子點和金屬配合物均相免疫檢測病毒的方法
技術領域：
本發明涉及生物、醫學、材料、化學、病毒學等學科的交叉學科領域，更具體涉及一種基于量子點和金屬配合物均相免疫檢測病毒的方法。
背景技術：
檢測病毒常采用酶聯免疫吸附分析法(ELISA)，該法雖然選擇性好，但是操作步驟多，費時費力，成本高。采用均相免疫反應進行病毒檢測和疾病診斷，具有快速、靈敏、 特異等優點。近年來，由于量子點技術的興起，不少研究者將量子點技術引入到病毒檢測中，但他們用的大多是有機相量子點，由于有機相量子點合成產量有限，大規模使用受到限制。另外，合成有機相量子點需使用有毒的有機溶劑，容易對人體健康產生危害并對環境造成污染。不僅如此，該量子點在進行水溶性化轉化中熒光性能還會受到影響。為解決以上問題，申請人合成了一系列摻雜Si的CdTe量子點CdTe :Ζη2+，將此綠色熒光量子點作為熒光敏感材料，用紅色熒光的金屬配合物標記的抗體作為熒光猝滅劑和熒光強度參照物。由于量子點和金屬配合物可用同一激發波長激發，故在同一激發波長激發下，熒光信號表現為綠色和紅色的混合色，當加入抗體所對應的抗原(病毒)后，綠色熒光信號不斷增強，紅色熒光信號保持不變并可作為熒光強度參照，根據綠色熒光信號的強度以及它和紅色熒光強度的比值便可實現病毒濃度快速、靈敏、特異的檢測。這是一種雙色熒光的病毒檢測方法，迄今未見有類似報道。文獻有關于雙色發光氧傳感器的報道(Angew. Chem. 2008，120， 7560-7563)，但正如報道中作者所指出的(Angew. Chem. Int. Ed. 2010，49，4907-4909)，該傳感器需復雜的設備進行傳感和成像，并且在他們的傳感器中，所用的熒光參照物是量子點， 由于其對環境因素變化很敏感，故不能保證該傳感器的定量精度和準確度。而本申請采用金屬配合物作為熒光參照物，穩定性好、易于保存，可在不同環境條件下作為良好的熒光參照物。
發明內容
針對現有技術中存在的不足，本發明的目的在于提供一種基于量子點和金屬配合物均相免疫檢測病毒的方法。采用量子點為熒光信號輸出材料，檢測靈敏度高；金屬配合物作為熒光參照物，穩定性好；金屬配合物標記抗體(Ru-Ab)與待測抗原免疫反應進行檢測， 特異性強。首先將一定量的量子點與Ru-Ab混合，量子點的熒光被猝滅，而Ru-Ab的熒光強度保持不變；加入1. 8-210ng/ml病毒后，量子點的熒光回升，而Ru-Ab的熒光強度仍然保持不變，這樣既可根據量子點的熒光強度變化對病毒含量進行準確定量，還可以根據量子點與Ru-Ab的熒光強度的比值對病毒含量進行半定量檢測，同時還可以在紫外分析儀中用紫外燈激發樣品溶液進行拍照，得到可視化的圖片，通過顏色變化對病毒進行半定量檢測。為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施一種基于量子點和金屬配合物均相免疫檢測病毒的方法，其步驟如下(1)將量子點溶解于溶劑中，得到量子點濃度為1. OX 10~8 1. OX 10-6mol/L的溶液A。所述量子點為CdSe、CdTe, CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、 CdSe :Mn2+、CdTe :Mn2+、CdSe :Zn2+ 或 CdTe :Zn2+。(2)將金屬配合物與抗體的偶聯物溶解于溶劑中，配制成偶聯物濃度為 1. 0Χ1(Γ7 1. 0Xl(T5mol/L 的溶液 B。所述金屬配合物為釕(II)配合物、錸(I)配合物或銥(III)配合物。所述步驟(1)和(2)中的溶劑為水或15mMpH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液(簡稱“PBS 溶液”)。所述抗體為待測病毒的單克隆抗體。(3)取6μ L溶液A與一定量的溶液B混合，然后用水或0. Olmol · 17 ! . 0的磷酸鹽緩沖溶液定容到600 μ L得溶液C，溶液A和溶液B的比例按量子點和金屬配合物與抗體的偶聯物的摩爾比1 10 1 20計。(4)取溶液C500 1000 μ L于微量熒光比色皿中，以激發波長280 480nm激發， 測量其在發射波長350 700nm處的熒光強度。(5)加入不同濃度的待測病毒于前述的溶液C中，以相同的激發波長激發，測量其在同一發射波長處的熒光強度。(6)將量子點的熒光強度回升值對應于病毒濃度作圖，可以得到定量檢測病毒的工作曲線；或將比色皿放置于紫外分析儀中，用紫外燈激發樣品溶液，觀察到不同顏色，用數碼相機拍照，通過溶液顏色變化對病毒進行半定量檢測。本方法用于人體腸道病毒EV71的檢測，可在1-15分鐘內完成。在進行實際樣品檢測時，將處理好的待測病毒溶液加入到溶液C中，以相同的激發波長激發，測量其在同一發射波長處的熒光強度，以量子點的熒光強度回升值帶入工作曲線即可進行定量分析；或用紫外燈激發樣品溶液，并用數碼相機拍照，通過溶液顏色變化即可實現病毒的半定量檢測。本發明方法與現有技術相比，具有以下優點和效果與酶聯免疫吸附分析及芯片技術相比，本方法靈敏度高、簡便快速、選擇性好、通用性強。將本方法應用于抗原-抗體反應檢測病毒，將使現有的標準檢測技術發生根本性變革。如果一種生物分子如抗體或抗原，既可以作為熒光增強劑或猝滅劑，又可以通過與對應的抗原或抗體的特異性相互作用改變體系的熒光特性，便可以建立一種通用的免疫檢測技術。基于量子點和金屬配合物均相免疫熒光檢測病毒的方法將實現生物樣品如人體腸道病毒EV71，SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血熱病毒、柯薩奇B3病毒的實時、快速、均相、靈敏及選擇性檢測。本發明的檢測方法響應快，親水性好，靈敏度高，選擇性好，通用性強。
圖1為CdTe =Zn2+量子點(QDs)的紫外吸收和熒光發射光譜圖；其中曲線a為紫外吸收光譜圖，曲線b為熒光發射光譜圖。圖2為溶液pH變化對QDs (3. 2 X 10_8mol · Γ1)熒光強度的影響；(pH3. 0 9. 0 :15mMPBS 緩沖溶液)。
圖3中曲線a和b分別為實施例1中的釕(II)配合物的熒光激發光譜熒光發射光譜。圖4為本發明方法對人體腸道病毒EV71的響應特異性。激發波長460歷，發射波長6IOnm (實施例1)。圖5為人體腸道病毒EV71免疫熒光檢測過程的示意圖；量子點受到金屬配合物與抗體的偶聯物的影響使熒光猝滅，加入抗原EV71后，由于抗體-抗原間的特異性相互作用，使熒光回升。圖6為定量檢測人體腸道病毒EV71的熒光圖(實施例1)。圖7為定量檢測人體腸道病毒EV71的工作曲線(實施例1)。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明方法作進一步的描述，以便本領域的技術人員進一步理解本發明，但以下實施例并不以任何形式限制本發明。實施例1 一種基于量子點和金屬配合物均相免疫檢測病毒的方法，其步驟為(1)合成 CcTTe =Zn2+ 量子點合成方法參照中國專利申請201110070290. 3，申請日2011年3月23日，具體步驟為配制作為碲源的NaHTe或KHTe溶液將摩爾比為2 5 1的NaBH4或KBH4和Te粉置于水中，0 50°C下攪拌反應5 20h，得到NaHTe或KHTe溶液；在三頸燒瓶中配制Cd2+、 Zn2+和水溶性巰基化合物的混合溶液，其中Cd2+濃度為0. 001 0. 05mol/L,調節溶液的pH 值至7 11后，通氬氣10 40min除氧氣，注入前面制備好的NaHTe或KHTe溶液，混勻后轉入水熱反應釜中，加熱到160 200°C，反應30 150min，得到量子點溶液；向所得CdTe Si2+量子點溶液中加入3倍體積的異丙醇進行沉淀，離心分離出上清液后，再用異丙醇洗滌、離心3次，得到固體沉淀，將固體沉淀放入真空干燥箱干燥24h后取出，即得CdTe =Zn2+ 量子點，置于4°C下保存。將制備的CdTe =Zn2+量子點溶解于水，得濃度為1. 0 X 10_6mol/L反應液A ；(2)將釕(II)配合物-雙(聯吡啶)-4'-甲基-4-羰基吡啶釕-N-琥珀酰亞胺酯雙六氟磷酸酯(Ru(bpy)2(mCbpy-0-Su-ester) (PF6)2)與EV71病毒單克隆抗體按照摩爾比30 1偶聯作為熒光猝滅劑溶于水中，得偶聯物濃度為2.6 X 10_6mol/L的反應液B;(3)取反應液A6 μ L，反應液Β6 μ L及588 μ L水混和，得溶液C ；(4)取溶液C600y L于微量熒光比色皿中，以激發波長280 480nm激發，測量其在發射波長350 700nm處的熒光強度，得到量子點被Ru-Ab猝滅后的熒光強度；(5)加入3 μ L不同濃度的被測樣品EV71病毒于前述溶液C中，以相同的激發波長激發，測量其在同一發射波長處的熒光強度，得到病毒使量子點熒光回升的熒光強度；(6)根據量子點的熒光強度回升值對EV71病毒濃度作圖，可以得到定量檢測EV71 病毒的工作曲線。該熒光均相免疫檢測EV71病毒的方法靈敏度達到0. 64ng/ml，線性范圍為 1. 8-210ng/mL·加標回收實驗表明回收率在98. 4% -101. 7%之間，重現性好。檢測速度快， 僅需要15分鐘。并且，該病毒檢測還可以通過在紫外分析儀中拍照進行半定量檢測，可以明顯地看到加入不同濃度的病毒EV71后，溶液顏色由紅色變成黃色再變成綠色，檢測范圍為 lOng/ml-lOy g/ml，檢測下限為 10ng/ml。實施例2 一種基于量子點和金屬配合物均相免疫檢測病毒的方法，其步驟為(1)按照文獻 horg. Chem. 2009，48，9723-9731 的方法制備出 CdTe/CdSe/SiS 量子點，將制備的CdTe/CdSe/ZnS量子點溶解于15mMpH8. 0的PBS溶液中，得量子點濃度為
1.(^10_8!1101/1反應液六；(2)將錸⑴配合物——雙(聯吡啶)-4'-甲基-4-羰基吡啶錸-N-琥珀酰亞胺酯雙六氟磷酸酯(Re (bpy)2(mcbpy-0-Su-ester) (PF6)2)與柯薩奇B3病毒單克隆抗體按照摩爾比30 1偶聯作為熒光猝滅劑溶于15mMpH8.0的PBS溶液中，得偶聯物濃度為1. OX 10_7mol/L的反應液B ；(3)取反應液A6 μ L，反應液Β6 μ L及0. Olmol · L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH = 8. 0) 定容到600 μ L，得混合溶液C ；(4)取混合溶液C600y L于微量熒光比色皿中，以激發波長280 480nm激發，測量其在發射波長350 700nm處的熒光強度。(5)加入3 μ L不同濃度的被測樣品柯薩奇Β3病毒于前述混合溶液C中，以相同的激發波長激發，測量其在同一發射波長處的熒光強度。(6)根據量子點回升的熒光強度值對柯薩奇Β3病毒濃度作圖，可以得到定量檢測柯薩奇Β3病毒的工作曲線。該熒光均相免疫檢測柯薩奇Β3病毒的方法靈敏度達到0. 80ng/ml，線性范圍為
2.0-200ng/mL·加標回收實驗表明回收率在97. 2% -103. 4%之間，重現性好。檢測速度快， 僅需要15分鐘。并且，該病毒檢測還可以通過在紫外分析儀中拍照進行半定量檢測，可以明顯看到加入不同濃度的柯薩奇B3病毒后，溶液顏色由紅色變成黃色再變成綠色，檢測范圍為 20ng/ml-200y g/ml，檢測下限為 20ng/ml。實施例3一種基于量子點和金屬配合物均相免疫檢測病毒的方法，其步驟為(1)按照文獻 J. Phys. Chem. C 2009，113，1293-1300 制備 CdTe 量子點，將制備的 CdTe量子點溶解于水，得濃度為5. 0 X 10_7mol/L得到反應液A ；(2)將銥(III)配合物——雙(聯吡啶)-4'-甲基-4-羰基吡啶銥-N-琥珀酰亞胺酯雙六氟磷酸酯(Ir(bpy)2(mCbpy-0-SU-ester) (PF6)2)與禽流感病毒單克隆抗體按照摩爾比30 1偶聯作為熒光猝滅劑溶于水中，得偶聯物濃度為5.0 X 10_6mol/L的反應液B;(3)取反應液A6 μ L、反應液Β6 μ L混合，然后用水定容到600 μ L，得混合溶液C ；(4)取混合溶液C600y L于微量熒光比色皿中，以激發波長280 480nm激發，測量其發射波長350 700nm處的熒光強度。(5)力卩入3 μ L不同濃度的被測樣品禽流感病毒于前述混合溶液C中，以相同的激發波長激發，測量其在同一發射波長處的熒光強度。(6)根據量子點回升的熒光強度值對禽流感病毒濃度作圖，可以得到定量檢測禽流感病毒的工作曲線。該熒光均相免疫檢測禽流感病毒的方法靈敏度達到O.Mng/ml，線性范圍為
3.0-320ng/mL·加標回收實驗表明回收率在93. 2% -108. 2%之間，重現性好。檢測速度快，僅需要15分鐘。并且，該病毒檢測還可以通過在紫外分析儀中拍照進行半定量檢測，可以明顯看到加入不同濃度的禽流感病毒后，溶液顏色由紅色變成黃色再變成綠色，檢測范圍為 15ng/ml-150y g/ml，檢測下限為 15ng/ml。實施例4一種基于量子點和金屬配合物均相免疫檢測病毒的方法，其步驟為(1)按照文獻 Chem. Commun.，2008，2106-2108 制備 CdSe/ZnS 量子點，將制備的 CdSe/ZnS量子點溶解于15mMpH8. 0的PBS溶液中，得量子點濃度為5. 0 X 10_8mOl/L的反應液A ；(2)將釕(II)配合物——雙(聯吡啶)-4'-甲基-4-羰基吡啶釕-N-琥珀酰亞胺酯雙六氟磷酸酯(Ru(bpy)2(mcbpy-0-SU-ester) (PF6)2)與炭疽病毒單克隆抗體按照摩爾比 30 1偶聯作為熒光猝滅劑溶于15mMpH8. 0的PBS溶液中，得偶聯物濃度為5. 0 X IO^mol/ L的反應液B ；(3)取反應液A6 μ L、反應液B6 μ L混合，然后用0. 015mol · L—1磷酸鹽緩沖溶液 (pH = 8. 0)定容到600 μ L得混合溶液C ；(4)取混合溶液C600y L于微量熒光比色皿中，以激發波長280 480nm激發，測量其在發射波長350 700nm處的熒光強度。(5)加入3 μ L不同濃度的被測樣品炭疽病毒于前述混合溶液C中，以相同的激發波長激發，測量其在同一發射波長處的熒光強度。(6)根據量子點回升的熒光強度值對炭疽病毒濃度作圖，可以得到定量檢測炭疽病毒的工作曲線。該熒光均相免疫檢測炭疽病毒的方法靈敏度達到0.35ng/ml，線性范圍為 1. 2-350ng/ml。加標回收實驗表明回收率在95. 3% -102. 6%之間，重現性好。檢測速度快， 僅需要15分鐘。并且，該病毒檢測還可以通過在紫外分析儀中拍照進行半定量檢測，可以明顯看到加入不同濃度的炭疽病毒后，溶液顏色由紅色變成黃色再變成綠色，檢測范圍為 Mng/ml-240y g/ml，檢測下限為 Mng/ml。實施例5一種基于量子點和金屬配合物均相免疫檢測病毒的方法，其步驟為(1)按照文獻 J. AM. CHEM. S0C. 2004,126，1擬6_1927 制備 CdTe/ZnS 量子點，將制備的CdTe/ZnS量子點溶解于水，得濃度為3. 0 X 10_8mol/L反應液A ；(2)將釕(II)配合物——雙(聯吡啶)-4'-甲基-4-羰基吡啶釕-N-琥珀酰亞胺酯雙六氟磷酸酯(Ru(bpy)2(mCbpy-0-Su-ester) (PF6)2)與出血熱病毒單克隆抗體按照摩爾比30 1偶聯作為熒光猝滅劑溶于水中，得濃度為4.0X10_7mol/L反應液B;(3)取反應液A6 μ L，反應液Β6 μ L并用水定容到600 μ L中，得混合溶液C ；(4)取混合溶液C600y L于微量熒光比色皿中，以激發波長280 480nm激發，測量其在發射波長350 700nm處的熒光強度。(5)力Π入3 μ L不同濃度的被測樣品出血熱病毒于前述混合溶液C中，以相同的激發波長激發，測量其在同一發射波長處的熒光強度。(6)根據量子點回升的熒光強度值對出血熱病毒濃度作圖，可以得到定量檢測出血熱病毒的工作曲線。
該熒光均相免疫檢測出血熱病毒法靈敏度達到0.45ng/ml，線性范圍為
2.0-200ng/ml。加標回收實驗表明回收率在95. 2% -102. 7%之間，重現性好。檢測速度快， 僅需要15分鐘。并且，該病毒檢測還可以通過在紫外分析儀中拍照進行半定量檢測，可以明顯看到加入不同濃度的出血熱病毒后，溶液顏色由紅色變成黃色再變成綠色，檢測范圍為 36ng/ml-360y g/ml，檢測下限為 36ng/ml。實施例6一種基于量子點和金屬配合物均相免疫檢測病毒的方法，其步驟為(1)按照文獻 Adv. Mater. 2008,20,3416-3421 制備 CdTe/CdS/ZnS 量子點，將制備的CdTe/CdS/ZnS量子點溶解于水，得量子點濃度為8. 0 X 10_7mol/L的反應液A ；(2)將銥(III)配合物——雙(聯吡啶)-4'-甲基-4-羰基吡啶銥-N-琥珀酰亞胺酯雙六氟磷酸酯(Ir(bpy)2(mCbpy-0-Su-ester) (PF6)2)與艾滋病病毒單克隆抗體按照摩爾比30 1偶聯作為熒光猝滅劑溶于水中，得偶聯物濃度為8.0 X 10_6mol/L的反應液B;(3)取反應液A6 μ L、反應液Β6 μ L混合，然后用水定容到600 μ L，得混合溶液C ；(4)取混合溶液C600y L于微量熒光比色皿中，以激發波長280 480nm激發，測量其在發射波長350 700nm處的熒光強度。(5)加入3 μ L不同濃度的被測樣品艾滋病病毒于前述混合溶液C中，以相同的激發波長激發，測量其在同一發射波長處的熒光強度。(6)根據量子點回升的熒光強度值對艾滋病病毒濃度作圖，可以得到定量檢測艾滋病病毒的工作曲線。該熒光均相免疫檢測艾滋病病毒的方法靈敏度達到0.38ng/ml，線性范圍為
3.4-340ng/mL·加標回收實驗表明回收率在96. 2% -108. 2%之間，重現性好。檢測速度快， 僅需要15分鐘。并且，該病毒檢測還可以通過在紫外分析儀中拍照進行半定量檢測，可以明顯看到加入不同濃度的艾滋病病毒后，溶液顏色由紅色變成黃色再變成綠色，檢測范圍為 ^ng/ml-280y g/ml，檢測下限為 ^ng/ml。
權利要求
1.一種基于量子點和金屬配合物均相免疫檢測病毒的方法，其步驟如下(1)將量子點溶解于溶劑中，得到量子點濃度為1.OX 10_8-1. OX 10_6mol/L的溶液A ；所述的量子點為水溶性量子點；(2)將金屬配合物與抗體的偶聯物溶解于溶劑中，配制成偶聯物濃度為 1.0X 1(Γ7-1· 0X l(rtiol/L 的溶液 B ；所述金屬配合物為釕(II)配合物、錸(I )配合物或銥(III)配合物；所述步驟(1)和(2)中的溶劑為水或15mM pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液；所述抗體為待測病毒的單克隆抗體；(3)取6mL溶液A與一定量的溶液B混合，然后用水或0. Olmol-L"1 pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液定容到600mL得溶液C，溶液A和溶液B的比例按量子點和金屬配合物-抗體偶聯物摩爾比1:10 - 1:20計;(4)取溶液C500-1000mL于微量熒光比色皿中，以激發波長^0-480nm激發，測量其在發射波長350-700nm處的熒光強度；(5)加入不同濃度的待測病毒于前述的溶液C中，以相同的激發波長激發，測量其在同一發射波長處的熒光強度；(6)將量子點的熒光強度回升值對應于病毒濃度作圖，得到定量檢測病毒的工作曲線； 或將比色皿放置于紫外分析儀中，用紫外燈激發樣品溶液，觀察到不同顏色，并用數碼相機拍照，通過顏色變化對病毒進行半定量檢測。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述量子點為CdSe、CdTe,CdSe/ZnS, CdTe/ZnS、CdTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CdSe:Mn2+、CdTe :Mn2+、CdSe: Zn2+ 或 CdTe: Zn2+。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述金屬配合物為錸(I)配合物、釕 (II )配合物或銥(III)配合物。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中金屬配合物與抗體按照摩爾比30:1偶聯。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述病毒為人體腸道病毒EV71、SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血熱病毒、乙肝病毒或柯薩奇B3病毒。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述量子點為CdTe:Zn2+量子點。
全文摘要
本發明涉及生物、醫學、材料、化學、病毒學等學科的交叉學科領域，具體公開了一種基于量子點和金屬配合物的均相免疫熒光檢測病毒的方法。其步驟是首先將量子點溶解于水或其他溶劑中，得反應液A；其次是將病毒的單克隆抗體與金屬配合物偶聯，將偶聯物溶于水或其他溶劑，得反應液B；第三是取反應液A、反應液B及水或其他溶劑混合，得混合溶液C；第四是在混合溶液C中加入病毒溶液，并將其轉移至熒光比色皿中，測量其熒光強度，進行定量分析；或將比色皿放置于紫外分析儀中，用數碼相機拍照，通過顏色變化進行病毒檢測。本方法簡便快速、靈敏度高、特異性強、成本低、可實現高通量檢測和遠程診斷。
文檔編號G01N33/577GK102279267SQ201110171398
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月23日 優先權日2011年6月23日
發明者何治柯, 陳璐 申請人:武漢大學