專利名稱：檢測血清中過敏原特異性抗體的方法
技術領域：
本發明涉及診斷技術領域，尤其涉及一種檢測血清中過敏原特異性抗體的方法。
背景技術：
過敏性疾病的發病在現代社會中呈逐年上升的趨勢，我國大約有5_10%、美國和歐洲等發達國家大約有5-25%的人受過敏性疾病的困擾。過敏反應又稱變態反應，是人類常見的免疫性疾病。但其會引起一系列的臨床反應，涉及到胃腸道、皮膚、呼吸道甚至更危險的其它反應，故應該引起足夠的重視。誘發過敏反應的抗原稱為過敏原，引起過敏反應的抗原物質常見的有2000多種，醫學文獻記載接近2萬種。過敏原可根據其引起過敏的方式分為3類(1)食物過敏，由食用某些食物引起的，如牛奶、蛋類、魚蝦等；(2)吸入性過敏， 由鼻腔等吸入某些物質引起的，如花粉、塵螨等；(3)接觸性過敏，由于身體接觸到某些物質引起的，如化妝品、橡膠制品等。免疫介導的過敏反應有兩種類型IgE介導的過敏反應和非IgE介導的過敏反應。IgE介導的過敏反應是引起過敏的主要效應。目前，IgE介導的過敏反應的過敏原的檢測在臨床上已有多種檢測方法。可分為體內檢測方法和體外檢測方法。體內檢測包括雙盲對照食物激發實驗(DBPCFC)和皮膚點刺試驗(SPT)。體內試驗雖然簡單、快速，但對試驗者造成創傷和極大痛苦，且受多因素影響。相對于體內實驗，體外實驗更加安全，體外檢測方法主要包括對血清IgE的檢測和組織胺釋放試驗等。過敏原與IgE，尤其是特異性IgE(SlgE)的結合是過敏原致敏的中心環節， 因此提高過敏原特異性IgE檢測的準確性和靈敏度對過敏原的評價和臨床過敏癥的診斷具有重要意義。IgE介導的過敏反應的致敏過敏原檢測方法有多種，如放射過敏原吸附試驗 (RAST)、酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫印跡等。針對酶免疫分析已經有多種檢測產品，如測定帽(CAP)過敏原檢測系統、德國MEDIWISS公司生產的AllergyScreen系統及美國ASI 公司生產的過敏反應體外檢測系統等，但這些方法的儀器試劑都很昂貴，不適于普及應用。納米超順磁性微球是利用納米技術制備出來的一種內含磁性材料納米粒子的高分子微球。在外部磁場作用下，納米超順磁性能迅速從所在的溶液介質中定向移至磁場作用區，撤去外部磁場，納米超順磁性微球又可重懸浮于溶液介質中。同時磁性微球表面通過化學反應形成多種活性功能集團，如-OH，-COOH，-CHO，-NH2等，從而可以共價方式結合具有生物活性的物質，如蛋白，核酸等生物載體。再有納米級尺度使微球比表面積激增，微球官能團密度及選擇性吸收能力變大，達到吸附膨脹的時間縮短，粒子的穩定性大大提高。基于超順磁性微球的這些特點，其逐漸在生物學、生物技術和生物醫學領域得到廣泛應用，主要應用于分離濃縮等試驗。利用磁性微球比表面積大，易分離，表面可功能化等優點將其用于免疫測定，由于磁性微球代替了其它固相載體而用于免疫分離，與傳統方法相比，該方法具有特異性好，靈敏度高，準確性好的特點。
發明內容
本發明提供了一種檢測血清中螨蟲過敏原特異性抗體的方法，解決了傳統方法靈敏度和準確性不高的問題。一種檢測血清中螨蟲過敏原特異性抗體的方法，包括將抗人IgE抗體與表面羧基修飾的磁性微球偶聯，制得免疫磁性微球；將免疫磁性微球與待測血清混合孵育，使免疫磁性微球與待測血清中的IgE結合；磁分離得到免疫磁性微球-IgE結合物，將沉淀溶于緩沖液，加入到包被有過敏原的酶標板孔內，經孵育、洗板后采用酶聯免疫吸附法進行檢測。所述磁性微球的制備方法如下將FeCl3. 6H20、檸檬酸和尿素溶于乙二醇中，在180 220°C下加熱4 8小時，分離沉淀，洗滌，即制得磁性微球。所述免疫磁性微球與待測血清的重量體積比為10 μ g 10 μ L lmL。所述的磁性微球與抗人IgE抗體偶聯前經交聯劑活化，所述活化所用試劑為 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)溶液。優選的，每毫克磁性微球偶聯的抗人IgE抗體的質量為10 100 μ g。所述的包被有過敏原的酶標板中的過敏原可以是各種能引起人類過敏的蛋白。本發明方法通過磁性微球偶聯抗人IgE抗體，制得的免疫磁性微球與待測血清混合孵育，與血清中所有IgE結合，接著在外界磁場的作用下分離免疫磁性微球-IgE結合物， 結合包被有過敏原的酶標板，利用酶聯免疫吸附法進行檢測，判定血清當中是否含有與相應過敏原結合的特異性IgE。本發明通過免疫磁性微球將所有IgE從血清中分離出來，去除了雜質，提高了酶聯免疫吸附檢測的靈敏度、特異性和準確性。
圖1為實施例1羧基修飾的Fe3O4磁性微球的掃描電鏡圖；圖2為實施例3本發明方法與傳統方法檢測螨蟲特異性抗體的結果示意圖；圖3為實施例4酶聯免疫吸附檢測所得OD值隨血清稀釋倍數變化關系圖；圖4為實施例5酶聯免疫吸附檢測所得OD值與血清中IgE含量關系圖。
具體實施例方式實施例1將5mmol FeCl3. 6H20、3mmol檸檬酸和20mmol尿素溶于20mL乙二醇溶劑中，混合溶液置于30mL水熱釜中，在200°C下加熱6小時，所得黑色沉淀分別用乙醇和去離子水洗滌 3次，溶于去離子水中并加入0.02% (w/v)的疊氮化鈉長期保存，制得如圖1所示粒徑大小約為200nm，表面小分子羧基修飾的親水性單分散Fe3O4磁性微球。實施例2偶聯羊抗人IgE抗體，制備免疫磁性微球。(1)使用 25mM MES (pH = 6)為緩沖液，取 9 μ L、15 μ L、30 μ L、90 μ L 磁性微球(濃度為10mg/mL)，清洗兩次，旋轉混合IOmin ；(2)使用新鮮配制的EDC和NHS溶液為交聯劑，EDC和NHS 的濃度為50mg/mL，溶劑為25mM MES (pH = 6)，向清洗后的磁性微球各加入交聯劑，每mg磁性微球各加入20 μ L交聯劑，室溫下傾斜旋轉孵育30min，活化磁性微球；(3)活化后的磁性微球用MES緩沖液清洗兩次，加入24 μ L羊抗人IgE抗體 (2. 5mg/mL)，繼續加入6 μ LMES，漩渦混合，室溫下旋轉溫育l_2h ；(4)孵育后，磁分離，移除上清于一新管中(留作測偶聯率)；偶聯率(％)=(偶聯前的單抗濃度-偶聯后的上清濃度)X100/偶聯前的單抗濃度；(5)清洗偶聯抗體后的磁性微球，用0. 05M Tris. HCl (pH = 7. 4)阻斷未反應的磁性微球表面的羧基，室溫下旋轉溫育15min，PBST緩沖液清洗4次，此緩沖液為含0. 5% (w/ ν) Tween-20 的 PBS (pH =7.4);(6) 10%牛血清白蛋白(BSA)溶液室溫下震蕩封閉24h。按照上述方法，磁性微球偶聯抗體后上清的抗體含量極低，偶聯率均接近100% (表1)，說明由水熱法制備的200nm 磁性微球的羧基含量較高；當磁性微球用量已經很低時，仍可偶聯較高濃度的抗體。表 1
磁性微球與抗體
的質量比例_吸光值A_蛋白質濃度_偶聯率
15:1 0.003 4.72pg/ml 99.80% 5:1 0.005 7.42pg/ml 99.70% 2.5:1 0.007 10.13pg/ml 99.60% _\_5Λ_0.006_8.78pg/ml_99.60%實施例3用實施例2制備的200nm免疫磁性微球(15 1)捕獲血清樣品中的特異性IgE 抗體，分析利用免疫磁性微球的方法對螨蟲特異性SlgE的檢測效果。具體操作如下根據需求量取免疫磁性微球于干凈的離心管中，按照體積比1 10的比例(IOyL 免疫磁性微球加100 μ L活化緩沖液)加入緩沖液，混勻。磁分離，移除緩沖液。如此再次清洗一次，然后加活化緩沖液定容至原需求量。將待測的含有螨蟲特異性IgE (SlgE)的血清樣品，分別稀釋1倍、3倍、5倍、10倍、 100倍、1000倍，備用。在離心管中各加入2μ L活化后的免疫磁性微球(濃度為5mg/mL)， 再加入100 μ L上述待測血清樣品，混勻，于室溫下旋轉孵育15-20min。孵育后，磁分離，移除上清；加入PBS緩沖溶液至100 μ L，混勻得免疫磁性微球IgE樣品。然后使用杭州浙大迪訊生物基因工程有限公司的產品(產品標準編號(YZB/國 1736-2009))，參照其過敏原特異性抗體IgE檢測試劑盒說明書進行酶聯免疫法檢測OD值， 具體操作步驟如下(1)在特異性過敏原孔中加入100 μ L上述溫育混勻后的免疫磁性微球IgE樣品， 輕輕混勻，37 °C孵育45min ；(2)洗板倒盡板內液體，每孔加入250 μ L稀洗滌液洗滌酶標板，然后倒盡液體， 再加入250 μ L稀洗滌液，倒盡液體，如此反復洗滌5次，最后將酶標板翻扣在厚疊吸水紙上拍干；(3)每孔分別加入100 μ L已經配制好的HR酶聯二抗溶液，37°C溫育反應45min ；(4)洗板如步驟⑵操作；(5)每孔加入100 μ L TMB底物顯色液，室溫避光靜置反應15-20min ；
(6)每孔分別加入100 μ L終止反應液；(7)使用標準酶標儀在450nm波長下測出每孔的吸光度值(0D值)。按照上述操作方法，每一試驗結果都來自3個重復的平均值。以酶聯免疫法直接對血清樣品進行檢測的OD值作為對照，用200nm免疫磁性微球檢測了對螨蟲過敏的不同濃度待測血清樣品。結果表明(圖2)，免疫磁性微球檢測的OD值均高于常規方法直接檢測的 OD值，其中以稀釋5倍時最高，此時的slgE濃度約為0. 5IU/mL。實施例4免疫磁性微球捕獲血清樣品中的特異性IgE抗體，將待測血清樣品分別稀釋至原體積的1倍、2倍、3倍、5倍和10倍，通過檢測免疫磁性微球與待測血清樣品混合時，可以有效捕獲的血清樣品中IgE抗體的最大反應體積，分析免疫磁性 微球捕獲法的檢測靈敏度。 具體操作如下活化免疫磁性微球根據需求量，取上述實施例2制備的200nm免疫磁性微球 (15 1)于干凈的離心管中，按照體積比1 10的比例(10 μ L免疫磁性微球加100 μ L活化緩沖液)加入含0.1% BSA的PBS活化緩沖液，混勻。磁分離，移除緩沖液。如此再次清洗一次，然后加活化緩沖液定容至原需求量。樣品的孵育在離心管中各加入100 μ L含有戶塵螨特異性IgE(SlgE)的待測血清樣品，再分別稀釋至原體積的1倍、2倍、3倍、5倍、10倍。分別取2 μ L上述活化后的免疫磁性微球(濃度為5mg/mL)到離心管中，輕輕混勻，室溫下旋轉孵育15-20min ；孵育結束后，磁分離，移除上清；加入IOOyL PBS緩沖液，混勻。然后用酶聯免疫法檢測OD值，具體操作步驟同實施例3。按照上述操作方法，每一試驗結果都來自3個重復的平均值。結果表明(圖3)，在 IgE總量一定的情況下，待測樣品的體積擴大至常規檢測方法的3倍時，檢測靈敏度不受影響；隨著體積的進一步擴大，檢測值有所下降，擴大為10倍時，趨近于常規方法的檢測值。實施例5(1)免疫磁性微球的清洗活化根據需求量，取上述實施例2制備的免疫磁性微球 (15 1)于干凈的離心管中，按照體積比1 10的比例加入含0.1% BSA的PBS活化緩沖液，混勻。磁分離，移除緩沖液。如此再次清洗一次，然后加上述活化緩沖液定容至原需求量。(2)樣品孵育根據國際分級標準，標準血清樣品稀釋濃度為0. 35IU/mL、0. 7IU/ mL、3. 5IU/mL、17. 5IU/mL、50IU/mL、100IU/mL。分別取2 μ L活化后的免疫磁性微球加到酶標板的各孔中，再各加入將上述濃度梯度稀釋10倍的標準血清樣品，終體積為100 μ L，輕輕混勻；室溫下振蕩孵育15-20min。(3)洗板磁分離，移除上清，每孔加入200 μ L PBST緩沖液洗滌酶標板，磁分離后，移除上清，如此反復洗滌3次，最后將洗滌液完全移除干凈。(4)每孔分別加入100 μ L已經配制好的HRP酶聯二抗，吸打或者輕輕搖晃，與免疫磁性微球混勻，37 °C溫育45min。(5)洗板如步驟(2)操作。(6)每孔加入100 μ L TMB底物顯色液，吸打或者輕輕搖晃，與免疫磁性微球混勻， 室溫避光靜置反應15-20min。
(7)每孔分別加入100 μ L終止反應液。
(8)使用標準酶標儀在450nm波長下測出每孔的吸光度值(0D值)。(9)結果計算以標準溶液系列的吸光度值(0D值)對相應濃度的對數值進行線性回歸，計算出校準曲線。如圖4所示，標準曲線在IgE濃度為0. 035IU/mL 10IU/mL之間線性關系良好， R2 = 0. 9606，相關系數較好。
權利要求
1.一種檢測血清中過敏原特異性抗體的方法，包括將抗人IgE抗體與表面羧基修飾的磁性微球偶聯，制得免疫磁性微球；將免疫磁性微球與待測血清混合孵育，使免疫磁性微球與待測血清中的IgE結合；磁分離得到免疫磁性微球-IgE結合物，并分散于緩沖液中，加入到包被有過敏原的酶標板孔內，孵育、洗板后采用酶聯免疫吸附法進行檢測。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面羧基修飾的磁性微球通過如下方法制備將FeCl3. 6H20、檸檬酸和尿素溶于乙二醇中，在180 220°C下加熱4 8小時，分離沉淀，洗滌，即制得表面羧基修飾的磁性微球。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫磁性微球與待測血清的重量體積比為 10 μ g 10μ L lmL。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性微球與抗人IgE抗體偶聯前經交聯劑活化。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述交聯劑為1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺溶液。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，每毫克磁性微球偶聯的抗人IgE抗體的質量為10 100 μ go
全文摘要
本發明公開了一種檢測血清中過敏原特異性抗體的方法，包括將抗人IgE抗體與表面羧基修飾的磁性微球偶聯，制得免疫磁性微球；將免疫磁性微球與待測血清混合孵育，使免疫磁性微球與待測血清中的IgE結合；磁分離得到免疫磁性微球-IgE結合物，將沉淀溶于緩沖液，加入到包被有過敏原的酶標板孔內，經孵育、洗板后采用酶聯免疫吸附法進行檢測。本發明方法通過磁性微球偶聯抗人IgE抗體，制得的免疫磁性微球與待測血清混合孵育，與血清中所有IgE結合，富集并分離IgE，接著利用酶聯免疫吸附法進行檢測，判定血清當中是否含有與過敏原結合的特異性IgE。本發明通過免疫磁性微球將所有IgE從血清中分離出來，去除了雜質，提高了酶聯免疫吸附檢測的靈敏度、特異性和準確性。
文檔編號G01N33/68GK102253199SQ201110158650
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月14日 優先權日2011年6月14日
發明者吳善東, 樓兵干, 趙鋮鋮, 高其康 申請人:浙江大學