專利名稱：一種檢測單胺氧化酶含量的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢驗測定技術領域，具體的說是涉及一種檢測單胺氧化酶含量的方法和試劑盒。
背景技術：
單胺氧化酶(monoamine oxidase, ΜΑΟ)為催化單胺氧化脫氨反應的酶。也稱為含黃素胺氧化酶，可使兒茶胺類神經遞質失活的酶，可用作抗抑郁癥藥物。血清單胺氧化酶的活性高低能反映肝纖維化的程度，是診斷肝硬化的重要指標。肝硬化患者血清單胺氧化酶活性升高的陽性率在80%以上，最高值可超過對照參考值的兩倍，而且血清單胺氧化酶活性升高與肝表面結節形成的進程相平行。各型肝炎急性期患者血清單胺氧化酶活性不增高，但暴發性重癥肝炎或急性肝炎中有肝壞死時，由于線粒體破壞，血清單胺氧化酶活性可升高。單胺氧化酶活性升高還可見于甲亢、糖尿病合并脂肪肝、充血性心衰、肢端肥大癥等疾病。目前，血清單胺氧化酶的測定方法有很多，包括熒光法、免疫抑制法和化學光度法。熒光測定法是以色胺作為底物，經MAO催化脫氨生成吲哚乙酸，后者經醛脫氫酶作用生產吲哚乙醛，并使其輔酶NAD+還原為NADH，用280nm的激發波長于370nm處測定熒光度。 免疫抑制法是用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，向包被抗MAO抗體的微孔中依次加入樣品或標準品、生物素化的抗MAO抗體、HRP標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物TMB 顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成黃色。顏色的深淺和樣品中的MAO呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度，計算樣品濃度。化學光度法是以無色芐胺為底物，經MAO氧化生成芐醛，再與2，4- 二硝基苯胼生成醛苯腙，后者在堿性環境下呈棕紅色，且顏色的深淺和樣品中的MAO呈正相關。然而，上述方法操作步驟繁瑣、檢測儀器和試劑昂貴，不適合作為常規生化檢驗項目在臨床上應用。隨著各種半、全自動生化分析儀的普遍應用，近年來研制出酶比色法測定單胺氧化酶，它的反應原理為胺類化合物+水+氧單絲化豸_相應醛類產物+氨+過氧化氫過氧化氫+二氧化碳+乙酸磷酸丙嗣酸氧化酶,磷酸根+丙酉同酸+氧+水
WX)8]丙酮酸+還原型輔酵+曱胺N-甲基丙氣酸脫氣酵,N-曱基丙氨酸+水+輔酵 然后，在340nm波長下測定還原型輔酶NADH吸光度每分鐘的下降速度，計算出單胺氧化酶的濃度。這種測定單胺氧化酶的方法廣泛適用于各種半、全自動生化分析儀的普遍應用被廣泛應用。然而上述測定方法需經過氧化氫路線測定丙酮酸的濃度，過氧化氫穩定性差，致使檢測結果準確性降低
發明內容
有鑒于此，本發明目的是提供一種準確性高的檢測單胺氧化酶含量的方法和試劑
品.O為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案一種檢測單胺氧化酶的方法，為在pH8. 8 9. 0緩沖液中，胺類化合物在待測樣品中的單胺氧化酶的作用下發生氧化反應生成氨，生成的氨在谷氨酸脫氫酶作用下與α-酮戊二酸反應消耗還原型輔酶；在340nm波長下檢測并記錄反應液中還原型輔酶吸光度變化速率，計算待測樣品中單胺氧化酶的含量。本發明所述檢測方法胺類化合物在待測樣品中的單胺氧化酶的作用下發生氧化反應生成氨，生成的氨在谷氨酸脫氫酶作用下與α “酮戊二酸反應消耗還原型輔酶，生成谷氨酸和氧化型輔酶。反應式為
權利要求
1.一種檢測單胺氧化酶含量的方法，其特征在于，在pH8. 8 9. 0的緩沖液中，胺類化合物在待測樣品中的單胺氧化酶的作用下發生氧化反應生成氨，生成的氨在谷氨酸脫氫酶作用下與α -酮戊二酸反應消耗還原型輔酶；在340nm波長下檢測并記錄反應液中還原型輔酶吸光度變化速率，計算待測樣品中單胺氧化酶的含量。
2.根據權利要求1所述檢測方法，其特征在于，還包括過量的乳酸脫氫酶與待測樣品混合，催化內源性丙酮酸發生還原反應。
3.根據權利要求2所述檢測方法，其特征在于，所述乳酸脫氫酶的濃度為3000 5000U/L。
4.根據權利要求1或2所述檢測方法，其特征在于，所述胺類化合物的濃度為15 20mmol/L。
5.根據權利要求1或2所述檢測方法，其特征在于，所述谷氨酸脫氫酶的濃度為 1500 3000U/L。
6.根據權利要求1或2所述檢測方法，其特征在于，所述胺類化合物與α-酮戊二酸的摩爾比為1 1. 0 1 1. 2。
7.根據權利要求1或2所述檢測方法，其特征在于，所述緩沖液為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液。
8.根據權利要求1或2所述檢測方法，其特征在于，所述胺類化合物為芐胺、組胺、丁胺基、戊基胺或β-苯乙基胺。
9.一種檢測單胺氧化酶含量的試劑盒，其特征在于，包括80 200mmOl/LpH8. 8 9. 0 的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、15 20mmol/L胺類化合物、1. 0 1. 5mmol/L還原型輔酶、10 20mmol/L α -酮戊二酸和1500 3000U/L谷氨酸脫氫酶。
10.根據權利要求9所述試劑盒，其特征在于，還包括3000 5000U/L乳酸脫氫酶。
全文摘要
本發明涉及醫學檢驗測定技術領域，公開了一種檢測單胺氧化酶的方法和試劑盒。本發明提供的檢測單胺氧化酶的方法不經過氧化氫路線，利用谷氨酸脫氫酶作用測定與氨反應的還原型輔酶的下降速度計算單胺氧化酶的含量，提高檢測結果的準確性。本發明所述檢測方法還包括過量的乳酸脫氫酶與待測樣品混合，在反應延遲期消除樣品內源性丙酮酸，使還原型輔酶達到一個平衡，提高了單胺氧化酶檢測的準確性。本發明所述試劑盒穩定性好，保存期長，應用本發明所述試劑盒檢測結果準確性高、精密度好、線性范圍寬。本發明所述試劑盒適用范圍廣，便于推廣使用，可應用于各級醫院、衛生預防部門和醫學生物科研單位測定血清中單胺氧化酶含量。
文檔編號G01N21/33GK102262066SQ201110162610
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月16日 優先權日2011年6月16日
發明者董理 申請人:董理